エンドサイトーシス

Oct 21, 2023

Nature Communications volume 13、記事番号: 5524 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

細菌における遺伝子の水平伝達は、接合、形質導入、形質転換を介して起こると広く考えられています。 これらのメカニズムは、高度な機械を使用して保護細胞壁を通過する DNA の通過を促進します。 今回我々は、細胞壁欠損細菌がエンドサイトーシスのようなプロセスを介してDNAやその他の細胞外物質を飲み込む可能性があることを報告する。 具体的には、糸状放線菌キタサトスポラ・ビリディファシエンスのL型がプラスミドDNA、多糖類（デキストラン）、および150nmの脂質ナノ粒子を取り込むことができることを示します。 このプロセスには細胞質膜の陥入が含まれ、細胞外物質をカプセル化する細胞内小胞の形成につながります。 DNA の取り込みは、他の種の自然形質転換に必要な comEC および comEA に相同な遺伝子の欠失による影響を受けません。 ただし、取り込みはアジ化ナトリウムまたは 4 °C でのインキュベーションによって阻害され、このプロセスがエネルギーに依存していることが示唆されます。 カプセル化された物質は、小胞膜の分解時に細胞質に放出されます。 細胞壁欠損細菌が初期生命体のモデルと考えられていることを考えると、我々の研究は、細菌の細胞壁が発明される前に始原細胞が食物や遺伝物質を獲得するメカニズムの可能性を明らかにしている。

細菌は常に変化する環境条件にさらされており、その保護のために細胞エンベロープに依存しています。 細胞エンベロープは細胞膜と細胞壁で構成され、内部環境と外部環境を隔てています。 細胞膜は、細胞質を包み込み、選択的障壁として機能するリン脂質二重層です。 細胞壁は、グラム陽性菌の場合は厚いペプチドグリカン (PG) 層、グラム陰性菌の場合は外膜に囲まれた薄い PG 層で構成されます。 ペプチドグリカン層は重要なメッシュ状構造であり、機械的ストレスや膨圧に対する保護を提供するだけでなく、細胞の形状と剛性も定義します。

細胞エンベロープを通過する高分子の選択的な通過を促進するために、細菌は特殊かつ洗練された輸送システムを進化させてきました1。 たとえば、自然に形質転換可能な細菌は、IV 型線毛または II 型分泌系に類似した成分を含むタンパク質複合体に依存して DNA を取り込みます。 細胞壁を越える DNA の能動輸送は、DNA に結合する線毛構造の収縮によって促進されます 2,3。 次に、DNA 結合タンパク質と細孔形成タンパク質を使用して、細胞膜を越えて DNA を移動させます。

細胞壁はほとんどの細菌にとって不可欠な構造ですが、一部の細菌はもともと細胞壁を持たなかったり、特定の条件下で細胞壁を脱落したりすることがあります。 例としては、ヒトの粘膜表面や植物の師部篩管などの特定の浸透圧保護環境に寄生し生息するモリクテス目の仲間が挙げられます。 細胞壁を標的とする薬剤などの環境ストレス要因に長期間さらされると、細胞壁を持たずに増殖できる細胞、いわゆる L 型が生成されます。 L 型の複製は標準的な FtsZ ベースの分裂機構とは独立しており 5、自発的な水泡形成、作表、および小胞形成を引き起こす膜合成の上方制御によって引き起こされる細胞の表面積と体積の比率の不均衡によって引き起こされます 6,7。 これらの原始的な細胞のような特徴により、L 型は初期生命の進化を研究するための魅力的なモデル系になります 8,9。

菌糸体を形成するキタサトスポラ・ビリディファシエンスなどの一部の糸状放線菌は、高浸透圧ストレス条件下で一時的に細胞壁を脱落させる能力を持っています（図1a）7。 L 型とは対照的に、S 細胞は細胞壁なしでは増殖できませんが、細胞壁を再構築した後は菌糸体の成長モードに戻ることができます。 一時的な細胞壁欠損細胞は、例えばペプチドグリカンを分解するリゾチームの作用による細胞壁の酵素的除去を介して、壁のある細菌から人工的に生成することもできる。 これにより、プロトプラストまたはスフェロプラストが形成されます。これらは遺伝子工学の目的で広く使用されており、多くの場合、細胞への DNA の侵入を可能にするポリエチレングリコール (PEG) の使用が伴います 10。 この PEG に基づく形質転換は、糸状放線菌の形質転換に広く使用されている技術ですが、K. viridifaciens 壁細胞、またはその天然の細胞壁欠損細胞が、PEG を使用せずに自然な遺伝的形質転換が可能であるかどうかは、明確に示されたことはありません。 細胞壁の欠如が環境からの DNA などの高分子の自然な取り込みにどのような影響を与えるかは不明です。

K. viridifaciens の細胞壁欠損細胞の生成の概略図。 一時的な壁欠損細胞には、リゾチームの作用によって菌糸細胞から得られるプロトプラストや、高い浸透圧の培地中で菌糸先端から押し出される S 細胞が含まれます。 永久壁欠損型 L 型は、高浸透圧下で菌糸体を長時間インキュベートした後 (ライン M1)、必要に応じてリゾチーム (Lys) およびペニシリン G (PenG) を補充した後に生成されます (ライン アルファおよびデルタ)。 b 菌糸体（n = 3）、プロトプラスト（2 つの実験から n = 5）、S 細胞（2 つの実験から n = 7）および L 型株アルファ（4 日齢および 6 日齢の細胞の両方で n = 3） )、デルタ (3 日齢細胞と 7 日齢細胞の両方で n = 2)、および M1 (3 日齢細胞の n = 1) をプラスミド DNA (pRed*) とともに 18 ～ 24 時間インキュベートし、選択培地に加え、30 °C でインキュベートして形質転換細胞を選択します。 L 型のコロニー形態の拡大図が表示されます。 スケールバーは 1 mm を示します。 L 型のみが一貫した DNA 取り込みを示すことに注意してください。 c プラスミド DNA (pRed*) を使用した K. ビリディファシエンス菌糸体、プロトプラスト、S 細胞、および L 型のポリエチレン グリコール (PEG) ベースの形質転換効率 (形質転換コロニーのパーセンテージで表す)。 S 細胞を除く n = 3 の生物学的複製 (n = 4)。 d pFL-ssgBと24時間インキュベートした後の7日齢のαおよびαΔcomEA/ECの形質転換効率。 CFU = コロニー形成単位。 ns = 有意ではない (n = 5 生物学的反復、両側独立 t 検定、t(8)=1.572、P = 0.155)。 e pFL-ssgBと24時間インキュベートした後の1、3、および7日齢のアルファの形質転換効率。 アスタリスク (**) は P ≤ 0.01 (n = 4 生物学的反復、一元配置分散分析、F (2, 9) = 12.16、Tukey 事後検定、P = 0.006 (1 ～ 3 日) および 0.005 (1 ～ 7 日) を示します)日））。 f pRed * とともに 6、24、または 48 時間インキュベートした 7 日齢アルファの形質転換効率。 アスタリスク (*) は、6 時間と 24 時間のインキュベーション間の統計的に有意な差を示します (両側クラスカル・ウォリス検定、H(2) = 8.769、P = 0.012、ボンフェローニ補正を含むダンのペアワイズ検定では、P = 0.010 が得られます) 6 時間と 24 時間、6 時間と 48 時間では P = 0.233、24 時間と 48 時間では P = 0.718)。 ns は重要ではありません。 n = 4 生物学的複製。 g 膜色素 Laurdan を使用した、生後 1、3、および 7 日後のアルファの膜流動性の測定としての一般化偏光 (GP)。 GP が低いほど、膜の流動性が高いことを示します。 n = 3 生物学的複製。 (c – g) のデータは、個々のデータポイントの平均値 ± SD として表されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

この研究では、糸状放線菌 K. viridifaciens の L 型が標準的な自然の遺伝子形質転換機構とは独立して DNA を取り込むことができることを示します。 その代わりに、内部小胞形成を引き起こす細胞膜の陥入を伴う水平遺伝子伝達機構によって取り込みが促進されます。 さらに、このメカニズムは堅牢であり、環境からの他の高分子の非特異的取り込みも可能にすることを示します。 L 型が初期の細胞生命のモデルであると考えられていることを考えると、私たちの研究は、そのような古代の細胞が複雑な輸送機構を必要とせずに環境からどのようにして大きな生体分子やナノ粒子を獲得したのかについての洞察を提供します。

K. viridifaciens の壁のある細胞と壁のない細胞が自然に遺伝子形質転換できるかどうかは不明です。 これを分析するために、壁のある菌糸体細胞、一時的な壁のない S 細胞とプロトプラスト、および永久的な壁のない L 型 (アルファ) を新たに採取し、浸透圧的に安定した LPB 培地に再懸濁しました。 続いて、細胞を抗生物質耐性カセットを含むプラスミド DNA (pRed*) とともに 18 ～ 24 時間インキュベートし、形質転換細胞を検出できるように選択培地および非選択培地にプレーティングしました。 注目すべきことに、菌糸体、プロトプラスト、S細胞とは異なり、L型は一貫してDNAを取り込むことができました（図1b）。 DNA の取り込みは 1 つの L 型細胞株に限定されず、ペニシリンとリゾチームを含む (株アルファおよびデルタ) または含まない (株 M1) LPB 培地で増殖させた K. ビリディファシエンスの壁細胞から得られた別個の L 型細胞株で観察されました 7 、11． インタクトなゲノムDNAまたは断片化したゲノムDNAを使用した場合、またはメチル化プラスミドを使用した場合、αでは形質転換体は得られませんでした（補足図1a、b）。 自然の遺伝子形質転換は L 型に限定されていましたが、壁欠損細胞はすべてポリエチレン グリコール (PEG) を使用して化学的に形質転換することができ、プロトプラスト、S 細胞、および L 型の平均形質転換効率は 1.7 ～ 2.5% でした (図.1c）。 PEGを添加すると、たとえこれが粗細胞抽出物中に存在していたとしても、ゲノムDNAによるアルファの形質転換も可能になった(補足図1c)。 一方、メチル化 DNA を使用すると化学変換が妨げられ、異なる種類の DNA を使用しても PEG に基づく変換は可能であるが、異なるメチル化パターンの存在によって制限されることが示されました。 対照的に、壁のある細胞はPEGの有無にかかわらず形質転換できませんでした（図1b、c）。 これらの結果は、これらの条件下では、壁細胞、S 細胞、およびプロトプラストとは異なり、L 型が自然に DNA を取り込むことができることを示しています。

自然に形質転換可能な細菌は、IV 型線毛または II 型分泌系と類似した特殊な DNA 転座機構を使用して、外部 DNA を取り込みます2。 この標準システムの同様の構成要素も、L 型による DNA の取り込みに関与している可能性があります。 天然形質転換細菌Bacillus subtilis str.のDNA結合タンパク質ComEAおよびチャネルタンパク質ComECを使用したBlastP検索。 K. viridifaciens に対する 168 は、それぞれ BOQ63_029625 (ヘリックス-ヘアピン-ヘリックス ドメイン含有タンパク質) と BOQ63_029630 (ComEC/Rec2 ファミリー コンピテンス タンパク質) の 2 つの重要なヒットを生成しました (補足表 1 および補足図 1d)。 B. subtilis ヘリカーゼ/DNA トランスロカーゼ ComFA は、転写共役 DNA 修復を媒介する広く保存された細菌タンパク質である推定上の Mfd コード遺伝子 (BOQ63_020315) にヒットしました 12。 枯草菌、グラム陰性淋菌 13、またはヘリコバクター ピロリの T4SS 関連 DNA 取り込みシステム 14 の細胞エンベロープを横切る DNA 輸送に関与するタンパク質と相関する他のオルソログは見つかりませんでした 14 (補足表 1)。 L 型には完全なペプチドグリカンベースの細胞壁が欠けているため、DNA は内部移行のために細胞膜を通過する必要があります。 自然に形質転換可能な細菌では、ComEA と ComEC は細胞膜を通過する DNA 輸送において機能します 13、15、16。 K. viridifaciens における推定上の comEC および comEA 遺伝子の役割は不明ですが、その壁細胞では DNA の取り込みが見られなかったため、これらのタンパク質が L 型の DNA 取り込みに関与しているのではないかと考えられました。 したがって、L型株アルファの推定上のcomECおよびcomEA遺伝子をアプラマイシン耐性カセットに置き換えました（補足図1d、e）。 驚くべきことに、comEA 遺伝子と comEC 遺伝子の同時欠失は形質転換効率に影響を与えず (両側独立 t 検定、t(8) = 1.572、P = 0.155)、L 型による DNA の取り込みが遺伝子とは独立して起こることを示しています。この標準的な DNA 転座機構と相同です (図 1d)。

Blokesch (2016) によって概説されているように、自然の形質転換のために DNA を取り込む能力は、自然に形質転換可能な細菌間で異なって調節されており、構成的に活性であることもあれば、特定の増殖期に限定されることもあります 17。 B. subtilis における DNA 取り込み能力の発達を制御する要因の 1 つは成長期です 18,19。 培養年齢も L 型の DNA 取り込み能力に影響を与えるかどうかを研究するために、異なる年齢の培養物からの細胞を形質転換アッセイに供しました。 アルファの 1 日目の培養物からの細胞は、3 日後または 7 日後の培養物からの細胞よりも容易に DNA を取り込みます (一元配置 ANOVA、F (2,9) = 12.16、Tukey 事後検定、P = 0.006、およびそれぞれ0.005）（図1e）。 インキュベーション時間が短いか長いかが DNA 取り込みに影響するかどうかをテストするために、DNA と 6 時間、24 時間、および 48 時間インキュベートした後、7 日齢のアルファの形質転換効率を測定しました (図 1f)。 形質転換は 6 時間のインキュベーション後に検出され、24 時間後に増加しました (両側クラスカル・ワリス検定、H(2) = 8.769、P = 0.012、およびボンフェローニ補正を使用したダンのペアワイズ検定では 6 時間および 24 時間で P = 0.010、P 6 時間と 48 時間では = 0.233、24 時間と 48 時間では P = 0.718)。 細胞増殖中に生じる膜特性の違いが、DNA 取り込み能力に影響を与える可能性は考えられません。 膜流動性は脂質二重層の平均粘度の尺度であり、膜内のタンパク質と脂質の位置と移動に影響を与える可能性があります20。 より高い膜流動性は、脂肪酸障害の増加、脂質充填の低下、および拡散速度の増加によって特徴付けられ、これが膜透過性の増加につながる可能性があります 21,22。 異なる熟成培養物の膜流動性の分析により、一般化分極（GP、より低いGPはより高い流動性を示す）から推定されるように、DNA取り込み能力の増加が膜の流動性と正の相関がある可能性があることが示されました23（図1g）。ただし、統計的に有意な差は観察されませんでした（Welch 一元配置分散分析、F(2, 2.798) = 13.226、P = 0.038、Games-Howell 事後検定あり: 1 ～ 3 日 P = 0.068; 1 ～ 7 日 P = 0.134 ; 3～7 日 P = 0.711、n = 3)。 一時的に壁を欠損したプロトプラストや S 細胞が DNA を自然に取り込むことができない理由は、流動性が比較的低いことによって説明される可能性があります。 ただし、プロトプラストの流動性は、プレートアッセイを使用して測定した場合、1〜7日後の培養物の範囲内でした（補足図2a）。 その後の蛍光顕微鏡イメージングによる GP の分析では、プロトプラストと S 細胞の膜の流動性が低い傾向があるものの、これらの値は 1 ～ 7 日齢の L 型の膜流動性の範囲内に留まっていることが示されました（補足図）。 2b)。 したがって、膜の流動性は効率的な DNA 取り込みに寄与している可能性がありますが、このプロセスを説明するには十分ではありません。

L 型による DNA 取り込みを促進するメカニズムをさらに調査するために、細胞質 eGFP を発現する L 型に Cy5 標識プラスミド DNA を添加しました。 3日間のインキュベーション後、標識されたプラスミドDNAがL型細胞膜の外側、または明らかな内部小胞内に見つかりました（図2a、補足ムービー1、およびコントロール補足図3a）。 これらの内部小胞には eGFP が欠けていたため、細胞外物質が小胞内に閉じ込められる膜の陥入プロセスによってそれらが生じた可能性があると考えられました。 これを直接テストするために、eGFP 発現 L 型を蛍光色素 SynapseRed C2M (SynapseRed) とインキュベートしました。 SynapseRed (FM5-95 に相当) などのスチリル色素が細胞膜を通って拡散できないことを考えると 24,25、内部小胞を囲む膜上の蛍光シグナルは、そのような小胞が細胞膜に由来するという強力な議論となるでしょう。 実際、SynapseRed は、一晩インキュベートした後、L 型の細胞膜だけでなく内部小胞の膜も染色することがわかりました (図 2b)。 SYTO 9 での染色により、染色体 DNA が細胞質には存在するが、内部小胞内には存在しないことがさらに示されました (図 2c)。 細胞質eGFPを産生するプロトプラストをSynapseRedとインキュベートすると、細胞質eGFP蛍光が少ない領域は、内部小胞の形成ではなく内部膜構造の存在によって引き起こされることが示されました（図2d）。 S 細胞の同様のインキュベーションにより、細胞質 eGFP を欠いた内部小胞様構造の存在が示されました。 しかし、L型とは異なり、細胞質mCherryを産生するS細胞をその後SYTO 9で染色すると、これらの暗い領域が染色体DNAで満たされていることが示された。 SynapseRed は膜不透過性色素であるため、S 細胞の膜構造の染色は、細胞膜の陥入による染色ではなく、増強された膜透過性を反映している可能性があります。 細胞膜を横切る色素の拡散をテストするために、L 型細胞と S 細胞を SynapseRed とともに 30 °C および 4 °C でインキュベートし、それぞれ膜陥入の可能性を可能および防止しました。 S細胞では内膜が30℃と4℃の両方で染色されましたが、これはL型では30℃でのみ観察されました（補足図3b）。 これは、染色が細胞膜の陥入の結果であるL型とは対照的に、SynapseRedによるS細胞の膜の染色は色素の細胞膜の透過性によるものであることを示唆しています。

Cy5 標識プラスミド DNA (pFL-ssgB; マゼンタ) と 3 日間インキュベートしたα pIJ82-GFP (細胞質 eGFP; 緑色) の代表的な蛍光顕微鏡写真 (1 回の実験からの n = 3 の観察)。 BF明視野。 補足ムービー 1 も参照してください。 b 膜不透過性色素 SynapseRed C2M (SynapseRed; マゼンタ) と一晩インキュベートした後のアルファ pIJ82-GFP のインキュベーション。1 つの L 型細胞の異なる高さで 2 つの Z スライスを示します。 1 回の実験からの 6 つの観察結果の代表的な顕微鏡写真を示します。 c 染色体DNAを示すためにSYTO 9（緑色）で染色したアルファ（1回のインキュベーションでn = 7の観察）およびアルファpRed*（1回のインキュベーションでn = 9の観察）の代表的な顕微鏡写真。 α は SynapseRed C2M (SynapseRed; マゼンタ) で染色して細胞膜を視覚化しますが、α pRed* (マゼンタ) の細胞質 mCherry (の不在) は内部小胞の存在を示します。 蛍光色素を添加した直後に細胞を画像化しました。 d SynapseRed（SR）と72時間インキュベートした細胞質eGFPを産生するK. viridifaciens pIJ82-GFPのプロトプラストとS細胞の代表的な画像（上の行、S細胞とプロトプラストを用いた2つの独立した実験からの少なくとも6つの観察）、およびS - SynapseRed および SYTO 9 と 72 時間インキュベートした細胞質 mCherry を産生する K. viridifaciens pRed* の細胞 (下段、1 つの実験からの 3 つの観察)。 内部膜構造および/または DNA の存在により、細胞質の蛍光発光が減少する可能性があることに注意してください。 e 3 kDa デキストラン-テキサレッド（D-TR;マゼンタ）とインキュベートしたアルファ産生DivIVA-eGFP（アルファpKR2）（緑）の950分間のタイムラプスイメージング実験の静止画（n = 1）。 矢印は、DivIVA-eGFP の局在を示します。 補足ムービー2も参照してください。 f D-TR（マゼンタ）と一晩インキュベートした後の、α pKR2（緑色）におけるDivIVA-eGFPの焦点および環構造の形成の代表的な顕微鏡写真（1つの実験から50以上の観察）。 L 型は内部小胞の形成によって蛍光染色された DNA とデキストランを取り込むことができることに注意してください。 g pFL-ssgBを使用した7日齢のαおよびαΔdivIVAの形質転換効率。 ns は有意ではありません (両側独立 t 検定、t(8) = 0.489、P = 0.638)。 CFU コロニー形成ユニット。 データは、個々のデータ点の平均±SDとして表され、n = 5の生物学的複製。 h DivIVA を持たない L 型は、細胞質 eGFP を産生する 5 日齢の alphaΔdivIVA pIJ82-GFP で示されているように、内部小胞を産生できます (1 つの培養からの n = 2 の観察)。 スケールバーは 2 μm を示します。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

異なる細胞型における推定内部小胞構造の存在を比較するために、これらの構造を有する L 型、プロトプラスト、および S 細胞の割合を定量しました。 細胞質 mCherry を産生する細胞 (α pRed* または S 細胞および K. viridifaciens pRed* 由来のプロトプラスト) を SynapseRed と 0 日間および 3 日間インキュベートして膜を染色しました。 DNA はイメージングの前に SYTO 9 で視覚化されました。 内部小胞の存在を示す可能性がある、細胞質、DNA、および膜からの蛍光発光が欠如している領域を持つ細胞の数を定量化しました（補足表2）。 この方法を使用すると、L 型ではそのような領域が S 細胞よりも約 6 ～ 11 倍多く発生します (0 日および 3 日間のインキュベーション後、L 型: 24.5 および 14.7%、S 細胞: 2.2 および 2.6%、それぞれ）、プロトプラストでは推定小胞はほとんど観察されませんでした（<0.5%）。 S 細胞およびプロトプラストのこれらの領域が実際の内部小胞である場合、それらの存在は DNA による一貫した形質転換を検出するには十分ではない可能性があります。 総合すると、これらの結果は、観察された L 型内部の小胞が細胞膜の陥入に由来し、それによって細胞外 DNA がそのような小胞内に捕捉される可能性があることを強く示唆していますが、これは S 細胞とプロトプラストでは明らかではありません。

真核生物では、エンドサイトーシスは内部小胞形成を介して外部からの積荷の取り込みを可能にするプロセスであり、最終的には分解またはリサイクルされます 26,27。 蛍光標識されたデキストランは、細胞膜を通過できないため、真核生物におけるエンドサイトーシスのマーカーとして広く使用されています 28,29。 このようなエンドサイトーシスのようなプロセスが L 型に存在するかどうかを確認し、外部物質の取り込みを視覚化するために、細胞をデキストラン テキサスレッド (D-TR) とインキュベートし、タイムラプス イメージングを実行しました。 使用した L 型株は、負に湾曲した膜領域 (α pKR2) に対して強い親和性を有する DivIVA-eGFP も発現します 30。 このような領域は、膜の陥入時に形成されると予想される。 290分のインキュベーション後、L型内部にD-TRが見え、この領域に隣接してDivIVA-eGFPのかすかなスポットが現れ始めました（図2eおよび補足ムービー2）。 これは、陥入膜の両側に DivIVA-eGFP の 2 つの病巣を伴う細胞膜の明らかな内側への隆起と D-TR の流入に進行しました (t = 560 分)。 640 分後、D-TR を含む内部小胞が形成されました。 他の細胞では、DivIVA-eGFPはリング状構造を形成しているようであり、場合によっては陥入膜を覆っていました（図2f、セル1および2）。 陥入部位近くの DivIVA の存在は、膜内に負に湾曲した領域が存在することを意味します。 特に、divIVAの欠失（alphaΔdivIVA）は形質転換に影響を及ぼさなかったため、DivIVAは小胞形成またはDNA取り込みに必要ありません（両側独立t検定、t（8）= 0.489、P = 0.638）（図2g） ）、内部小胞はこの株によってまだ形成されていました（図2h）。 さらに、D-TRの内在化は、DivIVA-eGFPを発現しないL型でも観察され、取り込みが融合タンパク質の存在の結果ではないことを示しています（補足図3c）。 プロトプラストおよびS細胞をD-TRと最大72時間インキュベートしても、内部小胞への明確なD-TRカプセル化は生じませんでした（補足図3d）。 これを定量化するために、細胞質 eGFP を産生する細胞を D-TR または PBS とともに 72 時間インキュベートしました。 eGFPを欠いているが、この領域にD-TRを含む領域を有する細胞の割合をカウントした。 インキュベーションを繰り返すと (デュプロで)、L 型細胞の約 6% に D-TR が取り込まれましたが、PBS を含むコントロールでは取り込まれませんでした (補足表 3)。 PBS とインキュベートした対照細胞と比較した場合、D-TR とインキュベートした S 細胞およびプロトプラストでは明らかな取り込みは観察されませんでした (S 細胞: D-TR では 0.9 および 1.7%、PBS では 0 および 2.1%; プロトプラスト: 0 および 1.1 D-TR では %、PBS では 0 および 0.8%)。 まとめると、これらの結果は、L 型の細胞膜の陥入が内部小胞の形成につながる可能性があり、環境からの DNA を含む分子の取り込みを可能にするエンドサイトーシスのような機構を示している可能性があることを示しています。

脂質ナノ粒子 (LNP) は、エンドサイトーシスを介して核酸や薬物をヒト細胞に送達するために使用される非ウイルス粒子です 31。 LNP は脂質二重層構造を持たず、静電相互作用によって核酸をカプセル化し、PEG 脂質の層で囲まれた電子密度の高い疎水性脂質コアで構成されています 31。 内部移行した LNP は、エンドサイトーシス経路の膜結合細胞小器官であるエンドソームに位置します。 その後の酸性化により、LNP のイオン化脂質が正に帯電し、これにより LNP がエンドソーム膜を不安定化し、その積荷を細胞内に送達できるようになります。 LNP は、フルオロフォア結合リン脂質を組み込むことによって蛍光タグを付けることもできます。 L 型が外部の大きな粒子を取り込む能力をさらに調べるために、平均サイズ 150 nm のローダミン標識 LNP (LNP-LR、18:1 Liss Rhod PE を含む) とともに細胞をインキュベートし、検出できるようにしました。 L字型の中。 7 日齢の L 型に LNP-LR を添加すると、一晩インキュベートした後、複数の LNP 粒子によって生成されたと考えられる明確な蛍光シグナルが細胞内で検出され、細胞膜への LNP の局在も検出できました (図 1)。 3aおよび補足図4a、b）。 細胞質内で eGFP を産生する L 型を使用した場合、小胞には eGFP ではなく LNP のみが含まれており、LNP が細胞質のない小胞に取り込まれたことが強く示唆されました（図 3b、c およびイメージングコントロールの補足図 4c）。 重要なことに、呼吸鎖を標的とする代謝阻害剤アジ化ナトリウム（1、2.5、または10 mM）の添加32、または4℃での細胞のインキュベーションは、LNP-LRの局在化に影響を与えました（図3d、eおよび補足図）。 .4d–i）。 これらの条件は、エネルギー生成を抑制することによってエンドサイトーシスを阻害するために一般的に使用されます 33,34。 このような条件下では、LNP は細胞内ではなく細胞膜に局在しているように見えました。 LNP-LR の取り込みを捕捉する頻度が低すぎて正確に定量できないため、L 型による細胞外物質の取り込みに対するアジ化ナトリウムと 4 °C でのインキュベーションの阻害効果を D-TR を使用して定量しました。 驚くべきことに、2.5 mM アジ化ナトリウムの存在下で、L 型による D-TR 取り込みの有意な減少が観察されました (コントロールとアジ化ナトリウムでは、それぞれ細胞の 5.9% 対 1.9% が D-TR 取り込みを示しました (2 つの比率 z-テスト、z = 3.111、片側 P < 0.001)、および 4 °C での L 型のインキュベーションは、D-TR の取り込みを完全に阻害しました (図 3f). これらの結果は、L 型の取り込みプロセスと一致しています。エネルギーに依存しており、それにより外部物質が膜陥入プロセスによって内部に取り込まれます。

a、b アルファ (a; n = 5 観察) およびアルファ pIJ82-GFP (b; n = 2 観察) の内部小胞における LNP-LR (18:1 Liss Rhod PE を含む脂質ナノ粒子; マゼンタ) の局在の代表的な顕微鏡写真それぞれ 30 °C で一晩および 3 日間のインキュベーション実験後。 c LNP-LRとインキュベートしたアルファpIJ82-GFP（b）の対応するライン選択のグレー値（ピクセル強度）の密度プロファイルプロット。細胞質eGFP発光の減少がLNP-LR発光の増加と相関していることを示しています。 d、e 4°Cでのαとのインキュベーション中（d）、または30°Cでの2.5 mMアジ化ナトリウム（NaN3）の存在下（e）0、24、および48時間のインキュベーション後のLNP-LRの局在化。 1 mM および 10 mM アジ化ナトリウムでも同様の結果が得られました (補足図 4 を参照)。画像は 1 つの実験から得られました。 f 2.5 mM アジ化ナトリウム (NaN3) の存在下、または 4 °C でインキュベートした後、30 °C (コントロール) で 3 日間インキュベートした後、デキストラン テキサスレッド (D-TR) の取り込みを示すα pIJ82-GFP 細胞の割合。 アジ化ナトリウムでは D-TR 取り込みの有意な減少が観察され (二比率 z 検定、z = 3.111、片側、P = 0.00093)、4 °C でのインキュベーション後は取り込みは検出されませんでした (ND)。 アスタリスク (***) は P ≤ 0.001 を示します。 D-TR を取り込んだ細胞のパーセンテージと分析された細胞の総数は条件ごとに示されており、2 回の反復インキュベーションからの合計細胞数に基づいています。 L 型を脂質ナノ粒子 (平均サイズ 150 nm) とインキュベートすると、L 型は内部小胞内に局在化し、外部粒子の取り込みは 4 °C でのインキュベーションまたはアジ化ナトリウムとのインキュベーションによって阻害されることに注意してください。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

細胞内小胞の超微細構造と組成をより深く理解するために、3D低温相関光学顕微鏡および電子顕微鏡（cryo-CLEM）を使用してL型を画像化しました（図4a）。 Cryo-FIB-SEM (集束イオンビーム - 走査型電子顕微鏡) を使用すると、L 型と内部小胞の 3D 高解像度イメージングが可能になります。 極低温サンプルの調製とイメージングにより、液体からアモルファス氷への変化を可能にする高圧条件下での急速凍結により、L 型が天然に近い状態で確実に視覚化されます 35,36,37。

a すべての画像化された細胞で実行された、α pIJ82-GFP の相関した蛍光および電子顕微鏡写真 (Zen Connect 画像) の例。 蛍光顕微鏡と電子顕微鏡の両方で見える FinderTOP ラスターにより、2 つのイメージング モジュール間の位置合わせが容易になります。 四角形は、高解像度で画像化されたさまざまな関心領域を示します。 FIB-SEM 集束イオン ビーム - 走査型電子顕微鏡、FL 蛍光。 b 多数の蛍光細胞を示す、選択した関心領域 (ROI) の高解像度画像の例。 c 関心のあるすべての細胞を選択するために実行された、(b)の白いボックスで示されたL型の蛍光顕微鏡写真。細胞内の暗球(約1μm、白い矢印)を示しています。 (b – d) の X、Y、Z 矢印は、3D FIB-SEM で観察された画像化された細胞の 3D 方向を示します。 d（c）の細胞（サイズ〜6μm）の走査電子顕微鏡（SEM）画像（SE、Inlens）。内部小胞を示す矢印が付いています（n = 1細胞）。 e (d) の細胞の 5 つの連続したスライス (後方散乱画像) の重ね合わせ。 挿入図: 白いボックス内の領域 (n = 1 セル) の平均グレー値 (ピクセル強度) の密度プロファイル プロット (白)。 f – i FIB-SEM スライス。画像化された 3 つの細胞からのさまざまな種類の内部小胞を示しています。 サイズ約 3.5 μm の細胞の細胞膜を裏打ちする小胞 (f、g)。 アスタリスクは（f、g）の小胞を示します。 白い矢印で示された小胞の膜厚が異なる小胞複合体 (h)。 補足図 7a および補足ムービー 3 も参照してください。 (i) 白い矢印で示されている膜の突起。 j–q (i) の細胞の相互接続された小胞の分析 (n = 1)。 j–l 異なる小胞の相互作用を示す 3 つの連続したスライス。 n ～ p は、それぞれ j ～ l の白いボックス内の領域の高倍率を示します。 m、q n–p の 3D セグメンテーション。 小胞の一部は細胞内にありますが、他の小胞は細胞の外に突き出ています。 完全に接続された小胞構造は緑色 (m、q) で示され、白い矢印 (i、j、l、m) で示されます。 補足図7b〜dおよび補足ムービー4を参照してください。パネルh〜qのセルのサイズは約4μmです。 r – u コントラストの異なる領域 (色付きの領域で示される) は、1 つのセルで示されているように、推定上の脂質体を表す黒い粒子で並んでいます (同様の領域は 3 つのセルで観察されます)。 このセルのサイズは約 3.6 μm で、パネル (g) に関連します。 黒色粒子のサイズ分布は 25 ～ 60 nm です。 特に指定のない限り、スケール バーは 500 nm を表します。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

高圧凍結後、α pIJ82-GFP を使用して、細胞質 eGFP を欠く内部の暗い領域に基づいて、推定上の細胞内小胞を持つ細胞が検出されました（補足図5）。 特定の L 型 (図 4b、c の選択例) は、cryo-FIB-SEM を使用して詳細に画像化されました。 細胞質eGFPの減少は、以前の結果（図2b）と一致して、FIB-SEMによって検出された内部小胞の存在と実際に一致しました（図4c、d、白い矢印）。 さらに、より重い元素の分布に基づいてコントラストを提供するInLensエネルギー選択的後方散乱（EsB）検出器を使用して測定したように、細胞質の組成と内部小胞の内容は異なっていました（図4e）。 ピクセル強度の分析により、内部小胞内のコントラスト レベルは細胞外環境と同様であるのに対し、細胞質のコントラストはより高いことが示されました。 さらに、過剰暴露実験により、小胞は細胞の残りの部分とは異なり、外部の媒体と同じ電子線量を吸収する能力があることが示されました（補足図6a、b）。 これらの結果は、内部小胞が細胞外培地を含み、膜陥入によって形成されるという発見を裏付けています (図 2)。

さらに高解像度のイメージングにより、個々の細胞内に複数の内部小胞が存在することが示されました（図4f-i、補足図6c-e）。 検出されたほとんどの小胞は細胞膜の内側にあり（図4gおよび補足図6c〜e）、サイズと膜の厚さが異なり（図4h）、より大きな小胞の内部に存在することさえありました（図4hおよび補足図7a）。 。 他の小胞内の小胞の存在も蛍光顕微鏡を使用して観察されており（補足図3c、白い矢印）、D-TRをカプセル化するより大きな小胞内の非蛍光小胞が示されています。 さらに、小胞が細胞膜から出芽しているのが観察できました（図4i）。 輪郭追跡に基づく出芽小胞の3D再構成により、これらが内部小胞の延長であるか、内部小胞に接続されたままで複合体を形成していることが明らかになりました（図4j〜q、補足図7a〜d、および補足映画3） 、4）。

場合によっては、細胞には、細胞の他の部分とは異なるグレー値を持つ細胞内領域が含まれていました（図4r–u）。 これらの領域は 300 ～ 800 nm のサイズ分布を持ち、細胞膜に沿っておらず、直径約 25 ～ 60 nm の暗い粒子で囲まれていました。 以前のクライオ FIB-SEM 観察と比較すると、これらの暗い粒子は脂質体である可能性があります 38,39。 考えられる解釈としては、内部領域は小胞であり、それを包んでいる脂質膜が部分的に分解されているというものです。 脂質および脂質分解生成物が脂肪滴に蓄積し、その結果黒い粒子が観察される可能性があります。 内部小胞の分解を捕捉するために、細胞質 mCherry (alpha pRed*) を発現する L 型に対して一晩のタイムラプス イメージングを実行しました。 小胞は細胞質 mCherry の欠如によって特定され、細胞をさまざまな Z 高さで画像化して、小胞が単に位置を移動しただけではないことを確認しました。 小胞の破壊は、新鮮な LPB 培地に再懸濁した 2 日目の L 型を使用して観察されました (補足ムービー 5)。 同じサンプルで異なる細胞を使用して連続タイムラプスを実行した後、小胞破壊のさらに 2 つのイベントが捕捉されました (補足ムービー 6、7)。 画像化されたすべての小胞は、タイムラプスの開始時にすでに細胞内に存在していました。 小胞破壊までの経過時間は大きく異なりますが（2 回目の実験では 1 時間後、または 13 時間後と 17 時間後）、破壊プロセス自体は 15 分以内に発生し、これは連続画像間の時間間隔でした。 これらの発見は、L 型の内部小胞が破壊され、このようにしてその内容物が細胞質に放出されるというモデルを強化するものです。

これらの結果は、K. ビリディファシエンスの L 型で観察される内部小胞が外部媒体を含み、細胞膜の陥入によって形成され得ることをさらに裏付けます。 L 型にはさまざまなサイズの小胞が複数含まれており、場合によっては細胞膜から突き出る小胞のクラスターまたは複合体を形成します。 内部小胞は、小胞の分解後に内容物を細胞内に放出する可能性があります。 これらの発見は、DNA などの巨大分子が飲み込まれて取り込まれ、その後小胞が破壊された後に積荷が放出されるというモデルを裏付けています (図 5)。

細胞膜の陥入により、L 型の内部小胞が形成されます。 細胞膜が内側に膨らむと、DNA または他の巨大分子を含む細胞外液が飲み込まれます。 陥入プロセスの根底にある機構はエネルギー依存性であり、膜合成の増加と高い膜流動性に基づいているか、細胞骨格タンパク質などの真核生物のエンドサイトーシスに関与するものと同様のタンパク質によって媒介されている可能性があります。 DNA は未知のプロセス (破線の矢印で示す) によって内部小胞から放出されますが、これには小胞の破壊が関与している可能性があります。 BioRender.com で作成された画像。

細菌の細胞壁は環境に対する重要な保護障壁であり、ストレス耐性を提供し、分子の選択的通過を可能にします。 しかし、近年、条件によってはこの層がなくても細菌が繁殖する可能性があることが明らかになりました。 細胞壁を標的とする薬剤や高浸透圧などの環境ストレスに長期間さらされると、細胞壁を持たずに効率的に増殖する L 型の形成が誘導される可能性があります 7。 このような壁の欠如した細菌の生活様式が DNA を取り込む能力にどのような影響を与えるかは、ほとんどわかっていません。 今回我々は、L型が飲み込みとその後の内部小胞の形成を介してDNAや他の高分子を取り込む可能性があるという証拠を提供します（図5）。

HGT のよく知られたメカニズムは、自然の形質転換、形質導入、および結合です 40。 これらのメカニズムには、細胞エンベロープを横切る DNA の輸送を可能にする高度な機構が必要です。 今回我々は、プロトプラスト、S細胞、L型K. viridifaciensなどの壁欠損細胞がPEGを用いてDNAを取り込むことを示す。 重要なことに、L 型は、PEG を使用せずにプラスミド DNA を使用して一貫した自発的形質転換を達成する唯一の壁欠損細胞です。 PEGを使用せずにゲノムDNAを使用した場合、形質転換は観察されませんでした。 これはおそらく、プラスミド DNA と比較して使用される gDNA 分子の数が約 200 分の 1 であること、および抗生物質耐性カセットを安定して組み込むためにゲノム DNA と染色体との二重組換えが必要であるためであると考えられます。形質転換効率が低くなります。

自然に形質転換可能な細菌は、細胞壁および細胞膜を通過する DNA の取り込みに標準的かつ複雑なシステムを使用します。 後者のステップでは、天然に形質転換可能なグラム陽性およびグラム陰性種にわたって見出されるホモログを含む、DNA結合タンパク質ComEAおよび孔形成チャネルタンパク質ComECが必要です（例：淋菌のComEおよびComA）。 これらのタンパク質のいずれかを破壊すると、通常、形質転換が大幅に減少するか、さらには形質転換が起こらなくなります 15、16、41、42。 しかし、K. viridifaciens の L 型における comEA および comEC と相同性のある遺伝子の破壊は、DNA を取り込む能力に影響を及ぼさなかったことから、標準的な自然の遺伝子形質転換機構とは独立したメカニズムが示唆されています。

エンドサイトーシスは、栄養素の取り込み、細胞膜組成の制御、細胞外環境の感知、およびシグナル伝達に関与する、真核生物における基本的かつ高度に制御されたプロセスです43。 膜の陥入とその後の膜切断および小胞形成により、細胞は体液、リガンド、細胞膜タンパク質、さらには細菌全体などの幅広い積荷を内部に取り込むことができます。 陥入の後には、積荷がエンドソーム経路を通過し、リソソームで分解されることがよくあります26。 特定の哺乳動物細胞は DNA を取り込み、その後に活発な遺伝子発現 44 が起こり、これはエンドサイトーシスを介して起こる可能性がありますが、正確なメカニズムは不明です 45。 この研究は、L型がDNAの取り込みにエンドサイトーシスのような機構を使用し、それによって膜の陥入により細胞内小胞が形成され、その形成中に細胞外物質が封入されることを示しています（図5）。 このプロセスを介して、DNAだけでなく、3 kDaデキストランや150 nmの脂質ナノ粒子などの他の高分子もカプセル化されており、取り込みプロセスが非特異的であることが強く示唆されています。 摂取プロセスは、代謝活動とエネルギー生産を低下させる条件によって阻害されます。 興味深いことに、古い研究では枯草菌 L 型の内部小胞における蛍光デキストランの取り込みも報告されており、これは液相エンドサイトーシスを介して起こると提案されています 46。

L 型の細胞内小胞形成の根底にある正確なメカニズムは不明ですが、過剰な膜合成による膜ダイナミクスの増加に依存している可能性があります 6,47。 過剰な膜合成による細胞表面積と体積の比率の不均衡は、球状大腸菌および枯草菌の形状変異体において内部小胞の形成を引き起こす可能性があります6,48。 内部小胞または液胞は、細胞膜の拡張を可能にする条件で維持される拡大したプロトプラストおよびスフェロプラスト（後者は外膜を含む）でも形成されます 49,50。 実際、過剰な膜生成の欠如は、プロトプラストと S 細胞（どちらも壁なしでは増殖できない）における一貫した DNA 取り込みが観察されなかった理由も説明する可能性があります。 しかし、コートタンパク質、切断機構、細胞骨格タンパク質など、真核生物のエンドサイトーシスに関与するタンパク質と同様のタンパク質 43 が、L 型における内部小胞の形成に関与しているかどうかを除外することはできません。 ただし、枯草菌の L 型は膜の変形と増殖に既知の細胞骨格タンパク質に依存していないことに注意する必要があります 51。

高解像度電子顕微鏡イメージングにより、L 型細胞内の複数の内部小胞が明らかになりました。 興味深いことに、L 型には膜で囲まれていないが、より暗いスポットで裏打ちされた領域も含まれていました。 これらのダークスポットは、物質による電子の局所的な帯電によって生成され、以前はタンパク質性または脂質体として説明されており 38,39 、おそらく内部小胞の膜の分解生成物に由来する可能性があります。 内部小胞のおそらく崩壊もタイムラプスイメージングを使用して捕捉されました。 この崩壊により、小胞カーゴが細胞質に放出されることになります。 真核生物では、エンドソーム小胞からの治療薬の脱出は、細菌、ウイルス、化学物質、またはナノ粒子によって媒介される可能性があります 52,53。 脱出メカニズムには、細孔の形成、膜の不安定化、ナノ粒子の膨張、または浸透圧破壊が含まれます。 高いスクロースレベルまたはプロトンスポンジ効果はプロトンの流入を促進し、その後塩化物イオンの蓄積と水の流入が起こり、小胞の破裂につながります54,55。 エンドソームの酸性化は、プロトンを小胞に送り込む膜局在性液胞 ATPase (V-ATPase) を介して起こります 56。 細菌は、その原形質膜上に F-ATPase と呼ばれる同様のプロトンポンプを持っており、拡大したプロトプラストの細胞内小胞の膜上で発見されています 57。 既知の脱出機構の複雑さを考慮すると、内部の L 型小胞がどのように崩壊して内容物を細胞質に放出できるかを理解するには、さらなる研究が必要です。

現代の生命体は複雑な生物学的システムであり、おそらくはるかに単純な細胞から進化したと考えられます。 推定上の初期生命体を研究するための 2 つのモデル系は、細胞壁と生物物理学的増殖方法が欠如しているため、巨大脂質小胞と L 型です 8,9。 遺伝子の水平伝播は、初期生命の進化において極めて重要な役割を果たしたと考えられています58。 これは、細胞壁がまだ進化していない細胞で発生し、細胞融合または雷誘発エレクトロポレーション後の遺伝子組換えを可能にした可能性があります 59,60 が、HGT の他のメカニズムは不明でした。 内部小胞は他の細菌種の L 型でも観察されており、さまざまな機能と小胞形成機構が記載されています 61,62。 L 型リステリア モノサイトゲネスは、細胞膜の内側に沿って DNA を含む内部小胞を形成することができ、放出されると代謝的に活性化します 63,64。また、膜陥入を介して内部小胞を形成し、これには細胞外培地が含まれる可能性があります 47。 さらに、小胞膜自体の二次的な陥入により、細胞質を含む​​小胞が生成され、生存可能な子孫が得られる可能性があります。

興味深いことに、予備研究により、L. モノサイトゲネスの L 型も細胞外プラスミド DNA を取り込み、PEG65 を使用せずに形質転換される能力があることが示されています。 この細菌種は自然に形質転換可能であることは知られておらず、機能的能力システムを含んでいません。 これは、K. ビリディファシエンスの L 型で観察されるのと同様のエンドサイトーシス様機構が DNA 取り込みに関与している可能性があることを示唆しています。 これらの例は、細菌のエンドサイトーシスの存在をさらに裏付けるものです。

最近の研究では、球状の微化石と壁のない原形質体の類似点が報告されています66。 地球上に生命が誕生した時期である始生代の推定条件を模倣した条件でプロトプラストを成長させると、細胞内小胞が形成されました。 これらの小胞は35～24億年前の微化石でも観察されており、古代には壁のない細胞が存在していた可能性があることが示唆されている。 ただし、壁のない細胞は壁のある細菌からも形成される可能性があることに注意する必要があります。 例えば、壁のないマイコプラズマは、変性進化を介して壁のある細菌に由来することが示されており67、研究室で生成されたL型も壁のある細胞に由来します。 L 型は始原細胞そのものではなく、推定上の初期生命体を研究するためのモデルとして機能している可能性があります。 したがって、L型で観察されるエンドサイトーシスのようなプロセスは、細胞壁が発明される前に始原細胞がどのようにして飲み込まれて新しい遺伝物質と栄養素を獲得したかについての古代のメカニズムを反映していると我々は提案します。

結論として、我々の研究は、細菌細胞壁の永久的な喪失により、内部小胞形成を介して DNA、デキストラン、および 150 nm サイズの脂質ナノ粒子の取り込みが可能になることを示しています。 細胞膜の陥入により、外部の液体が飲み込まれ、その後小胞が形成されます。 最終的には小胞が破壊され、積荷が細胞質に放出される可能性があります。 これはエネルギーに依存するプロセスであり、真核生物で見られる単純な形のエンドサイトーシスと類似点があります。 このプロセスの背後にある分子機構をさらに理解するには、今後の研究が必要です。

この研究で使用した細菌株とプラスミドをそれぞれ補足表 4 と 5 に示します。 細菌細胞株は、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。 キタサトスポラ ビリディファシエンス DSM4023968 をマルトース酵母抽出培地 (MYM) でコンフルエントに増殖させて胞子を取得し、3 ～ 4 日の増殖後に回収しました 69。 簡単に説明すると、綿棒を使用して胞子を MilliQ に再懸濁し、脱脂綿を満たした注射器で濾過しました。 胞子を 20% (v/v) グリセロール (G1345、Duchefa Biochemie) に再懸濁し、使用するまで -80 °C で保存しました。 液体中での菌糸体の増殖については、K. viridifaciens をスクロースを含まない L 相ブロス (LPB) 中で 1 × 106 胞子 ml-1 の密度で 200 rpm で一晩増殖させました。 菌株をスクロースを含むLPB (S0809、Duchefa Biochemie)中で100 rpmで2日間増殖させ、S細胞の形成を誘導しました7。 L 型は、固体 L 相培地寒天 (LPMA) または液体 LPB7 上で増殖させました。 液体培養物に、K.ビリディファシエンス株の胞子を接種するか、L型株の場合は1〜2日経過したL型培養物の凍結アリコートを接種しました。 特に明記しない限り、L 型は化学的形質転換の場合は 3 ～ 4 日間、他のすべての実験では 7 日間液体培養で増殖させました。 L 型は、形質転換アッセイでは 5 ～ 7.5 × 107 CFU ml-1 (3 日後および 7 日齢の細胞の OD600 と 1 日齢の細胞の 0.2 に基づく)、および 2.5 ～ 5 × 7 日齢の細胞を用いた他のすべての実験では 107 CFU ml-1 (OD600 of 2)。 すべてのキタサトスポラ培養物は 30 °C で培養されました。

必要に応じて、抗生物質（100 μg ml-1 アンピシリン、K029、Roth; 25 μg ml-1 クロラムフェニコール、C0113; Duchefa Biochemie; 5 μg ml-1 チオストレプトン、598226、Calbiochem; 50 μg ml-1 アプラマイシン、A0164、Duchefa Biochemie） ；１００μｇ ｍｌ−１のハイグロマイシンＢ、Ｋ５４７、Ａｍｒｅｓｃｏ（ＬＢ培地の場合は２００μｇ ｍｌ−１のハイグロマイシンＢを除く）を培地に添加した。 大腸菌株を固体または液体のLB培地（250 rpmで振盪しながら）上で37℃で増殖させた。クローニング目的およびメチル化プラスミドDNAの取得には大腸菌JM10970を使用し、メチル化欠損プラスミドDNAの取得には大腸菌ET12567/pUZ800271を使用した。 DNA。

すべての PCR は、PFU または Q5® High-Fidelity DNA ポリメラーゼ (NEB) を使用して実行されました。 この研究で使用したプライマーを補足表 6 に示します。GeneRuler DNA Ladder Mix (SM0334、Thermo Scientific) を使用して、ゲル電気泳動によって DNA 分子のサイズを確認しました。 pFL-ssgB (補足表 5) を作成するために、pMS8272 を鋳型としてプライマーペア Hyg_F-231_EEV および Hyg_R + 1237_HEV を使用してハイグロマイシン耐性カセットを増幅しました。 PCR産物をEcoRVで消化し、pWHM3-oriT73にクローニングして、pWHM3-oriT-hygを生成しました（補足表5）。 ssgBの3'側をpKR17から消化し、XbaIおよびHindIIIを使用してpWHM3-oriT-hygにクローニングして、最終プラスミドを生成した。 すべての制限酵素は New England Biolabs から注文しました。

pRK1（補足表5）は、プライマーFL1-comEA/comEC-FWおよびFL1-comEA/comEC-REVを使用したPCRによってcomEAの上流フランキング領域を増幅することによって作成され、それによってユニークなEcoRIおよびXbaI制限部位が導入されましたが、下流フランキング領域はｃｏｍＥＣの遺伝子合成（Ｂａｓｅｃｌｅａｒ、オランダ、ライデン）によって作製されたｃｏｍＥＣの配列は、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接していた。 隣接領域およびアプラマイシンカセットを、隣接ＸｂａＩ部位を含むアプラマイシン耐性カセットが点在するＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を使用してｐＷＨＭ３－ｏｒｉＴにクローニングし、それによって最終プラスミドを作製した。 comEA/comEC 欠失変異体は、pRK1 を使用して L 型株 alpha7 で作成されました。これは、comEA の開始コドン (BOQ63_029625) に対して +58 のヌクレオチドを、アプラマイシン耐性のある comEC (BOQ63_029630) の開始コドンに対して +2489 まで置換しました。カセット。 Streptomyces viridifaciens ATTC11989 (アクセッション CP023698) の遺伝子アノテーションを使用して、comEC の推定上の正しい開始コドンと停止コドンが決定され、その結果、CP090841 上のゲノム位置 5,041,836 ～ 5,044,433 が得られたことに注意してください。

pIJ82-GFPを作製するために、gap1プロモーターを有するeGFP遺伝子を含む領域を、プライマーペアgap1_FW_BglIIおよびegfp_RV_EcoRIを使用してpGreen74から増幅した。 得られたPCR産物をBglIIおよびEcoRIを使用してpIJ82にクローン化し、最終プラスミドを生成した。

新しい L 型株を作成するために、以下に説明するように、ポリエチレン グリコール (PEG)10 に基づく化学的形質転換を使用して、プラスミド DNA によるアルファの形質転換を達成しました。 プラスミドDNAを大腸菌ET12567/pUZ8002から単離し、メチル化欠損DNAを得た。 L 型株 alpha pIJ82-GFP および alphaΔdivIVA pIJ82-GFP は、それぞれ alpha および alphaΔdivIVA を pIJ82-GFP で化学形質転換し、続いてハイグロマイシン B で選択することにより作成されました (補足表 4)。 蛍光顕微鏡を使用した蛍光 eGFP 産生の検出を使用して、株を検証しました。 株αΔｃｏｍＥＡ／ＥＣは、ｐＲＫ１によるαの化学的形質転換、その後のアプラマイシンの選択によって得られた（補足表４）。 その後の非選択培地での増殖により二重相同組換えが起こり、comEA/EC領域がアプラマイシン耐性カセットに置換され、チオストレプトン感受性のアプラマイシン耐性細胞が得られました。 この菌株は、プライマーペア ComEA_Apra_check_FW および ComEC_Apra_check_RV を使用した PCR によって検証され、アプラマイシン カセットによる領域の置換が確認されました。 この領域の欠失をさらに確認するために、このゲノム領域がまだ存在する場合にのみ comEC の一部を増幅するプライマーペア ComEC_Presence_Check_1_FW/RV および ComEC_Presence_Check_2_FW/RV を使用して PCR を実行しました。

ゲノム DNA は、フェノール:クロロホルム抽出を使用して 5 日齢の alphaΔssgB7 培養物から単離されました 10。 簡単に説明すると、細胞ペレットを、0.01 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA、20296.291、VWR Chemicals BDH) を含む 10.3% (w/v) スクロース、pH = 8 に再懸濁し、その後 10% (w/v) ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) で溶解しました。 、20765.02、セルバ）。 フェノール:クロロホルム (フェノール、10001173、Fisher BioReagentstm とクロロホルム、32211、Honeywell の 1:1 混合物) による抽出を実行し、イソプロパノール (33539、Honeywell) を使用して核酸を沈殿させました。 ペレットをTris-EDTA緩衝液(Trizma(登録商標)ベース、RDD008、Sigma-Aldrich)に溶解し、続いてRNase A(EN0531、Thermo Fisher)およびプロテイナーゼK処理(19131、Qiagen)を行った。 フェノール:クロロホルム抽出を使用して gDNA を単離し、無水エタノール (5250501、Biosolve) を使用して沈殿させた後、ヌクレアーゼを含まない水に再懸濁しました。 断片化されたｇＤＮＡは、Ｍｉｋｒｏ－Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ Ｕ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）中で２０００ｒｐｍで直径２ｍｍのガラスビーズを使用して無傷のｇＤＮＡを１２分間ビートビートすることによって得た。 染色体 DNA 濃度は、Quant-IT™ Broad-Range dsDNA Assay Kit (Q33130、Invitrogen) を使用して検証されました。

K. viridifaciens 株 DSM40239 を、0.5% (w/v) グリシン (G0709、Duchefa Biochemie) および 5 mM MgCl2 (M0533) を含む TSBS:YEME (1:1) 液体培地に 5 × 106 胞子 ml-1 の密度で接種しました。 、ドゥチェファ生化学）。 培養物を 200 rpm で振盪しながら 48 時間増殖させ、その後プロトプラストを調製しました 10。 K. ビリディファシエンス pIJ82-GFP および K. ビリディファシエンス pRed* には 72 時間の培養物を使用しました。 細胞を10.3％（w/v）スクロースで洗浄した後、10 mg ml-1の鶏卵白リゾチーム（約70,000 U mg-1、62971、Sigma-Aldrich）を添加してリゾチーム処理を実施しました。 細胞を 100 rpm、30 °C で 2 ～ 3 時間インキュベートした後、脱脂綿フィルターで濾過してプロトプラストから菌糸体の断片を分離しました。 必要に応じて、1000×gでの遠心分離により細胞を濃縮した。

S 細胞は、ろ過によって LPB 培養物から単離されました 7。 つまり、培養物を滅菌 EcoCloth™ フィルター (AMEC0003、Contec) で濾過し、続いて 5 μm Isopore™ メンブランフィルター (TMTP01300、Merck) に通しました。 １０００×ｇで２０分間穏やかに遠心分離することによって細胞を濃縮し、その後、上清の９０％を除去した。 細胞ペレットを残りの液体に注意深く再懸濁した。 高濃度の S 細胞の自発的 DNA 取り込みをテストするために、K. viridifaciens を 1 × 107 胞子 ml-1 で接種し、濾過は EcoCloth™ フィルターのみで実行しました。

新たに調製したプロトプラスト、S 細胞、L 型細胞、または菌糸体細胞は、形質転換前に氷上に保管しました。 化学的形質転換のために、50 μl の細胞を 1 μg pRed*75、alphaΔssgB 株の 150 ng gDNA、フィルター滅菌塩溶解細胞 (alphaΔssgB からの 35 ng DNA)、または MilliQ と混合しました。 次に、Ｐ緩衝液１０中の２５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ１０００（１４８０５－Ｂ、ＮＢＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）２００μｌを細胞に添加し、続いて懸濁液をＰ緩衝液中で穏やかに混合し、希釈した。 段階希釈物をLPMA培地上にプレーティングし、16～18時間インキュベートした後、抗生物質を含む1 mlのP緩衝液でオーバーレイを実施した。 コロニー形成単位 (CFU) は、L 型および菌糸体の場合は 7 日後、S 細胞およびプロトプラストの場合は 14 日後にカウントされました。 形質転換体は、選択培地に画線塗布し、顕微鏡検査することによって確認した。

特に明記しない限り、新たに調製した細胞を 30 ng μl-1 の非メチル化 DNA (pRed* または pFL-ssgB を示す) または MilliQ とともに 100 rpm で 18 ～ 24 時間インキュベートしました。 最終濃度 100 または 10 ng μl-1 の無傷 gDNA および alphaΔssgB から単離された断片化 gDNA の 10 ng μl-1 を、1 日齢および 7 日齢のアルファの両方と組み合わせて使用​​しました。 慎重に再懸濁した後、希釈液を選択的および非選択的 LPMA 上にプレーティングしました。 菌糸体細胞をMYM培地で同様に希釈した。 コロニー形成単位は、L 型および菌糸体の場合は 30 °C で 7 日間、プロトプラストおよび S 細胞の場合は最大 14 日間のインキュベーション後に決定されました。 形質転換体は、選択培地上での増殖および PCR (プライマー Tsr_Hyg_FW1 および Tsr_Hyg_RV1 を使用) または顕微鏡検査によって検証されました。 株間の形質転換効率を比較するために、少なくとも 5 つのレプリカ培養から細胞を調製しました。 S 細胞の DNA 取り込みは、標準手順で得られた濾液と、1 × 107 胞子 ml-1 の接種および EcoCloth™ フィルターのみによる細菌培養物の濾過によって得られたより濃縮された濾液を使用してテストされました。 Epson Scan Utility v3.9.2.0 ソフトウェアを備えた Epson Perfection V600 Photo スキャナーを使用して、コロニー プレートを画像化しました。

1、3、および 7 日齢の L 型または新たに調製したプロトプラストの 3 つの複製培養物を、膜流動性の尺度として Laurdan 色素アッセイに供しました 23。 まず、各培養液約 1 ml を 1000 xg で 10 分間遠心分離して、微量の培養培地を除去しました。 細胞を1mlのP緩衝液に再懸濁し、OD600が0.6になるように調整した。 10 mM Laurdan (6-ドデカノイル-2-ジメチルアミノナフタレン、D250、Invitrogen) ストック溶液を 100% ジメチルホルムアミド (DMF、D4551、Sigma-Aldrich) で調製し、琥珀色のチューブに入れて -20 °C で保存しました。 OD 調整した各培養物 1 ml に、Laurdan 色素 1 μl を最終濃度 10 μM で添加しました。 次いで、培養物を、100 rpmで振盪しながら、暗所、30℃で10分間インキュベートした。 細胞を１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、４１６３９、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰ緩衝液で３回洗浄して未結合の色素分子を除去した後、細胞をＰ緩衝液に再懸濁した。 この再懸濁培養液約 200 μl を 96 ウェル黒色/ガラス底 SensoPlate™ (655892、Greiner Bio-One) に分注しました。 培養ごとに 3 つのテクニカル レプリカを測定し、バックグラウンド蛍光を測定するための色素を使用せずに培養条件ごとに 1 つのレプリカを測定しました。

サンプル励起を 350 nm で実行し、続いて 435 および 490 nm で蛍光発光を捕捉し、Sparkcontrol V3.1 ソフトウェアを備えた Spark® マルチモード マイクロプレート リーダー (Tecan) を使用して測定しました。 バックグラウンド蛍光を差し引いた後、一般化偏光 (GP) 値が式 1 を使用して計算されました。 (1):

計算後に得られた値は -1 ～ +1 の範囲にあり、-1 に近いほど流動性が高いことを示します。

顕微鏡による膜流動性の定量化のための細胞の調製は、以下のように実施した。 細胞を洗浄し、上述のようにODを調整した。 Laurdan 色素 (ストック濃度 10 mM) を 100 μl の培養物に添加して、最終濃度 100 μM を得ました。 培養物を、暗所で１００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で５分間置いた。 １％ＤＭＳＯを含む予め温めたＰ緩衝液約９００μｌを添加し、培養物を遠心分離（１０００×ｇ、１０分間）して未結合の色素分子を除去した。 最後に、顕微鏡分析のために細胞を 100 μl の P バッファーに再懸濁しました。 ローダン色素を使用しない以外は同様に処理した細胞を、顕微鏡測定の対照として使用した。

蛍光標識プラスミド DNA は、Mirus Label IT® Cy™5 ラベリング キット (MIR 2725) を製造元の仕様書に従って使用して調製しました。 標識 DNA のアリコート (100 ng µl-1) を、さらに使用するまで -20 °C で保存しました。

すべての脂質 (DLin-MC3-DMA76、コレステロール、C8667、Sigma-Aldrich、Avanti Polar Lipids: DSPC、850365、DMG-PEG2000、880151、18:1 Liss Rhod PE、810150) をモル比 50/38.3 で組み合わせました。 /10/1.5/0.2 クロロホルム:メタノール (クロロホルム、22706、VWR Chemicals とメタノール、83638、VWR Chemicals の 1:1 混合物) の原液 (100 μM ～ 10 mM) を使用。 有機溶媒を窒素流下で蒸発させ、残りの溶媒を真空中で少なくとも１時間除去した。 続いて、脂質フィルムを EtOHabs (20821、VWR Chemicals) に溶解し、50 mM クエン酸緩衝液 (pH = 4、MilliQ、クエン酸、C0759、およびクエン酸三塩基性ナトリウム二水和物、C7254 を使用、Sigma-Aldrich) を調製しました。 各溶液を別々のシリンジにロードし、T 接合マイクロ流体ミキサーに接続しました。 溶液をクエン酸緩衝液対脂質の流量比３：１（クエン酸緩衝液については１．５ｍＬ／分、脂質溶液については０．５ｍＬ／分）で混合し、総脂質濃度を１ｍＭとした。 混合後、溶液を 10k MWCO 透析カセット (Slide-A-Lyzer™、Thermo Scientific) に直接ロードし、137 mM NaCl (NAC02、Formedium)、2.7 mM を含む 1 × リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に対して一晩透析しました。 KCl (1.04936、VWR Chemicals)、8 mM Na2HPO4 (1.06586、VWR Chemicals)、および 2 mM KH2PO4 (60229、Sigma-Aldrich) で一晩処理しました。 脂質ナノ粒子 (LNP-LR) は、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。 ＬＮＰとのすべてのインキュベーションは、ＬＮＰ溶液の最終体積が２５％であるＬＰＢ培地に再懸濁した細胞を用いて実施した。

脂質ナノ粒子の調製物は、以下の方法で特徴付けられた（補足表８）。 動的光散乱 (DLS) 測定は、Zetasizer Nano シリーズ S (Malvern Instruments、Malvern、UK) で実行されました。 組み込まれた HeNe レーザーは 633 nm の波長で動作し、173° の角度で検出器を使用します (非侵襲的後方散乱技術)。 測定値は、25 °C の UV キュベット内で 1 分間の平衡時間で記録されました。 z 平均直径 (強度重量平均直径) および多分散指数 (PDI) (粒子サイズ分布の相対幅) を推定するために、サンプルを 1× PBS で 10 倍に希釈して調製しました。 ゼータ電位を推定するために、サンプルを 0.1 × PBS で希釈し、Zetasizer Nano シリーズ SZ (Malvern Instruments、Malvern、UK) で測定しました。 平均値を得るために、すべてのデータを 3 回繰り返しました。

形質転換体の蛍光発光の検出は、Zeiss Axiocam 305 カラーデジタルカメラを備えた Zeiss Axiscope A.1 を使用し、フィルターセット 63 HE (Carl Zeiss、572/25 nm バンドパス励起フィルター、590 nm ビームスプリッターおよび 629 nm からなる) を使用して実行されました。 /62 nm バンドパス発光フィルター) を使用して mCherry 蛍光を捕捉します。 単一コロニーは、Schott VisiLED リング ライト S80-55 および Bresser MikroCam SP5.0 を装備した Zeiss SteREO Discovery v. 8 を使用して画像化されました。 Bresser MikroCamLabII ソフトウェアを使用して画像をキャプチャしました。 他のすべての顕微鏡検査は、特に指定しない限り、Airyscan 2 モジュール、温度制御チャンバー、および Zeiss Zen 3.1 ソフトウェア (青色版、Carl Zeiss Microscopy GmbH) を備えた Zeiss LSM 900 共焦点顕微鏡を使用して実行されました。 この顕微鏡のすべての励起および発光設定は補足表 7 にリストされています。特に指定しない限り、マルチチャネル (DIC および蛍光) およびマルチスタック画像が取得されました。 10 μl の細胞を、0.1% (w/v) ポリ-L-リジン (P8920、Sigma-Aldrich) でコーティングした 8 チャンバー スライド (ibidi®) 上でイメージングしました。過剰なポリ-L-リジンを除去し、スライドを放置しました。サンプルを適用する前に乾燥させてください)。 タイムラプスイメージングまたは温度制御チャンバー内での一晩のインキュベーションの場合、細胞培養液 400 μl を 35 mm イメージング μ-Dish (ibidi®) に添加し、一晩イメージングの前に 1 時間 30 °C で静置しました。 画像解析は、Fiji (ImageJ) ソフトウェア 77 を使用して実行されました。

最終濃度２μＭのＳＹＴＯ ９（Ｓ３４８５４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに３０分間インキュベートした後、染色体ＤＮＡを視覚化した。 細胞膜を、最終濃度40μg ml-1のSynapseRed C2M (SynapseRed、PK-CA707-70028、PromoKine、PromoCell GmbH)とインキュベートすることにより視覚化しました。 Zeiss LSM 900 共焦点温度制御チャンバーを使用してμ-Dish (ibidi®) で一晩インキュベートした後、Zen ソフトウェアによる超解像度ポストイメージ処理を備えた Airyscan モードを使用して細胞をイメージングしました。 プロトプラストと S 細胞は、ガラス スライド上でイメージングする前に、SynapseRed と最大 72 時間インキュベートされました。 推定内部小胞の定量は、細胞質 mCherry を産生する 7 日齢の L 型 (alpha pRed*) または新たに採取した S 細胞およびプロトプラスト (K. viridifaciens pRed*) を SynapseRed と 0 時間または 72 時間インキュベートした後に実行されました。 SYTO 9 は、DNA を識別するためにイメージングの直前に添加されました。 細胞を、0.1% ポリ-L-リジンでコーティングされた 8 チャンバー スライド (ibidi®) 上に置きました。 L 型細胞と S 細胞は、細胞サイズが小さいことを考慮して、0.5 μm のステップ サイズで上から下にイメージングされ、プロトプラストは 0.28 μm のステップ サイズでイメージ化されました。 mCherry、SYTO 9、または SynapseRed 染色が欠けている 1 つ以上の領域を持つ細胞を、フィジーの Cell Counter プラグイン (ImageJ) を使用して、推定内部小胞を持つ細胞としてカウントしました。

蛍光標識された DNA の取り込みは、細胞を最終濃度 1.25 μg ml-1 の Cy5 標識プラスミド DNA (pFL-ssgB) とインキュベートすることによって評価され、72 時間後にμ-Dish (ibidi®) で画像化されました。

内部小胞形成とデキストラン テキサスレッド (D-TR、D-3329、3000 MW、中性、分子プローブ) の取り込みを捕捉するために、α pKR2 細胞を最終濃度 1 mg ml-1 D-TR でインキュベートしました。 PBS を使用し、一晩画像化しました。 1.5 μm ステップで総距離 6 μm にわたるマルチスタック イメージングを、10 分ごとにキャプチャされた画像で実行しました。 L 型、プロトプラスト、または S 細胞における D-TR 取り込みのイメージングは​​、最長 72 時間のインキュベーション後に実行されました。 D-TRを取り込んだ細胞のパーセンテージの定量化を以下のように実施した。 細胞質 eGFP を産生する細胞を、PBS または 1 mg ml-1 D-TR とデュプロで 72 時間インキュベートしました (7 日齢のアルファ pIJ82-GFP、または K. ビリディファシエンス pIJ82-GFP から新たに採取した S 細胞またはプロトプラスト)。 細胞をLPB培地で10倍に希釈し、1000×gで10分間穏やかに遠心分離し、その後上清をLPB培地に交換した。 細胞を、0.1% ポリ-L-リジンでコーティングされた 8 チャンバー スライド (ibidi®) 上に置きました。 Z スタック画像は、セルの上から下まで 0.28 μm ステップで取得されました。 推定上の D-TR 取り込みを持つ細胞は、細胞質 eGFP (推定上の内部小胞) の領域を欠いている細胞として同定されましたが、フィジーの Plot Profile ツールを使用して測定したところ、この領域での D-TR 放出の増加が明らかになりました (ImageJ)。 フィジーの Cell Counter プラグイン (ImageJ) を使用して、取り込みのある細胞と取り込まない細胞を計数しました。

アルファによる赤色蛍光 LNP (LNP-LR) の取り込みは、μ-Dish (ibidi®) での一晩のインキュベーション後、または示されているようにイメージング前の最大 3 日間のインキュベーション後にイメージングによって視覚化されました。 LNP 取り込みの阻害は、1、2.5、または 10 mM アジ化ナトリウム (S-8032、Sigma-Aldrich) の存在下でのインキュベーション、または 4 °C でのインキュベーションによって実行され、画像は 0、24、10 時間後に Zen ソフトウェアを介して取得されました。そして48時間。 α pIJ82-GFP における LNP-LR の細胞内局在を決定するために、超解像度後画像処理を備えた Airyscan モードを使用してイメージングを実行し、赤 (LNP-LR) および緑 (eGFP) チャネルのピクセル強度を使用して分析しました。フィジーのプロット プロファイル ツール (ImageJ) を使用します。

膜の流動性を測定するために、405 nm レーザーを使用してサンプルを励起し、430 および 500 nm の発光で画像を取得しました。 GP 値は、Fiji78 の Calculate GP プラグインを使用して計算され、-1 から +1 の範囲にわたるピクセル数のヒストグラムが取得されました。 簡単に説明すると、画像は個々のチャネルに分割され、その後背景が減算され、重要でないピクセルがゼロに設定されます。 次に、画像には文字 A と B が割り当てられ、画像計算機を使用して A − B と A + B が計算されます。 最後に、(A − B)/(A + B) の比率を、最小ピクセル値を -1 (赤)、最大ピクセル値を +1 (青) に設定した画像として示します。 ヒストグラム分析機能を使用すると、値のリストが取得され、さまざまなサンプルの分布をプロットするために使用されます。

小胞破壊を捕捉するために、L 型を新鮮な LPB に OD600 が 0.04 になるまで再懸濁しました。 希釈液を96ウェルの黒色/ガラス底SensoPlateに置き、1000×gで5分間穏やかに遠心して細胞をウェルの底に沈降させた。 Gen 5 v.3.10 ソフトウェアを備えた Lionheart FX 自動顕微鏡 (BioTek) を使用して、細胞を空気倍率 60 倍で画像化しました (明視野および Texas Red 586/647 フィルター キューブを使用する mCherry)。 Z スタック画像は、1 μm のステップ サイズで合計 12 μm をカバーして 20 時間 (補足ムービー 5)、または 0.5 μm のステップ サイズで合計 5 μm をカバーして 17.5 時間 (補足ムービー 6、7) で 15 分ごとにキャプチャされました。

細胞質 eGFP を発現する 7 日齢の L 型株アルファ pIJ82-GFP を、25% (v/v) PBS および最終濃度 17% (w/v) スクロースを含む新鮮な培地中で OD600 が 2 に調整されました。 細胞を4日間インキュベートし、その間に細胞は底に沈降しました。 再懸濁した L 型ペレットの数マイクロリットルを、内径 2 mm の HPF (高圧凍結) キャリア (0.1 mm または 0.05 mm の空洞、それぞれ、Wohlwend の第 241 条と第 390 条) の間に挟み、調整しました。非晶質の氷上にファインダーマトリックスのインプリントを可能にするために、グリッドラベル付きの平面ファインダーTOP（アルミニウムプレートレットラベル付き、0.3 mm、Art.1644 Wohlwend）を作成しました79。 凍結前に、finderTOP をエタノール (1.00983.1000、Supelco) 中の 1% 1-α-ホスファチジルコリン (61755、Sigma-Aldrich) で処理しました。 次に、サンプルを高圧凍結し (Live μ、CryoCapCell)、イメージングまで液体窒素中で保存しました。

極低温光顕微鏡と極低温電子顕微鏡の間の相関関係を改善するために、ZEISS Correlative Cryo Workflow ソリューションを使用して凍結サンプルをユニバーサル極低温ホルダー (Art. 349559-8100-020、Zeiss 極低温アクセサリー キット) にロードしました。 PrepDek® (PP3010Z、Quorum テクノロジーズ、ロートン、英国)。 ここで、HPF キャリアは汎用クライオホルダーに収まり、その後、クライオ光顕微鏡またはクライオ電子顕微鏡専用のアダプターに配置できます。

凍結サンプルは、Airyscan 2 検出器を備えた正立共焦点顕微鏡 (LSM 900、Zeiss microscopy GmbH) に適用されたクライオステージアダプター (CMS-196、Linkam Scientific inc.) で画像化されました。 概要画像 (Zeiss C Epiplan-Apochromat 5x/0.2 DIC) は、氷表面の格子模様を視覚化するために反射顕微鏡で作成されました。 次に、488 nm レーザー (0.4%) を使用して、ボクセル サイズ 0.15 μm × 0.15 μm × 1.18 μm で、中解像度の Z スタック画像 (Zeiss C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC) を撮影しました。 この解像度を使用すると、目的の細胞を選択し、488 nm レーザー (4%) を使用してボクセル サイズ 0.08 μm × 0.08 μm × 0.44 の Z スタック画像を作成できました (Zeiss C Epiplan-Neofluar 100x/0.75 DIC)。 μm。 さらに、FIB-SEM での相関関係を目的として、反射顕微鏡を使用してすべての ROI で氷の表面を画像化しました。

低温光イメージングの前に、すべての画像を位置合わせしてオーバーレイし、低温 FIB-SEM とのさらなる相関関係を容易にするための作業シート (キャンバス) を作成するために、Zeiss ZEN Connect プロジェクト (相関顕微鏡用の Zeiss ソフトウェア、バージョン 3.1) が作成されました。 。

サンプルは、準備段階スパッタ コータ (PP3010、Quorum Technologies、英国ロートン) を使用して、プラチナで 5 mA 電流で 30 秒間スパッタ コーティングされ、Zeiss Crossbeam 550 FIB-SEM (Carl Zeiss Microscopy GmbH、オーバーコッヘン) に移されました。 、ドイツ）PP3010T準備チャンバー（クォーラム、ロートン、イギリス）を使用して。 イメージング全体を通じて、サンプルは -140 °C に維持され、システムの真空圧力は 1 × 10-6 mbar でした。

サンプルを FIB-SEM チャンバーに挿入した後、SEM を使用して概観画像を撮影し、同じ ZEN Connect プロジェクトの表面の LSM 反射画像とデータを位置合わせしました。 この位置合わせによりステージ登録が可能になり、蛍光信号を使用してさまざまな関心領域に移動できるようになります。 SEM を使用した初期位置合わせの後、54°傾斜で 30 kV@10 pA プローブを使用して表面の FIB 画像を収集しました。

30 kV@30 nA FIB プローブを使用して、SEM 観察用に粗いトレンチをミリングしました。 冷間蒸着はプラチナで 30 秒間行われました。 30 kV@700 pA プローブを使用して、断面の微細な FIB ミリングを実行しました。 連続ＦＩＢミリングおよびＳＥＭイメージングでは、スライス（トレンチ）幅は４０μｍであり、ＦＩＢミリングでは、３０ｋＶ＠３００ｐＡのプローブが使用され、スライス厚さは２０ｎｍであった。 新しいスライス表面が FIB ミリングによって露出されると、InLens の二次画像と EsB 画像が 2.33 kV の加速電位、250 pA のプローブ電流で同時に収集されました。 EsB グリッドは -928 V に設定されました。画像サイズは 2048 × 1536 ピクセルに設定されました。 ノイズ低減には、スキャン速度 1 でのライン平均カウント N = 46 のライン平均が使用されました。 すべてのスタックのボクセル サイズは 5 nm3 × 5 nm3 × 20 nm3 でした。

クライオ FIB-SEM 画像は MATLAB (R2018b、マサチューセッツ州ナティック: The MathWorks Inc.) を使用して処理され、カーテン、位置ずれ、局所帯電などの欠陥が補正されました。 その後のノイズ低減とコントラスト強調には同じソフトウェアが使用されました。 各処理ステップの概要は次のとおりです。

スタック内の垂直縞の除去は、ウェーブレット FFT フィルタリング手法に従って行われました80。 簡単に言うと、縦縞に対応する高周波情報は、coif ウェーブレット ファミリによる分解を使用して単一の係数マップに連続的に圧縮されます。 続いて、2D フーリエ変換を実行して、ストライプ情報をさらに狭帯域に絞り込みました。 最後に、ガウス減衰関数を乗算することによって凝縮された縞模様情報が除去され、逆ウェーブレット変換によって縞模様が除去された画像が再構築されました。

連続するスライスは、正規化された相互相関を使用して位置合わせされました。 簡単に言うと、スタック内の最初の画像が参照として選択され、2 番目の画像が参照全体でピクセルごとに変換され、normxcorr2 関数を使用して正規化された相互相関行列が取得されました。 次に、相互相関行列の最高ピークの位置 (最良の相関を表す) を使用して、2 つの画像を位置合わせするために必要な平行移動を計算しました。 動画が基準画像と位置合わせされると、それは後続のスライスの位置合わせの基準として機能します。

局所的な電荷の不均衡の除去は、異方性ガウス バックグラウンド減算を使用して達成されました。 簡単に言うと、関数 imgaussfilt を使用して、2 要素の標準偏差ベクトルを使用して 2D ガウス平滑化を実行しました。 ベクトル内の要素は、水平方向と垂直方向にそれぞれ幅広くシャープなガウスを適用する方法で選択されました。 続いて、元の画像からフィルタリングされた画像を減算することにより、補正画像が得られました。

S/N 比を改善するために、異方性拡散フィルタリング 81 を使用してノイズ低減が実行されました。 簡単に言うと、関数 imdiffuseest を使用して、最適な勾配しきい値と各イメージをフィルター処理するのに必要な反復回数が推定されました。 続いて、imdiffusefilt 関数に推定された最適なパラメーター値を適用して、各画像のノイズを除去しました。

最終処理ステップとして、コントラスト制限適応ヒストグラム等化を使用してコントラストが強調されました82。 adapthisteq 関数を使用すると、均一な領域の過剰増幅を避けるために、均一な分布と低いクリッピング制限を使用して、コントラストが 2 つのステップで強化されました。

すべての画像データをセグメント化するために、DragonflyTM 画像分析および深層学習ソフトウェア (バージョン 2021.1、Objects Research Systems、モントリオール、ケベック州、カナダ) が使用されました。

Bacillus subtilis str. 由来のタンパク質配列 168、Neisseria gonorrhoeae、およびHelicobacter pylori株P12は、UniProtデータベースまたは文献から入手し、補足データ1に提供されています。タンパク質BLASTを、Streptomyces viridifaciens株DSM40239（Kとしても知られる）の翻訳コード配列データベースに対してこれらの配列に対して実行しました。オフライン BLAST ソフトウェア (v. 2.12.0) を使用して、配列アクセッション番号 CP090840、CP090841、および CP090842 の viridifaciens 株 DSM40239) を取得しました。 E 値が 1 × 10−6 以下のヒットが収集されました (補足表 1)。

すべての統計は、手動で計算された 2 つの比率の Z 検定を除き、SPSS 統計ソフトウェア (IBM、バージョン 27.0) を使用して記載され、実行されました。 0.05 未満の P 値は統計的に有意であるとみなされました。 テストの仮定は、次の方法を使用して決定されました。 分散の均一性は、Levene の検定を使用して検定されました。 正規性は、コルモゴロフ – スミルノフ検定、シャピロ – ウィルク検定、および該当する場合は QQ プロットを使用して検定されました。 グラフは Graphpad Prism v. 9.0.0 または R バージョン 3.6.1 を使用して生成され、その他のグラフィック画像は Adob​​e Illustrator v. 26.3.1 または Biorender.com (2022 年 8 月にアクセス) を使用して生成されました。 標準偏差を計算し、Graphpad Prism によってプロットしました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

NCBI BLAST 検索を実行するために UniProt データベースまたは文献から取得したタンパク質配列は、補足データ 1 にアクセッション番号とともに提供されます。この論文のすべての蛍光および FIB-SEM 顕微鏡写真には、3D セグメンテーション ボリューム レンダリングの基礎となる生の FIB-SEM データが含まれます (補足ムービー 3、4)、ならびに図 3f および補足表 2 および 3 の小胞および D-TR 取り込みの定量化に使用された顕微鏡写真は、https://で利用可能なオープン サイエンス フレームワーク (OSF) データベースに寄託されています。 doi.org/10.17605/OSF.IO/5WKGJ。 BlastP 検索では、アクセッション番号 CP090840、CP090841、および CP090842 の Streptomyces viridifaciens 株 DSM40239 からヒットが収集されました。 Streptomyces viridifaciens ATTC11989 (アクセッション CP023698 は、遺伝子ノックアウト構築物の推定 K. viridifaciens comEC 開始コドンおよび終止コドンを推定するために使用されました。ソース データはこの論文に提供されます。

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RK と LZ は、オランダ科学研究機構 (NWO) の TARGETBIO プログラムによって支援されています。 SS は、オランダ科学研究機構 (NWO) から DC への Vici 助成金 (助成金番号 15812) によって支援されています。 VI.C.192.002。 COFUND プロジェクト oLife の一環として、DA は助成契約 847675 に基づく欧州連合の Horizo​​n 2020 研究革新プログラムからの資金提供を認めています。MdB、RR、DD、AA は ERC Advanced Investigator 助成金 (H2020-ERC-2017-ADV) によって支援されています。 -788982-コルミン)。 AA は NWO (VI.Veni.192.094) によってもサポートされています。 サンプルの高圧凍結に対する貢献について、Nico Sommerdijk (Radboudumc、電子顕微鏡センター) に感謝します。 デキストラン テキサス レッドを寄付してくださった Gerda Lamers 氏と Joost Willemse 氏に感謝します。

ライデン大学生物学研究所、Sylviusweg 72、2333、ライデン、オランダ

レネー・カプテイン、シュラッダ・シトゥット、レ・チャン、ジル・P・ヴァン・ヴェーゼル、デニス・クラッセン

超分子および生体材料化学部門、ライデン化学研究所、ライデン大学、Einsteinweg 55、2333、ライデン、オランダ

デニス・アシュマン & アレクサンダー・クロス

電子顕微鏡センター、ラドブードゥムク技術センター顕微鏡、ナイメーヘン、オランダ

マリット・デ・ビア、デニズ・ダビラン、ロナ・ロバーツ、アナト・アキバ

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RKとSSは実験を実施した。 LZ、SS、および RK がプラスミドを作成し、DA が脂質ナノ粒子を提供しました。 AA、MdB、RR、DD は FIB-SEM イメージングと分析を実行しました。 著者全員が実験の計画と結果の議論に貢献しました。 RK、DC、AA は、著者全員からの意見をもとに原稿を書きました。

Gilles P. van Wezel または Dennis Claessen との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Angel Manteca 氏、Katarzyna Mickiewicz 氏、その他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Kaptejn, R.、Shitut, S.、Aschmann, D. 他細胞壁欠損細菌によるエンドサイトーシス様の DNA 取り込み。 Nat Commun 13、5524 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-33054-w

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受信日: 2022 年 2 月 16 日

受理日: 2022 年 8 月 31 日

公開日: 2022 年 9 月 22 日

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