SARSの迅速な検出

Nov 14, 2023

Nature Biomedical Engineering volume 6、944–956 ページ (2022)この記事を引用

13,000 アクセス

23 件の引用

64 オルトメトリック

メトリクスの詳細

迅速な核酸検査は感染症監視の中心です。 ここでは、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の迅速検査のためのアッセイとプロトタイプのマイクロ流体デバイスへの実装について報告します。 当社が DISCoVER (コロナウイルス酵素レポートによる診断) と名付けたこのアッセイには、長期保存可能で低コストの試薬による抽出を必要としないサンプル溶解、多重等温 RNA 増幅とそれに続く T7 転写、および消光した蛍光団の Cas13 媒介切断が含まれます。 。 このデバイスは、コンパクトな機器に挿入された使い捨ての重力駆動マイクロ流体カートリッジで構成されており、アッセイの自動実行と 60 分以内の蛍光の読み出しが可能です。 DISCoVER は、唾液中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) を 40 コピー μl-1 の感度で検出でき、63 のウイルスから抽出した全 RNA を使用して検証した場合 (定量的 PCR に対して)、感度は 94%、特異性は 100% でした。鼻腔綿棒サンプル（33 個の SARS-CoV-2 陽性、サイクル閾値が 13 ～ 35）。 このデバイスは、検査されたすべての臨床唾液サンプル（13 件中 10 件の SARS-CoV-2 陽性、サイクル閾値 23 ～ 31）を正確に識別しました。 迅速なポイントオブケア核酸検査により、分子診断の用途が広がる可能性があります。

迅速なポイントオブケア核酸検出は、病気の伝播を制御するための堅牢な検査インフラストラクチャの重要な要素です。 2019 年コロナウイルス感染症 (COVID-19) のパンデミックなどの感染拡大により、集中診断検査モデルの限界とサンプルから回答までの長い時間が浮き彫りになりました。 定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) などの研究室が開発した検査は、サンプルの入手、核酸抽出、熱サイクル、およびデータ分析のための労働集約的な人員と設備インフラストラクチャを必要とする施設で実施されます。 サンプルの輸送と結果報告にかかる時間も、集中テストの所要時間に大きく影響します。 オンサイト検出と組み合わせた使いやすいマイクロ流体デバイスの開発により、迅速な分子検査の量の増加とアクセスが可能になります。

これまでのところ、原因物質である重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) による 5 億人以上の感染により、新型コロナウイルス感染症による死者は 600 万人を優に超えています。 高い無症候性感染率1、不十分な検査、分子検査の感度を高めるための狭い時間枠2,3などの無数の課題は、職場や教室への入室時など、現場での分子診断を幅広く導入することで解決できます。 また、臨床ワークフローを強化するコミュニティ監視検査には大きな可能性があり、陽性症例はより限定された臨床グレードの検査の供給に紹介されることによって確認されます。 臨床検査の標準パイプラインは RNA 抽出キットや綿棒の不足によって制限される可能性があるため、代替のサンプリング方法や検査技術も診断サプライ チェーンの多様化に役立ちます 4,5。

したがって、我々は、RNA 抽出や上気道スワブを必要とせず、迅速で自動化されたマイクロ流体ワークフローに統合できる方法の開発を模索しました。 qPCR ベースのアッセイは、サンプルを直接スパイクインする方法で以前に開発されており、通常はサンプルの溶解に高温を使用します6。 他のアプローチでは、カオトロピック剤、化学還元、RNase 阻害剤が利用されています 6、7、8、9。 さらに、唾液サンプルは鼻咽頭 (NP) スワブと 97% 一致すると報告されています 10,11。

クラスター化規則的に間隔をあけられた短い回文リピート (CRISPR) ベースの検出は、核酸診断の有望な新しいアプローチです。 これらの方法は、Cas13 または Cas12 ヌクレアーゼのガイド RNA 依存性活性化に依存して、それぞれ非特異的な一本鎖 RNA または一本鎖 DNA ヌクレアーゼ活性を誘導し、ケージド レポーター分子を切断して放出します 12、13、14。 15、16、17、18、19。 放出されたレポーターを蛍光検出器で定量的に測定し、検査結果を読み取ることができます。 CRISPR ベースの検出は特異性が高いですが、Cas13 ヌクレアーゼ単独では、診断用途でのアトモル感度に達するまでに最大 2 時間かかる場合があります 20,21。 対照的に、ループ媒介等温増幅 (LAMP) は、検出モル濃度 20 (LOD) が 20 分未満で高感度の核酸増幅を実行します。 しかし、LAMP の感度と速度にもかかわらず、そのような等温法は非特異的増幅を起こしやすいことがよくあります 22,23。

この記事では、これらの課題に対処するために、感度のための 2 つの異なる増幅機構と特異性のための Cas13 媒介プローブを組み合わせた RNA 抽出不要の検査である DISCoVER (コロナウイルス酵素レポートによる診断用) について報告します (図 1)。 変性と還元による唾液サンプルの直接溶解と不活化に続いて、LAMP 増幅に続いて T7 転写が行われ、2 層の標的増幅が提供されます。 サンプル対回答形式でウイルス CRISPR 検査を実証するために、リアルタイム検出用のコンパクトな蛍光リーダーを備えたマイクロ流体システムに DISCoVER ワークフローを統合しました。 ポイントオブケアの概念実証では、不活化時間がワークフローの律速にならないように、このデバイスによるサンプルの不活化とその後の増幅と検出を積み重ねることができます（補足図1）。

唾液などの患者サンプルは収集され、直接溶解バッファーで熱不活化された後、使い捨ての重力駆動マイクロ流体カートリッジにロードされます。 不活化ステップは、施設の規制に応じて 5 ～ 20 分の範囲です 37。 次にカートリッジは、反応汚染を最小限に抑えるために閉鎖システムで DISCoVER アッセイを自動的に実行する付属機器に挿入されます。 ステップ 1 では、最初の rLAMP 反応では、標的核酸の増幅に 2 つの機構が使用されます。 RFU、相対蛍光単位。 Cas13 酵素は、非特異的に増幅された産物よりも目的の RNA 分子を特異的に認識するようにガイド RNA を使用してプログラムされています。 ステップ 2 でのその後の Cas13 リボヌクレアーゼ活性の活性化により、CRISPR 検出から 5 分以内に飽和シグナルのレポーター分子が切断されます。 デバイスの作動時間を含め、完成したシステムでの読み出し時間は 48 分です。 カートリッジの左半分では、SARS-CoV-2 をターゲットとするガイド RNA により、アトモル濃度のウイルスを迅速かつ選択的に検出できます。 カートリッジの鏡面半分は内部プロセス制御に使用され、適切な患者サンプルの存在を確保することで陰性の検査結果を可能にします。 テンプレートの切り替えと CRISPR のプログラム可能性を活用することにより、ポイントオブケア DISCoVER システムは、多様な病原体の監視の強化に貢献できます。

DISCoVER には 30 分間の増幅ステップとそれに続く 5 分間の Cas13 読み出しが組み込まれており、未抽出の唾液サンプルでアトモル感度を達成します。 また、サンプル中に十分な細胞物質が存在することを確認するために、参照ヒト遺伝子の検出に基づくプロセス制御と増幅を多重化します。 私たちは、生きた SARS-CoV-2 ウイルスと患者の鼻腔スワブから抽出した総 RNA を含む唾液ベースのサンプル マトリックスで DISCoVER を検証し、サイクル閾値 (Ct) 値を 15 ～ 35 の範囲で検証しました。陽性的中率 (PPV) 100 を観察しました。 %、qPCR と比較した DISCoVER アッセイの陰性的中率 (NPV) は 93.75% でした。 人為的な陽性唾液サンプルは、自動検出の概念実証として統合されたリアルタイム蛍光検出を備えたマイクロ流体デバイス上でエンドツーエンドで分析されました。 オンボードのプロセス制御を使用して、陽性、陰性、無効なテスト結果を区別できるようになりました。 自動マイクロ流体システムの堅牢性をさらに検証するために、工夫された唾液サンプルが実行され、アトモル感度が示されました。 最後に、実際の患者サンプルの陽性と陰性を区別するアッセイの能力を実証するために、現場で収集された天然の臨床サンプルを装置で実行しました。 全体として、DISCoVER システムは、病原体監視のためのポータブルで迅速かつ高感度なウイルス検出を可能にします。

我々はまず、Cas13 酵素と Cas12 酵素の核酸検出特性を比較することを目指し、対応する合成酵素の希釈系列でガイド RNA スペーサー配列が一致する Leptotrichia buccalis Cas13a (LbuCas13a) およびラクノスピラ科細菌 ND2006 Cas12a (LbCas12a) のレポーター切断活性を評価しました。活性化分子（図２ａ）。 低い活性化剤濃度では、LbuCas13a の検出が LbCas12a よりも大幅に高速であることが観察されました。 このアクチベーター配列が 100 pM の場合、LbuCas13a は、それぞれの反応条件において LbCas12a よりも 30 倍以上速く半最大蛍光に達します (図 2b および方法)。 しかし、LbuCas13a の LOD は 60 分後でも依然としてフェムトモル範囲内にあり (参考文献 24)、これはポイントオブケアアッセイに関連すると考えられるサンプルから応答までの最大時間をすでに超えています。

a、さまざまな活性化剤濃度における Cas13 および Cas12 の検出動態。 線と影の領域は、n = 3 の技術的反復での平均 ± 標準偏差 (sd) を示します。 b、Cas13 および Cas12 は蛍光が最大の半分になるまでの時間を示します。 †、蛍光が半値になるまでの時間が速すぎて、信頼性の高い検出ができませんでした。 ††、最大蛍光の半分までの時間は、120 分のアッセイ実行時間内では決定できませんでした。 値は、n = 2 の技術的反復による平均値 ± SD です。 c、SARS-CoV-2ゲノム配列の概略図。LAMPプライマーセットの位置が示されている。 d、100コピーμl-1の合成SARS-CoV-2 RNAまたはNTCのLAMP増幅の代表的な蛍光プロット。 影付きの領域は、n = 3 の技術的反復での平均 ± SD を示します。 e, 合成 SARS-CoV-2 RNA または NTC をターゲットとする、9 つのスクリーニング済み LAMP プライマー セットの閾値までの時間。 増幅しなかった複製は 0 分で表されます。 エラーバーは、増幅された技術的反復の平均±標準偏差を表す、n = 4。 f、N セット 1 プライマーセットを使用した LAMP の LOD アッセイ。 増幅しなかった複製は 0 分で表されます。 エラーバーは、増幅された技術的反復の平均±標準偏差を表します、n = 4。

準モル感度を達成するために、等温増幅のための費用対効果が高く迅速な方法として LAMP を選択しました。 LAMP は、逆転写酵素、鎖置換 DNA ポリメラーゼ、および 3 セットのプライマーペアを使用して、ウイルス RNA を LAMP の DNA 基質に変換します。 SARS-CoV-2ゲノムの長さ全体にわたる異なる領域をターゲットとする9つのLAMPプライマーセットをスクリーニングしました（図2cおよび補足表1）25、26、27、28。 100 コピー μl-1 の SARS-CoV-2 ゲノム RNA 断片を標的とした場合、すべてのセットで陽性の LAMP シグナルが得られました。 すべてのプライマーセットで最大蛍光は 20 分以内に到達し、示されているように単一閾値サイクル定量化 (Cq) 決定モードを介して閾値までの時間を決定しました (図 2d)。 Orf1ab セット 1、N セット 1、および N セット 2 をターゲットとする LAMP プライマーセットは、15 分未満で一貫して増幅されました（図 2e）。

各 LAMP プライマー セットは、ウイルス RNA を含む陽性条件に比べて遅れはあるものの、テンプレートなしコントロール (NTC) シグナルをもたらしました (図 2d)。 この高い偽陽性率は、プライマーダイマー形成による可能性が考えられますが、原理的には、増幅された核酸配列を選択的に認識する 2 番目のプローブを使用することで低減できます。 したがって、我々は、LAMP 検出の感度と Cas13 ターゲット認識の特異性を組み合わせることに努めました。

Cas13 による非特異的増幅産物の検出を避けるために、ガイド RNA はプライマー配列との配列の重複を最小限に抑える必要があります。 LAMP コンカテマー化の複雑さにより、LAMP プライマーは高度に重複しており、短い標的領域を増幅して反応速度を高めます 24,29。 当社の LAMP プライマー セットは、1 ～ 60 nt の範囲の重複しないプライマー配列を持つアンプリコンを生成しました。 SARS-CoV-2 N遺伝子を標的とするNセット1は、閾値までの時間が短く、Cas13ガイドRNAに対応できるアンプリコンサイズのため、さらなる使用のために選択されました（図2eおよび補足表1）。 次に、ゲノムウイルスRNAの希釈シリーズを実行し、Nセット1のLODが25コピーμl-1であると決定しました（図2f）。これは、10〜100コピーμl-1のLODを報告した以前の研究に匹敵します（参考文献7、 30,31)。

Cas13は一本鎖RNAを標的とし（図2a）、LAMPはDNA基質を増幅するため、基質適合性を可能にするためにLAMP産物の転写を採用しました。 T7 RNA ポリメラーゼ プロモーター配列は、その後の転写と Cas13 検出のために LAMP プライマー配列に組み込まれました。 我々はこれを「LAMP増幅のRNAへの変換」または「rLAMP」と名付けました。 LAMP は 3 つのプライマー ペアを使用します。最初のターゲット鎖置換用のフォワードおよびバックワード アウター プライマー (F3/B3)、コア LAMP ステム ループ構造を形成するフォワードおよびバックワード インナー プライマー (FIP/BIP)、およびフォワードおよびリバース ループ プライマー (FLoop) /BLoop) ループベースの増幅の追加層用 (拡張データ図 1)。 プライマーの結合と伸長を複数回繰り返すことにより、これらのステムループ構造は、標的配列の逆方向反復で構成されるコンカテマーに増幅します（図3a）。

a、F3/B3 プライマーおよび FIP/BIP プライマーを使用した指数関数的 DNA 増幅のための rLAMP 機構の概略図。結果として高次の逆方向反復構造が得られます。 赤い矢印は、mBIP プライマーに挿入された T7 プロモーター配列の位置を示します。 T7 が転写されると、結果として生じる RNA には Cas13 標的配列 (オレンジ) のコピーが 1 つ以上含まれます。 b、rLAMPダンベル構造およびループプライマー上のさまざまなT7プロモーターの位置の概略図。 c、6つの異なるT7プロモーター挿入の閾値までのrLAMP時間。 増幅しなかった複製は 0 分で表されます。 エラーバーは、増幅された技術的反復の平均±標準偏差を表す、n = 4。 d、T7 媒介転写を検証するための mBIP rLAMP 製品の変性 PAGE ゲル。 AfeI は鋳型産物の crRNA 標的領域を切断し、単一の主要な転写種が得られると予想されます。 e、mBIP rLAMP 製品における T7 転写および Cas13 検出の動態。 値は、n = 3 の技術的反復による平均値 ± SD です。 f、ゲノムRNA上のmBIP rLAMP増幅の8つの技術的複製のCas13検出。異なる反応エンドポイントにおけるNTCに対する倍率変化として示されている。

LAMP (rLAMP) 後の RNA 転写を可能にするために、LAMP プライマーの 3 つの異なる領域における T7 プロモーター配列の挿入を体系的にテストしました。FIP および BIP プライマー (5' FIP/5' BIP) の 5' 末端、 FIP プライマーと BIP プライマー (mFIP/mBIP) の中央、およびループ プライマー (FLoop/BLoop) の 5' 末端にあります (図 3b)。 T7プロモーターの追加は、100コピーμl-1のウイルスゲノムRNAが与えられた場合、Nセット1の閾値までのrLAMP時間に大きな影響を与えませんでした（図3c）。 標的配列が特異的に増幅されたことを確認するために、rLAMPアンプリコン内のCas13ガイドRNA標的領域を消化するAfeIを使用して、LAMP産物に対して制限酵素消化を実行しました（補足図2a、b）。 すべての NTC 条件で AfeI 消化が存在しないことから、NTC シグナルはガイドマッチング標的配列を欠く配列の非特異的増幅に起因することが確認されました。

T7 プロモーターが rLAMP アンプリコンに適切に組み込まれ、機能するかどうかをテストするために、次に、T7 RNA ポリメラーゼを使用して in vitro 転写を実行しました。 変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）分析により、ウイルステンプレートとNTC条件によりすべてのプライマーセットでRNA転写が起こることが示されました（図3d）。 予想どおり、mBIP rLAMP 産物の AfeI 消化により、T7 プロモーターを含む単一の 147 nt 産物が生成されました (補足図 2a)。 続く T7 転写により、予想された 85 nt RNA 産物が得られました (図 3d)。

次に、単一ステップでの T7 転写と Cas13 検出をサポートするように反応バッファー条件を最適化し、その後、さまざまな rLAMP アンプリコンに T7 プロモーター挿入を含む rLAMP 製品の存在下で Cas13 切断活性を体系的にスクリーニングしました。 BIPプライマー（mBIP）挿入位置の中央が最も速い検出をもたらすと判断したため、さらなる研究のためにこのプライマーセットを選択しました（補足図3および補足表2）。 Cas13は、非特異的NTCアンプリコンの検出を回避しながら、ウイルステンプレートを使用してrLAMPアンプリコンを迅速に検出し、2分未満でNTCバックグラウンドの10倍を超えるシグナル変化を達成します（図3e）。 シグナルの飽和は 5 分以内に発生し、シグナル対バックグラウンド比が 40 以上に達しました。

DISCoVER パイプラインの再現性を確認するために、20 μl 反応中に 100 コピー μl-1 の濃度で含まれるアクチベーター RNA を使用した mBIP rLAMP 反応の 8 つの反復で Cas13 検出をテストしました。 8つの複製すべてで、NTCと比較してシグナルが>25倍増加しましたが、ここで使用した5分の検出時間を超えても安定したままです（図3f）。

増幅および検出プロトコルを整備した後、次にサンプル処理を最適化し、ウイルスの不活化を促進し、唾液中に存在する RNA 分解ヌクレアーゼの活性を弱める化学試薬と熱を組み合わせた単純なプロトコルを確立しました。 イオンキレーターであるエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (参考文献 7、8)、界面活性剤やプロテイナーゼを含む QuickExtract バッファーなどの市販の試薬と組み合わせた、保存安定性の還元剤であるトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン (TCEP) の 2 つの濃度をアッセイしました。 、およびカオトロピック グアニジン チオシアネートを含む DNA/RNA シールド。

これらの不活化試薬とrLAMPとの適合性をテストするために、75℃で熱処理した唾液に試薬を添加し（参考文献33）、2つの異なる濃度でSARS-CoV-2ゲノムRNAを添加することにより、疑似陽性唾液サンプルを作成した。 1,000 コピー µl-1 および 200 コピー µl-1。 不活化試薬が存在しない場合、rLAMPシグナルは検出できず、サンプル中に存在する内因性RNaseによる唾液中のRNAの分解が示唆されました（図4a）。 対照的に、唾液を含まないゲノム RNA は 15 分未満で急速に増幅されました。 TCEP-EDTAの低濃度条件のみが標的RNAを保護し、4つの複製すべてでrLAMP感度を維持しました（図4a）。 この試薬カクテルは、タンパク質のジスルフィド結合を切断し、二価カチオンを封鎖します。 その活性は、RNase 活性を弱めると同時にムチンゲルの形成を妨害し、より簡単なサンプル処理のために変動する唾液の粘度を低下させると期待されています 34,35。

a, 直接唾液溶解条件は、DISCoVER ワークフローとの互換性についてテストされました。 増幅しなかった複製は 0 分で表されます。 エラーバーは、増幅された技術的反復の平均±標準偏差を表す、n = 4。IA、不活化試薬。 QE、クイック抽出。 b、分析感度を決定するための、人為的な唾液サンプルの生成、RT-qPCRによる定量化、DISCoVERによる検出の概略図。 c、Cas13検出5分におけるSARS-CoV-2陽性唾液サンプルのNTCに対するDISCoVERシグナルの変化倍数。 エラーバーは、n = 20 の生物学的複製での平均 ± SD を示します。 d、2019年11月以前に採取された30個の陰性唾液サンプルにおける、Cas13検出5分における、NTCと比較したDISCoVERシグナルの変化倍数。

次に、唾液サンプルに対する DISCoVER の分析感度と特異度を決定することにしました (食品医薬品局、2020)。 LOD を決定するために、ウイルスストックを培地で連続希釈し、合成ゲノム RNA から作成した標準曲線と比較して逆転写を伴う qPCR (RT-qPCR) で定量しました。 これらの既知濃度のウイルスは、2019 年 11 月以前に BSL3 条件で収集された陰性唾液サンプルにスパイクされ、DISCoVER ワークフローで実行されました (図 4b)。 一連のウイルス濃度に対して DISCoVER 複製を 20 回実行し、少なくとも 19/20 複製が増幅された、直接溶解した唾液中のウイルスの 40 コピー µl−1 がテストされた最低濃度であると決定しました (図 4c)。 DISCoVERの特異性を評価するために、SARS-CoV-2陰性の30人の異なる個人からの唾液サンプルを、偽陽性シグナルなしで検査しました（図4d）。 インフルエンザA H1N1およびH3N2、インフルエンザBおよびヒトコロナウイルスOC43合成RNAの添加は、SARS-CoV-2の検出を阻害せず、非特異的検出も生じず、このアッセイの特異性をさらに検証した（補足図4a）。 。 さらに、伝染性の高いB.1.1.7変異体36を含む、懸念される複数のSARS-CoV-2変異体についてDISCoVERを検証しました（補足図4b）。

ポイントオブケア設定では、サンプルの不活化と溶解は内部プロセス制御によって確認されるのが理想的です (図 5a)。 一部の個人ではサンプル中に高粘度またはムチンゲルが含まれている可能性があるため、これは唾液ベースの集団スクリーニングにとって特に重要です。 食品医薬品局のガイドラインによれば、サンプルが SARS-CoV-2 陰性であるかどうかを判定するには、適切なサンプル収集、核酸抽出、アッセイ設定、試薬の機能を示しながら、確実な内部プロセス管理が必要です ('CDC 2019- nCoV リアルタイム RT-PCR 診断パネル - 使用説明書; https://www.fda.gov/media/134922/download)。 臨床検体の内部プロセス管理が陰性の場合、SARS-CoV-2 が検出されない限り、その結果は無効であると見なされるべきであり、SARS-CoV-2 が検出された場合、サンプルは陽性と推定されます。 これを達成するために、N 遺伝子とヒト RNase P 遺伝子の両方のプライマーを rLAMP ステップに追加することで増幅を多重化しました。 その後の唾液サンプル上の RNase P の Cas13 検出は 5 分以内に飽和に達しました (図 5b)。

a、SARS-CoV-2 (N 遺伝子) およびヒト内部対照 (RNase P) プライマーセットを使用した rLAMP 多重化の概略図。 b、多重化rLAMP後のSARS-CoV-2陽性唾液サンプルのDISCoVERシグナル。 値は、n = 3 の技術的反復による平均値 ± SD です。 c、Cas13検出5分における30の陰性臨床鼻サンプルにおけるNTCに対するDISCoVERシグナルの変化倍数。 d、Cas13検出5分における33の陽性臨床鼻サンプルにおけるNTCに対するDISCoVERシグナルの変化倍数。

ソースデータ

次に、患者の呼吸器綿棒サンプルから抽出したトータル RNA で DISCoVER を検証しました。 CLIA 検査ラボ 37 で RT-qPCR によって以前に検査された 30 個の陰性検体と 33 個の陽性検体 (Ct 値 13 ～ 35) からの残りの RNA が、DISCoVER ベンチトップ アッセイのインプットとして使用されました。 (図5c、d)。 Cas13 検出から 5 分以内に、30 個の陰性サンプルのうち 30 個を正しくコールすることができました。これらのサンプルでは N 遺伝子は検出されませんでしたが、RNase P シグナルは確実に検出されました。 重要なのは、同じ期間内に 33 個の陽性サンプルのうち 31 個で N 遺伝子が検出されたことです。 2 つの偽陰性検体では、RNaseP は検出されましたが、N 遺伝子は検出されず、2 つのアッセイ間の LOD の違いが示唆されました。 臨床サンプル データセットに基づいて、抽出された RNA に対する DISCoVER の感度は 93.9%、特異性は 100% であると報告しています。 さらに、PPV が 100%、NPV が 93.75% であることがわかります。

最後に、我々は、ポイントオブケアアプリケーションにつながる環境でアッセイを実行するための、コンパクトでポータブルなマイクロ流体デバイスを開発しました。 この化学反応は、温度制御された反応チャンバーと検出チャンバーを備えた重力駆動のマイクロ流体カートリッジ上で実行されるように適合されました（図6a）。 このデバイスには、流体の流れを制御するための空気置換ポンプ、rLAMP チャンバー用の抵抗ヒーター、および Cas13 チャンバーの冷却および加熱用の熱電冷却器/ヒーター (TEC) が含まれています (図 6b)。 アッセイの蛍光検出は、リアルタイムサンプル読み取り用のコンパクトなカスタム検出器によって実行されました。

a、左: カートリッジが挿入される最終的な器具の図。 挿入図は、マイクロ流体重力駆動カートリッジ全体の写真を示しています。 右: サンプル計量および rLAMP 反応チャンバー (1)、rLAMP 計量および Cas13 混合チャンバー (2)、および検出チャンバー (3) の画像。 b. 検出システム、ヒーター、空気駆動バルブ、機械バルブを含む機器コンポーネントの前面 (左) と背面 (右) の図。 c、カートリッジ機能の概略図。 反応は、唾液測定 (1)、増幅反応 (2)、増幅後の測定 + Cas13 ミックス (3)、検出チャンバーでの Cas13 反応 (4) の 4 つのステップで分離できます。 カートリッジに保存された試薬は、反応の早期開始を避けるために独自の疎水性溶液を介して分離されます。 LAMP 反応後、サンプルを 2 つの反応に分割できます。カートリッジの左側はサンプルを N 遺伝子 crRNA に曝露し (ステップ 3a)、カートリッジの右側は RNase P crRNA のみを含む内部コントロールとして機能します。 (ステップ3b)。 唾液サンプルはステップ 3a のみを通過しましたが、臨床サンプルはステップ 3a と 3b を通過しました。

マイクロ流体カートリッジは、陽性または陰性の唾液サンプル検出のために開発されました（図6c）。 カートリッジアッセイ設計の最初の反復では、不活化 (75 °C で 30 分間) 陽性の市販唾液サンプルをカートリッジにロードし、rLAMP チャンバーに能動的に計量され、そこで N 遺伝子プライマーおよび rLAMP マスターミックスと混合されます。 次に、Cas13 試薬を TEC で 25 °C に維持しながら、溶液を 65 °C で 30 分間加熱します。 rLAMP 反応の終了時に、チャンバーの下のアクティブ バルブが開き、重力によって増幅された溶液 4 μl が計量チャネルに流れることが可能になります。 左側のチャネル (図 6c、ステップ 3a) のみが開いており、Cas13 試薬とその N 遺伝子を標的とする CRISPR RNA (crRNA) が計量チャネルを通って混合チャンバーに押し込まれ、そこで 37 °C に加熱されました。 ℃で10分間。 右チャネル (図 6c、ステップ 3b) は、カートリッジの新しいバージョンに追加されました。 rLAMP 溶液と混合した Cas13 を検出チャンバーに吸引し、蛍光検出器を使用して反応をモニタリングしました。 マイクロ流体の作動時間は、オンボードアッセイ全体にわたって約 8 分でした。 開始から終了まで（不活化ステップを含む）78分の反応時間で、全唾液中のSARS-CoV-2ゲノムRNAの200から40コピーμl−1の一連の希釈系列の検出を実証します（図7a）。 。 これは、DISCoVER が唾液サンプルから SARS-CoV-2 RNA をアトモル感度で検出できる、このマイクロ流体システムの潜在的なポイントオブケア応用を示しています。

a、NTCと比較した陰性および陽性の唾液サンプルのDISCoVERシグナルの変化倍数を示すヒートマップ。 b、鼻腔スワブからのSARS-CoV-2 RNA陽性および陰性臨床サンプルのNTCと比較した倍率変化を示すヒートマップ。 qPCR 検出による N 遺伝子ターゲットの Ct 値がヒート マップ軸にリストされます。 c、NTC（左）、陰性（中央）、陽性（右、Ct 16）サンプルにおける両方の検出チャンバー（RNase Pは青、N遺伝子は赤）の生の蛍光を経時的に示すグラフ。 各プロット内の挿入図は、NTC カートリッジ (ウイルスサンプルなし)、陰性および陽性の臨床サンプル (RT-qPCR Ct が 16 ～ 21 の範囲) の検出チャンバーの蛍光画像です。 左側の検出チャンバーは N 遺伝子検出に特異的であるのに対し、右側のチャンバーは RNase P に特異的です。 d、10 個の臨床唾液サンプルと 3 個の陰性臨床唾液サンプルに対するオンボード DISCoVER の結果。 倍率増加は空のカートリッジに対して計算されます。 50 分でブランクカートリッジに比べて蛍光が 2 倍増加することが、実験的に決定された陽性結果の基準でした。 5 分時点でこの閾値を下回る値を持つサンプルは陰性と宣言されました。

ソースデータ

次に、rLAMP ステップ中に N 遺伝子と RNase P の両方の検出を多重化し、内部プロセス制御を追加することでカートリッジ設計を最適化しました (図 6c のステップ 3b)。 増幅反応を 2 つの Cas13 検出チャンバーに分割する前に、多重化 rLAMP を実行しました。それぞれのチャンバーには、N 遺伝子 (左チャンバー、ステップ 3a) または RNase P (右チャンバー、ステップ 3b) rLAMP アンプリコンのいずれかをターゲットとする単一の crRNA が含まれています (図 6c)。 。

次に、3 つの陰性と 3 つの陽性 (Ct 16 ～ 21) の呼吸器臨床サンプルからの RNA を完全な DISCoVER デバイスで再テストしました (図 7b)。 3つの陽性検体すべてでSARS-CoV-2を正しく検出し（図7c、下）、3つの陰性検体すべてでRNase Pシグナルのみを検出しました（図7c、中央）。 ウイルスサンプルを含まない NTC カートリッジを最初に実行してベースライン蛍光を測定し、ベースラインからの陽性サンプルの変化倍数を測定できるようにしました (図 7c、上)。

このシステムの堅牢性と再現性を実証するために、DISCoVER デバイスでさらに 25 個の人為的サンプルを実行しました (500 コピー μl-1 で 20 個の人為的陽性サンプルと、0 コピー μl-1 で 5 個の予想陰性サンプル) (拡張データ図 2) ）。 市販の唾液サンプルから作られた人工検体全体で堅牢なプロセス制御を可能にするために、rLAMP ステップで RNase P プライマーの代わりにヒト ACTB (β-アクチン) 遺伝子プライマーを使用することで、オフボードおよびオンボードの多重増幅を最適化しました (拡張データ図) .2a、b)。 工夫された唾液サンプルでは、​​不活化ステップを 95 °C で 5 分に短縮することができ、サンプルを含む全体のアッセイ時間を約 50 分に短縮するために、計量ステップのない簡素化されたカートリッジ (拡張データ図 2c) を設計しました。不活化38とマイクロ流体の作動時間。 オンボードシグナルがバックグラウンドに対して少なくとも2倍変化するサンプルを陽性と呼び、その閾値に達しないサンプルを陰性とみなしました（拡張データ図2d）。 次に、RT-qPCRでCOVID-19の検査で陽性と判定された個人から採取した10個の天然臨床唾液サンプルと、陰性と判定された個人から採取した3個の天然臨床唾液サンプルでデバイスを検証しました（図7dおよび補足表5）。 現場で収集された唾液サンプルに関する環境衛生および安全性ガイドラインにより、サンプルの不活化時間は 95 °C で 20 分に延長され、この検証の合計アッセイ時間は 63 分になりました。 現場で収集された 13 個の臨床唾液サンプルと 25 個の人工市販サンプルはすべて、ユーザーの介入を最小限に抑えた完全自動マイクロ流体システム上でアトモル感度で正しく検出されました (補足ビデオ)。

私たちは、RNA 抽出を必要としない検出ワークフローを開発し、未抽出の唾液中の SARS-CoV-2 RNA のアトモル検出を実証しました。 DISCoVER アッセイは、30 分間の rLAMP ステップとそれに続く T7 転写および Cas13 ベースの検出を組み合わせて、アトモル感度と高い特異性を備えた迅速な検査プロトコルを作成します。 各修飾LAMP産物は転写開始の基質として機能することができるため、ナノモルの基質濃度が急速に生成されるため、最大Cas13シグナルは5分以内に到達します（補足図3）。 高感度な核酸増幅と CRISPR 媒介の特異性およびプログラム可能性を組み合わせることで、多様な病原体検出のための柔軟な診断が可能になる可能性があります。

私たちは、ポイントオブケア診断の重要なステップを可能にすることを目的として、最初に未抽出の唾液で DISCoVER システムを実証しました。 唾液ベースのアッセイはサンプル採取に医療従事者を必要としない可能性があるため、NP スワブよりも好ましく、サンプル採取の快適性の向上により、おそらく患者のコンプライアンスと頻繁な検査への取り組みが促進されるでしょう。 また、唾液サンプルのウイルス力価は NP 綿棒と同等であるため、唾液は地域監視における無症候性検査の信頼できるサンプル マトリックスであることが示されています 11。 サンプリングのサプライチェーンを多様化するために、DISCoVER は NP 綿棒や自己投与鼻腔綿棒などの他のサンプルにも適用できます。

DETECTR や STOPCovid V2 などの他の CRISPR 検出法と比較して、DISCoVER はサンプル抽出または精製ステップを採用していない 39,40 ため、同等の感度を維持しながら市販の RNA 抽出キットへの依存を排除​​します。 ここで使用される直接溶解法は、単純で低コストで広く入手可能で室温で安定な化学還元およびイオンキレート化のための一般的な試薬を利用します。 DISCoVER は、ウイルス RNA の抽出と精製を含む他の CRISPR ベースの検出アッセイと比較して、アトモル感度を維持します 20,39,41。

さらに、DISCoVER が SARS-CoV-2 の複数の変異株、特に感染力が高まる可能性があるため広く医学的に関心が寄せられている懸念される B.1.1.7 変異株を検出する能力を検証します 36。 変異体特異的な DISCoVER プローブ セットの追加開発により、懸念される 1 つの変異体を別の変異体よりも選択的に検出できる可能性があります。 ここでは、可能な限り多くの SARS-CoV-2 変異体を検出するように設計されたプライマーを使用して、汎 SARS-CoV-2 監視用に最適化しました。 DISCoVER の特異性をさらにテストするために、インフルエンザ A H1N1 および H3N2、インフルエンザ B、ヒトコロナウイルス OC43 など、他の一般的な呼吸器病原体からのウイルス ゲノム RNA の相互認識をアッセイしました。 DISCoVER の動態や特異性に対する顕著な影響は観察されませんでした。

また、DISCoVER 増幅段階でヒト内部対照を使用した多重 SARS-CoV-2 検出も実証します。 これは、それぞれが異なる蛍光チャネルの特定のレポーターに作用する直交切断モチーフを持つ追加の Cas 酵素を使用して、マルチカラー検出に拡張できます 42。 高次多重化は、インフルエンザ A 型および B 型、および 1 回の検査で検出することが望ましいその他の一般的な呼吸器ウイルスに対してさらに開発できます。 DISCoVER のコア酵素が RNA 配列と DNA 配列の間で変換する固有の能力は、プロトコールによって不活化および溶解された病原体を検出できることを意味します。

33 人の陽性患者サンプルと 30 人の陰性患者サンプルで DISCoVER を検証し、鼻腔スワブから抽出された総 RNA の PPV が 100%、NPV が 93.75% であると報告しました。 Ct 値が 13 ～ 35 の範囲のサンプルについては、qPCR 検査と比較して 100% の特異性と 93.9% の感度が観察されました。最後に、DISCoVER とマイクロ流体システムおよび検出デバイスの統合を実証します。 シンプルな加熱および冷却要素と空気置換ポンプを備えた重力駆動マイクロ流体カートリッジは、不活化を含め、リアルタイムの蛍光読み取りにより、人工陽性の唾液と患者サンプルの両方に対して DISCoVER ワークフローを 50 分未満で実行できます。 このアセンブリのさらなる開発と展開は、頻繁な現場での分子診断を大幅に促進するポイントオブケアシステムに向けた可能性を示しています。

ラクノスピラ科細菌 ND2006 Cas12a (LbCas12a) の場合、crRNA およびアクチベーター DNA は Integrated DNA Technologies (IDT) によって合成されました。 Cas12a による検出は、1 × NEB 2.1 バッファー (B7202S)、100 nM LbCas12a タンパク質、100 nM crRNA、さまざまな濃度 (100 nM、100 nM、10 nM、1 nM、100 pM および 10 pM) の二本鎖 DNA を使用して実行されました。アクチベーターと 200 nM DNaseAlert (IDT)。 LbCas12a と crRNA を 1:1 のモル比で 10 倍の濃度で事前混合し、反応液に添加する前に室温で 15 分間インキュベートしました。 Tecan Spark マルチモードマイクロプレートリーダーで 15 秒間隔で検出しながら、反応物を 37 °C で加熱しました。 バックグラウンドの減算では、アクチベーターを含まない反応の蛍光値を、各時点でのサンプル反応の蛍光値から減算しました。 最大の蛍光は、DNase I および 200 nM DNaseAlert を 1 × NEB 2.1 バッファーと混合することによって得られました。 この飽和最大蛍光値は半分に分割されました。 この蛍光の最大値の半分に達するまでの時間を、活性化剤の各濃度について計算しました。

Leptotrichia buccalis Cas13a (LbuCas13a) の場合、crRNA とアクチベーターは Synthego から商業的に合成されました。 Cas13a による検出は、1× Cas13 反応バッファー、100 nM LbuCas13a タンパク質、100 nM crRNA、さまざまな濃度 (100 nM、100 nM、10 nM、1 nM、100 pM、および 10 pM) の一本鎖 RNA および 200 nM を使用して実行されました。 Cas13 レポーター (IDT)。 LbuCas13a と crRNA を 10 倍濃度で 1:1 の比率で事前混合し、反応液に添加する前に室温で 15 分間インキュベートしました。 反応の残りの部分、および最大蛍光の半分までの時間を、上記のように実行または分析した。 最大の蛍光は、RNase Aおよび200 nM Cas13レポーターを1×緩衝液と混合することによって得られました。 5× Cas13 反応バッファー (pH 6.8) は、100 mM HEPES-Na pH 6.8 (Sigma)、250 mM KCl (Sigma)、25 mM MgCl2 (Sigma)、および 25% グリセロール (Thermo Fisher) で構成されています。

Leptotrichia buccalis Cas13a (LbuCas13a) の発現と精製は、前述のとおり 24 に修正を加えて実行しました。ここで要約します。His6-MBP-TEV タグ付き Cas13a は、37 °C の TB で増殖させた大腸菌ロゼッタ 2 (DE3) で調製されました。 OD600 が 0.6 ～ 0.8 の場合、培養物を氷上で 15 分間冷却した後、0.5 mM イソプロピル β-d-1-チオガラクトピラノシドで誘導し、16 °C で一晩発現させました。 50 ml Falcon チューブ内の 10 ml 近くの細胞ペレットを、それぞれ 100 ml の溶解バッファーに再懸濁しました。 可溶性 His6 – MBP – TEV Cas13a を 15,000 g での遠心分離によって清澄化し、5 ml HiTrap NiNTA カラム (GE Healthcare) にロードし、高速タンパク質液体クロマトグラフィー (ÄKTA Pure) により直線イミダゾール (0.01 ～ 0.3 M) 勾配で溶出しました。 。 一晩の透析およびTEV消化の後、LbuCas13aはイオン交換およびMBPの除去による精製を受けた(5 ml HiTrap SP、MBPトラップHP、GE Healthcare)。 最後に、ゲル濾過緩衝液に 1 mM TCEP を添加してサイズ排除クロマトグラフィーを実行し (S200 16/60、GE Healthcare)、ピーク画分をプールし、濃縮して PCR ストリップ チューブに分注し、液体窒素で瞬間凍結しました。

ラクノスピラ科細菌 ND2006 Cas12a (LbCas12a) の発現と精製は、TEV プロテアーゼ 43 による His タグ除去中のタンパク質の沈殿を防ぐために、透析バッファーに 1 mM EDTA を添加して、前述のように実行されました。

LAMP および rLAMP DNA 増幅反応は、2× LAMP Mastermix (NEB、E1700)、0.4 μl LAMP 色素 (NEB、E1700)、2 μl の 10× プライマーミックス (IDT; 16 μM の FIP/BIP、4 μM FLoop/ BLoopおよび2μMのF3/B3)、および7.6μlのサンプル。 8 マイクロリットルのサンプルを、色素を添加しない反応に添加しました。 多重化LAMPの場合、BIP 5'プライマー上にT7プロモーターを有するRNase Pプライマー1μlを20μl反応液に添加した。 検出は、CFX96 Touch リアルタイム PCR 装置 (Bio-Rad) または QuantStudio 3 リアルタイム PCR システム (Thermo) を使用して、65 °C で 30 ～ 60 分間実行されました。 しきい値までの時間は、単一しきい値分析モードを使用して計算されました。 LAMP の LOD は、サンプルの少なくとも 95% で増幅が観察された濃度として決定されました。 臨床サンプルの LAMP 増幅反応は、20 μl 反応中に 2× LAMP Mastermix、2 μl の 10× N 遺伝子プライマーミックス、1 μl の RNase P プライマーミックス、および 5 μl のサンプルを使用して実施しました。

Twist Synthetic SARS-CoV-2 RNA Control 2 (Twist Bioscience、SKU 102024) をテンプレートとして使用して、プライマー スクリーニングを実行し、LOD 範囲を確立しました。 使用するテンプレートの量と反応中のテンプレートの最終濃度は、ベンダーから提供された初期濃度 106 コピー μl-1 に基づいて計算されました。

ｒＬＡＭＰ ＤＮＡ産物の制限消化は、２μｌのＡｆｅＩ（ＮＥＢ Ｒ０６５２Ｌ）、２μｌの１０×ＣｕｔＳｍａｒｔバッファーおよび１３μｌの水を使用して、３μｌの増幅されたｒＬＡＭＰ産物に対して行われた。 この 20 μl の反応液を 37 °C で 30 分間加熱しました。 未消化および消化されたrLAMP産物を、4μlの1Uμl-1RQ DNase Iおよび1μlの10×反応緩衝液(Promega、M6101)で処理した。 反応物を37℃で30分間加熱し、1μlのSTOP溶液(Promega M6101)を添加し、続いて65℃で10分間インキュベートした。 rLAMP 製品は、15% TBE-尿素ゲル (Thermo Fisher、EC68855BOX) を使用して分析されました。

SARS-CoV-2 陰性の唾液 (Lee Biosolutions、991-05-S-25) を使用して、唾液と DISCoVER ワークフローの互換性をチェックしました。 ベンダーに従って、すべての唾液サンプルは 2019 年 11 月より前に収集されました。 ウイルス合成 RNA を使用する場合、Twist Synthetic SARS-CoV-2 RNA Control 2 (SARS-CoV-2 分離株 Wuhan-Hu-1) を市販の唾液に添加し、模擬サンプルのテンプレートとして使用しました。 LOD 測定では、BSL-3 封じ込め下で SARS-CoV-2 ウイルスの種ストックを陰性唾液バックグラウンドにスパイクし、模擬サンプルのテンプレートとして使用しました。

市販の唾液を溶解試薬と混合し、ヒートブロックを使用して 75 °C で 30 分間、または 95 °C で 5 分間加熱しました。 唾液の熱不活化が完了した後、Twist Synthetic RNA を添加しました。 熱不活化の前に、BSL3施設でウイルス種ストックを唾液に添加した。 不活化試薬１は、唾液と混合した場合の１×濃度の２．５ｍＭ ＴＣＥＰ／１ｍＭ ＥＤＴＡであった。 不活化試薬２は、唾液と混合した場合の１×濃度の１００ｍＭ ＴＣＥＰ／１ｍＭ ＥＤＴＡであった。 不活化試薬 3 は Quickextract DNA (Lucigen QE09050)、不活化試薬 4 は Quickextract RNA (Lucigen QER090150)、不活化試薬 5 は RNA/DNAShield (Zymo 76020-420) でした。

サリナスバレーの農場労働者の研究から現場で収集された臨床唾液サンプルを、95 °C に設定したビーズバスで 20 分間溶解しました。 参考文献によると。 37 に示すように、市販の唾液から作られた人為的なサンプルに使用される不活化時間はここでも使用できますが、カリフォルニア大学バークレー校の環境、健康、安全性 (EH&S) が臨床サンプルの不活化プロトコルに課した制限のため、これをテストすることができませんでした。

LOD を決定するために、Vero-E6 細胞 (ATCC) で一度増幅された SARS-CoV-2 (USA-WA1/2020; BEI Resources、NR-52281) ウイルスストックを培地 (DMEM + 10% FBS + 1% ペニシリン) で希釈しました。 –ストレプトマイシン)を使用してさまざまな濃度を取得し、唾液にスパイクし、1×の低TCEP/EDTA不活化試薬を添加し、サンプルを75℃で加熱することによって不活化します。 培地中のウイルス希釈液は、EH&S要件（UC Berkeley）に準拠するために75℃で30分間加熱することによって不活化され、Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit（NEB E3006）およびE遺伝子を使用してRT-qPCRが実行されました。 -ウイルスRNAの最終濃度を決定するためのターゲティングプライマー。 合成ゲノム RNA フラグメント (Twist Synthetic SARS-CoV-2 RNA Control 2) を使用して、計算用の標準曲線を取得しました。 倍率変化（テンプレートなしの対照の蛍光値に対するサンプルの蛍光値の比）が5分以内に2を超える場合、モックサンプルは陽性として検出されました。 模擬サンプルの LOD は、サンプルの少なくとも 95% で検出があった濃度として決定されました。

呼吸器綿棒サンプルから抽出された RNA は、Innovative Genomics Institute (IGI) Clinical Laboratory から入手しました。 これらの検体は SARS-CoV-2 の診断目的で収集され、LuNER アッセイ 37 が以前に実施されていました。 簡単に説明すると、呼吸器検体は医療提供者によって患者 (中咽頭、前鼻孔、または中鼻甲介) から収集されました。 RNA は、MagMAX ウイルス/病原体核酸分離キット (Thermo Fisher A42352) に基づく自動ワークフローを使用して IGI Clinical Laboratory で抽出され、N および E 遺伝子と RNaseP についてアッセイされました。 ここで説明する実験のために、標本は匿名化され、抽出された RNA には臨床 Ct 値が提供されました。

我々は、Cas13 検出開始 5 分における陽性シグナルと陰性対照間の 2 倍の変化が、人為的な陽性唾液サンプルと予想される陰性唾液サンプルを区別するのに十分であると判断しました。 この実験的に導出された閾値は、臨床サンプルの陽性と陰性を判定するために使用されました。 N 遺伝子とプロセス制御シグナルの両方の変化倍数が 5 分以内に 2 倍を超えた場合、サンプルは陽性と判定されます。 たとえプロセスコントロールが 2 倍の変化を示さなかったとしても、N 遺伝子が 5 分以内に 2 倍の変化を示した場合、サンプルは陽性と判定されます。これは、唾液中のヒト細胞物質の損失または分解を示している可能性があるためです。 N 遺伝子シグナルが現れず、プロセスコントロールが 5 分以内に 2 倍を超える変化を示した場合、サンプルは陰性であると判断されます。 N 遺伝子とプロセス制御倍数変化の両方が 2 未満の場合、テストは無効であると見なされます。

SARS-CoV-2 を標的とする LbuCas13a ガイドは、感度、特異性、予測される二次構造を優先して設計されました。 SARS-CoV-2参照ゲノム（wuhCor1）のNセット1アンプリコン領域内で、順方向鎖と逆方向鎖の両方を標的とする、20ヌクレオチドの26個の候補スペーサーが同定された。 感度は、GISAID から入手可能な SARS-CoV-2 ゲノムと参照ゲノムをペアワイズアラインメントし、各候補スペーサーについてサンプルと参照ゲノム間の不一致の数を計算することによって決定されました。 次に、各スペーサーによって検出された SARS-CoV-2 ゲノムの割合（不一致が 1 つ以下）が計算され、SARS-CoV-2 ゲノムの 99% 未満と一致したスペーサーは廃棄されました。 特異性を確保するために、感受性があると判断された候補スペーサーを、ヒトコロナウイルスの他の参照ゲノム、特に SARS、MERS、229E、NL63、OC43、および HKU1 とアラインメントしました。 これら他のコロナウイルスのいずれかと一致し、不一致が 2 つ以下のスペーサーは破棄されました。 残りのスペーサーもヒト トランスクリプトームに合わせて整列させ、やはり 2 つのミスマッチを許容し、ガイドがオフターゲットのヒト転写産物に相補的でないことを保証するために、整列したスペーサーは廃棄しました。 スペーサー配列が Cas13a のダイレクト リピート足場への結合を可能にすることを保証するために、連結したリピートとスペーサー配列を RNAfold を使用して折り畳んで、ダイレクト リピートの正しいヘアピン構造とスペーサー配列の一本鎖性を評価しました。 私たちの感度、特異性、構造基準を満たした 5 つの考えられる SARS-CoV-2 スペーサーのうち、1 つがガイド RNA として使用するために選択されました。 SARS-CoV-2 とヒトの転写産物の一致を回避し、適切な RNA 構造を確保するために、RNase P をターゲットとするコントロール ガイドが同じ基準で選択されました。 検証実験 (図 7d および拡張データ図 2d) では、市販サンプルと臨床サンプルの間の唾液組成の違いにより、rLAMP にヒト ACTB 遺伝子プライマーを使用することにより、多重化増幅がオフボードおよびオンボードで最適化されました。 RNase P プライマーの代わりにステップを実行します。 ACTB ガイドは、N セット 1 および RNase P と同じパイプラインを使用して選択されました。

転写は、1 mg ml-1 の T7 ポリメラーゼ 2 μl、100 mM NTP ミックス (NEB N0450) 4 μl、200 mM DTT 1 μl、5x 転写バッファー 4 μl、 LAMP 製品と 7 μl の水。 この 20 μl の反応液を 37 °C で 30 分間加熱しました。 5x 転写バッファーは、150 mM Tris-Cl、室温で pH 8.1、125 mM MgCl2、0.05% Triton X-100 (Sigma Aldrich、X100)、および 10 mM スペルミジンで構成され、-20 °C で保存されます。

Cas13 検出は、1:100 に希釈した LAMP 転写産物 2 μl、5× Cas13 反応バッファー 1 μl、2 μM C​​as13 レポーター 2 μl、10× リボ核タンパク質 (RNP) 2 μl、13 μl を使用して 20 μl 反応として実行しました。 1×Cas13反応バッファー。 １０×ＲＮＰは、Ｃａｓ１３：ｃｒＲＮＡの２：１比として、Ｃａｓ１３の最終濃度２０ｎＭとして作製し、反応物に添加する前に室温で１５分間インキュベートした。 この 20 µl の反応液を 37 °C で加熱し、FAM チャネル (励起 485 nm、発光 535 nm) を使用して TECAN Spark マルチモード マイクロプレート リーダーで 30 秒ごとに読み取りました。

ワンポット T7 および Cas13 は、1 mg ml-1 の T7 ポリメラーゼ 2 μl、20 mM NTP ミックス、10 mM DTT および 25 mM MgCl2 を Cas13 反応ミックスと組み合わせることによって実行されました。 1:100 希釈の rLAMP 製品 2 マイクロリットルを、20 μl のワンポット T7-Cas13 反応に使用します。 臨床サンプルの検査では、20 μl のワンポット T7-Cas13 反応に 2 μl の 1× rLAMP 製品が使用されます。

インフルエンザ A H1N1 (Twist Bioscience、SKU 103001)、インフルエンザ A H3N2 (Twist Bioscience、SKU 103002)、インフルエンザ B (Twist Bioscience、SKU 103003)、およびヒト コロナウイルス OC32 (Twist Bioscience、SKU 103013) の合成ウイルス RNA を不活化されたウイルスにスパイクしました。唾液（Lee Biosolutions、991-05-S-25）、Twist Synthetic SARS-CoV-2 RNA Control 2 の有無にかかわらず。上記の rLAMP およびワンポット T7 転写を、N 遺伝子 crRNA を用いて実行しました。

SARS-CoV-2 バリアント B.1.1.7_710528 コントロール 14 (Twist Bioscience、SKU 103907) および SARS-CoV-2 バリアント B.1.1.7_601443 コントロール 15 (Twist Bioscience、SKU 103909) の合成ウイルス RNA を不活化唾液にスパイクしました。 (Lee Biosolutions、991-05-S-25)。 上述のｒＬＡＭＰおよびワンポットＴ７転写を、Ｎ遺伝子ｃｒＲＮＡを用いて実施した。

プロトタイプの機器は Wainamics Inc. によって設計および製造されました。この機器は、システムの実現可能性を実証するために特別に設計され、製造可能な最終用途の機器への容易な移行を可能にする機能を備えていました。 既製のコンポーネント、カスタム設計コンポーネント (SolidWorks で設計)、Teensy 3.2 マイクロコントローラをベースにしたカスタム電子ボード、およびカスタム ソフトウェア (C で書かれた) の組み合わせを統合して、プロトタイプの機器を製造しました。 このシステムは、自動化された方法でプロトタイプの熱可塑性デバイスに搭載されたアッセイの実現可能性を実証することを目的としていました。 すべての設計要素が一般的に使用される大量生産方法 (たとえば、型抜き、射出成形など) に確実に移行できるように注意が払われました。

プロトタイプ システム用のカスタム設計コンポーネントは、アルミニウムおよびデルリン コンポーネントの商用コンピュータ数値制御 (CNC) 加工 (Protolabs)、溶融堆積モデリング (FDM) 3D プリンティング (Dremel 3D45)、光造形 (SLA) 3D などの一般的な製造方法を使用して製造されました。印刷 (Formlabs Form3)。 使用した市販のコンポーネントは、8 方向ロータリー バルブを備えた Norgren Kloehn V6c シリンジ ポンプ、Burkert Type 6724 3 方向ソレノイド バルブ、Marlow Industries TEC ユニットを制御する Laird Thermal Systems 温度コントローラー (TC-XX-PR-59) で構成されています。 (NL2064T-11AB)、制御ファン (Sunon Fans MF25101V1-1000U-A99)、および抵抗カートリッジ ヒーター (E3D、12 V 40 W)。 Windows 10 PC 上のカスタム グラフィカル ユーザー インターフェイスにより、ユーザーはシステムとカートリッジのさまざまな機能を制御できます (つまり、値の作動、ポンプによってカートリッジに移送される空気の量の制御、移送される空気の流量の制御、ヒーター温度の制御、等）。 スクリプト記録により、ユーザーは、カートリッジ上のアッセイを自動的に実行するために使用される装置システム スクリプトを生成および記録して、カートリッジ アッセイの実行全体での精度と一貫性を確保できました。

流体の作動時間は約 8 分と測定されました。 この機器の重要な要素はカスタムマニホールドで、これが係合するとプラスチックカートリッジに気密シールを形成し、カートリッジ内の液体の作動を可能にします。 マニホールドは、市販のバルブに接続された単一のカスタム シリンジ ポンプに接続された 7 つのポートで構成されています。 ポートは、マニホールドに組み込まれたガスケットを使用してカートリッジに密閉されています。 プラスチックカートリッジでは、各ポートは疎水性膜によって機器から隔離されており、空気は通過させますが水性流体は通過させないため、機器はアッセイ試薬や唾液による汚染から保護されています。 正の空気圧または負圧が適切なマニホールド ポートに適用されると、その圧力により、押しのけられる空気の流量と体積に応じて、カートリッジ内の液体が押し込まれたり、引き込まれたりします。 マニホールドのバルブは大気に通気することもでき、カートリッジ内の圧力を平衡に保つことができます。 置換される空気の量とポンプの流量は、試薬が完全に混合され、チャネル内の残留体積の損失が最小限に抑えられるように調整されます。

プロトタイプの機器全体の寸法は、幅約 12 フィート、奥行き 18 フィート、高さ 12 フィートです。 カスタム電子基板、内蔵ポンプとバルブを備えたカスタムマニホールド、カスタム光学系を備えたカスタム設計の機器は、8 フィート × 9 フィート × 9 フィートほどの小型にすることもできます。

抵抗ヒーターと TEC は、熱電対が埋め込まれたカートリッジを使用して、動作中にカートリッジ内部に到達する温度を測定することによって調整されます。 プラスチックによる熱伝達損失のため、設定温度は通常、カートリッジ内の実際の温度より 5 ～ 8 °C 高くなります。 ヒーターの設定値は、一致するオフセットに応じて設定されます。 臨床試験で使用したカートリッジでは、LAMP 反応チャンバーのヒーターは 72 °C に設定され、Cas13 検出チャンバーは 39 °C に設定されました。

カートリッジは、SolidWorks の Wainamics Inc. によって設計されました。 プロトタイプのカートリッジは、製造可能性を念頭に置いて設計および製造されました。 レーザーカットされたさまざまな厚さのポリメチルメタクリレート層 (0.25 ～ 1 mm、日東樹脂工業株式会社の Clarex Precision) を、PCR 互換の感圧接着剤 (Adhesive Research AR90880 および AR92712) を使用して積層し、所望のチャネル形状を実現しました。 すべてのチャネルの形状は、射出成形やロータリーダイカットなどの大量生産技術に簡単に変換および複製できるように設計されています。 各層は CO2 レーザー (BossLaser) で切断され、カートリッジ全体は Wainamics Inc. によって手作業で組み立てられました。プロトタイプの機器の汚染を防ぐために、液体ではなく気体を通過させるために疎水性膜 (Sterlitech PTFE029025) が使用されました。 シリコーンゴムシート (McMaster-Carr 1460N11) を使用して、溶液の流れを制御するための作動可能なカートリッジバルブを製造しました。

熱電対 (Omega Engineering) を熱エポキシ (McMaster-Carr、#7548A11) に埋め込んだカートリッジを温度校正の目的で使用しました。 抵抗ヒーターと TEC の電力設定は、温度校正カートリッジからの読み取り値を使用して手動で調整されました。 サーマルテストカートリッジからのフィードバックを使用した温度校正の実行を補足図5に示します。設定温度と記録温度の差は、温度が高くなると増加します（安定していません）。 したがって、必要な反応温度と一致するために必要な設定温度を確認してシステムを校正することが重要です。

チャネルに沿った試薬の損失のため、正しい反応量を確保するために複数の校正実験が実行されました (補足表 3)。 「開始リザーバー」と「目的チャンバー」の間で失われる体積の量を測定するための実験プロトコルは次のとおりです。所定の体積の蛍光色素を開始リザーバーに充填しました。 一方、0.1% Tween-20を含む既知量のPBSを「目的の」チャンバーに添加した。 実験的な流体シーケンスを実行して、染料をリザーバーからチャンバーに流しました。 混合したら、チャンバー内の希釈した色素を取り出し、その蛍光をプレートリーダーで評価しました。 プレートリーダー上で、色素の既知の滴定を同時に評価して、検量線を作成しました。 カートリッジから取り出した色素の蛍光を検量線と比較することで、流体の流れの後に回収された色素の量とチャネル内で失われた色素の量を推定することができました。 視覚的流体試験の目的には、0.1% Tween-20 (Sigma P1379) を含む 1× PBS (Sigma P5493) 中の 100 nM フルオレセイン (Sigma F6377) の溶液を使用しました。 さまざまな濃度 (0 nM ～ 200 nm) の 1 × PBS 中の FamT10 (IDT) も、検出システムによるカートリッジの光学的特性評価のためのキャリブレーター溶液として使用されました。

反応チャンバー内の 40 μl のサンプル量をイメージングするには、隣接するサンプル ウェルのイメージが重ならないように十分な焦点深度を可能にする、かなり大きな視野 (FOV) と適度な開口数 (NA) が必要です。 これを比較的低コストでコンパクトなデバイスで実現するために、一対の接眼レンズ (Edmund Optics、PN#66-208 および 66-210) を使用してカスタム システムを設計し、NA 0.09、FOV 直径 12.0 mm のシステムを実現しました。倍率0.54（当社のCS165MU1カメラのセンサーサイズをFOVに合わせるために選択。この「ライトバケット」アプリケーションではナイキスト以上でのサンプリングは不要です）（補足表4）。 システム全体はコンパクトで、公称トラック長 (サンプルからカメラまで) は約 75 mm です。 蛍光フィルターはChroma Technologies製のET470/40x、T495lpxrおよびET535/70mを使用し、励起は965 mW、470 nm LED (LEDD1Bで駆動されるThorlabs M470L4)によって提供され、直径12 mmのサンプルに最大約225 mWを提供します。落射照明ケーラー幾何学における FOV。 イメージング ハードウェアのカスタム制御は MATLAB (2020a) に実装されており、Thorlabs ドライバーと SDK (ThorCam) を使用してカメラの取得を制御し、Arduino Bluefruit Feather ボードへのシリアル通信を使用して、カメラの画像取得と同期して LED 照明を電子的にトリガーします。

マルチプレックス カートリッジには、N 遺伝子と内部コントロール (RNaseP または ACTB) の両方用の 2 つの検出チャンバーがあります。 毎日、唾液サンプルでアッセイを実行する前に、緩衝液で満たされた空のカートリッジと蛍光スライドがそれぞれバックグラウンド補正と照明均一性補正のために画像化されました。 各チャンバーで 1 つの関心領域 (ROI) (150 × 400 ピクセル) が選択され、その後の実験と同じゲインと露出時間 (2 dB および 150 ms) でブランク カートリッジがイメージングされました。 各 ROI で測定された強度を使用して、サンプル画像を背景に対して正規化しました。 照明の不均一性を補正するために、きれいな蛍光スライドをゲイン 1、露出 0.1 秒でイメージングしました。

背景補正と照明均一性補正は両方とも、予測補正方法を使用して実行されました44。 つまり、反応チャンバーの各ピクセル x の測定された強度は、次のような実際の強度に関連付けられます。

ここで、S は、不均一な照明による画像の歪みをモデル化する線形スケーリング係数です。 B は、サンプル チャンバーからの散乱とバックグラウンド蛍光を考慮した照明依存のバックグラウンド信号です。 D は加算ゼロ光項であり、カメラのオフセットと固定パターンの熱雑音に起因します。 S、B、D は、毎日の開始時に実験前に取得された空のカートリッジと均一な蛍光スライドの画像から決定されました。 実験画像は式 (1) に従って処理され、修正されたサンプル信号が取得されました。 カスタム MATLAB スクリプトは、照射時間、ゲイン、各画像取得間の時間間隔、キャプチャする総フレーム数などの照明および検出パラメータを制御するために開発されました。 このスクリプトでは、カートリッジのライブ プレビューも可能で、反応チャンバー内の ROI を最適に配置および選択できます。 アッセイが開始されると、反応混合物が検出チャンバーにポンプで送り込まれる際に、スクリプトによって自動的に画像取得が開始されます。 この時点で、スクリプトには、実験中に各時点でキャプチャされた画像と、選択された ROI の対応する平均強度が表示されました。

概念実証システムは、当初、陽性または陰性 N 遺伝子検出用の単一反応チャネルを使用して開発されました。 陽性サンプルとして Twist 合成 SARS-CoV-2 RNA をスパイクした市販の唾液 (Lee Biosolutions、991-05-S-25) を、機器の校正と迅速な結果のためにこのシステムで使用しました。 図 5 に示すように、反応は 4 つのステップに分けることができます: (1) 唾液測定、(2) LAMP 反応、(3) LAMP 測定 + Cas13/N 遺伝子 crRNA 混合、および (4) 検出チャンバーでの Cas13 反応。 チャネルに沿った試薬の損失のため、正しい反応量を確保するために、前述のように複数のキャリブレーション実験を実行しました（ここで参照されているように、負荷量は補足表 3 にあります）。 ステップ 1 (上部) では、16 μl の唾液がシリンジ ポンプによって計量チャネルに能動的に吸引されます。 次に、シリンジポンプは、独自の疎水性溶液 (35 μl) を介して分離されたプライマー (4 μl) とマスターミックス (20 μl) を計量チャネルを通して LAMP 混合チャンバーに能動的に押し込みます。 さらに 50 μl の空気 (250 μl min-1) をチャンバーに押し込み、気泡が LAMP 反応を混合できるようにします (ステップ 2)。 抵抗ヒーターをオンにして、LAMP チャンバーを 65 °C に 30 分間加熱し、反応を起こさせます。 同時に、TEC を 25 °C に設定して、Cas13、T7 ミックス、蛍光消光剤 (FQ)、および crRNA 試薬を室温に維持します。 LAMP 反応 (ステップ 3) の後、下部のアクティブバルブが開き、重力によって 4 μl の LAMP 生成物が左側の計量チャネルを通って流れます。 シリンジポンプは、32 μl T7mix + FQ と 4 μl Cas13 + N 遺伝子 crRNA を計量チャネルを通して左側の混合チャンバーに能動的に押し込みます。 追加の 50 μl の空気が混合のために両方のチャンバーに押し込まれます。 ステップ 4 では、45 μl の溶液がそれぞれの検出チャンバーに積極的に吸引されます。 TEC を 37 °C に上げ、15 ～ 30 分間、15 秒ごとに蛍光画像を取得します。

カートリッジが陽性および陰性の唾液サンプルを検出したら、臨床抽出 RNA 検出用の新しいカートリッジを設計しました。 これらのサンプルは、Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) 試験ラボから抽出された残りの臨床検体でした。 臨床サンプルあたり 5 μl しかアクセスできなかったため、唾液計量流体工学 (図 5c のステップ 1) は使用されませんでした。 代わりに、臨床サンプルを LAMP チャンバーに直接ロードしました。 反応は、図 5c の 3 つのステップに分けることができます: (2) LAMP 反応、(3) LAMP 測定 + Cas13/crRNA 混合、および (4) 検出チャンバーでの Cas13 反応。 また、ステップ 3 とステップ 4 を多重化し、カートリッジの左側がサンプルを N 遺伝子 crRNA にさらすようにし (ステップ 3a)、カートリッジの右側は RNase P crRNA による内部コントロールとして機能します (ステップ 3b)。十分な細胞物質がサンプル中に存在することを示しています。 以下に反応量を報告します。 充填量は補足表 3 に記載されています。ステップ 2 では、5 μl の臨床サンプルが LAMP チャンバーに直接充填されます。 次に、シリンジ ポンプは、独自の疎水性溶液 (35 μl) を介して分離されたプライマー (4 μl) とマスター ミックス (20 μl) を LAMP 混合チャンバーに積極的に押し込みます。 さらに 50 μl の空気をチャンバーに押し込み、気泡が LAMP 反応を混合できるようにします。 抵抗ヒーターをオンにして、LAMP チャンバーを 65 °C に 30 分間加熱し、反応を起こさせます。 同時に、Cas13 試薬と crRNA 試薬を室温に維持するために、TEC を 25 °C に設定します。 ステップ 3 では、LAMP サンプルを 2 つの反応に分割します。カートリッジの左側はサンプルを N 遺伝子 crRNA に曝露し (ステップ 3a)、カートリッジの右側は RNase P crRNA のみを含む内部対照として機能します (ステップ 3b)。 ）。 LAMP 反応後、下部の 2 つのアクティブ バルブが開き、重力によって 4 μl の LAMP 生成物が左右のパッシブ計量チャネルを通って流れます。 シリンジポンプは、32 μl T7 mix + FQ と 4 μl Cas13 + crRNA (左側のリザーバーに N 遺伝子、右側のリザーバーに RNase P) を計量チャネルを通じてそれぞれの N 遺伝子 (左側) および RNase P (右側) チャンバーに積極的に押し込みます。 追加の 50 μl の空気が混合のために両方のチャンバーに押し込まれます。 この時点で、45 μl の溶液がそれぞれの検出チャンバーに積極的に吸引されます (ステップ 4)。 左側のチャンバーには Cas13 および N 遺伝子と混合された LAMP 製品が含まれ、右側のチャンバー (内部コントロール) には LAMP と Cas13 および RNase P crRNA が混合されます。 TEC を 37 °C に上げ、15 ～ 30 分間、15 秒ごとに蛍光画像を取得します。

多数の臨床サンプルにアクセスすることは困難であるため、我々は、ツイスト合成 SARS-CoV-2 RNA を唾液マトリックスにスパイクすることによって陽性サンプルを生成した、個別の個人 (Lee Biosciences) からの唾液を流すことによってシステムの堅牢性を実証しました。 市販サンプルの唾液組成は異なるため、可変の RNase P シグナルに対処するために、代替プロセス コントロール (拡張データ図 2a) をスクリーニングしました。 まず、市販の唾液と HEK 293FT 細胞からの RNA 抽出物の両方で、ACTB の LAMP プライマーのさまざまな領域への T7 プロモーター配列の挿入を体系的にテストし (拡張データ図 2b)、それを統合するための小さなガイド スクリーニングを実行しました。 DISCoVER パイプライン (拡張データ、図 2c)。 ACTB と比較して初期実験では N 遺伝子シグナルが低いため、N 遺伝子と ACTB プライマーの比 2:1 と追加の Bst 2.0 ポリメラーゼの添加による反応からなる多重増幅を最適化しました。 次に、25 個の個々の唾液サンプル、つまり、SARS-CoV-2 ゲノム RNA を含む人為的陽性サンプルとして 20 サンプルと、このワークフローの再現性と堅牢性を実証するために 5 つの陰性サンプル (拡張データ図 2d) を実行しました。

カートリッジの設計は簡素化され、よりコンパクトな設計が可能になり、混合と容量の精度が向上しました (拡張データ図 2d)。 反応は次のステップに分けることができます: (1) LAMP 反応、(2) LAMP 測定 + Cas13/crRNA 混合、および (3) 検出チャンバーでの Cas13 反応。 ステップ 2 とステップ 3 は、カートリッジの左側がサンプルを N 遺伝子 crRNA にさらすように (ステップ 2a)、カートリッジの右側が ACTB crRNA による内部対照として機能するように多重化されました (ステップ 2b)。十分な細胞物質がサンプル中に存在していました。 ステップ 1 では、18 μl の唾液サンプルがサンプル チャンバーに直接ロードされます。 シリンジポンプは、独自の疎水性溶液 (30 μl) だけでなく、より疎水性の高い溶液 (15 μl) を介して分離されたプライマー (10 μl) およびマスターミックス (40 μl) を LAMP 混合チャンバーに積極的に押し込むことができます。 さらに 50 μl の空気をチャンバーに押し込み、気泡が LAMP 反応を混合できるようにします。 抵抗ヒーターをオンにして、LAMP チャンバーを 63 °C に 45 分間加熱し、反応を起こさせます。 溶液を混合し、反応結果を向上させるために、15 分ごとに空気を少し送ります。 同時に、Cas13 試薬と crRNA 試薬を室温に維持するために、TEC を 25 °C に設定します。 ステップ 2 では、LAMP サンプルを 2 つの反応に分割します。カートリッジの左側はサンプルを N 遺伝子 crRNA に曝露し (ステップ 2a)、カートリッジの右側は ACTB crRNA のみを含む内部コントロールとして機能します (ステップ 2b)。 。 LAMP 反応後、下部の 2 つのアクティブ バルブが開き、重力によって 4 μl の LAMP 生成物が左右のパッシブ計量チャネルを通って流れます。 シリンジポンプは、40 μl T7 mix + FQ、15 μl の疎水性溶液、および 10 μl Cas13 + crRNA (左側のリザーバーに N 遺伝子、右側のリザーバーに ACTB) を計量チャネルを通じてそれぞれの N 遺伝子 (左) および ACTB (右）チャンバー。 追加の 50 μl の空気が混合のために両方のチャンバーに押し込まれます。 この時点で、45 μl の溶液がそれぞれの検出チャンバーに積極的に吸引されます (ステップ 3)。 左側のチャンバーには Cas13 および N 遺伝子 crRNA と混合された LAMP 製品が含まれ、右側のチャンバー (内部対照) にも LAMP 製品が含まれますが、Cas13 および ACTB crRNA と混合されます。 TEC を 37 °C に上げ、蛍光画像を 10 秒ごとに 30 分間取得します。 倍率変化を5分と10分の間で測定し、アッセイ結果を判定しました（図5gおよび拡張データ図2d）。

現場で収集された臨床唾液サンプルは、カリフォルニアに居住し、クリニカ・デ・サルー・デル・ヴァレ・デ・サリナスまたはその他のサリナスバレー検査で新型コロナウイルス検査（抗原、PCR、または転写媒介増幅検査）を受けている18歳以上の成人から採取されました。サイト（カリフォルニア大学バークレー校 IRB プロトコール番号 2021-04-14268）。 この一連の作業でサンプルが議論される参加者には、農業従事者と非農業従事者の両方が含まれていました。 妊婦さんも参加していただきました。 スクリーニングと登録は、新型コロナウイルス感染症検査を実施する診療所で対面で行われたほか、クリニカ・デ・サルー・デル・バジェ・デ・サリナスで最近陽性反応が出た患者に対しては電話で行われた。 すべての募集とデータ収集において、研究スタッフと臨床スタッフはマスクと手袋を着用しました。 対面採取の場合、野外研究者は参加者に口の開いた容器を提供し、その中にあらかじめ決められた最大3mlのマークまで吐き出すよう依頼した。 その後、参加者には容器のカバー、消毒用ワイプ、ペーパータオルが渡されました。 次に、参加者は容器にしっかりと蓋をし、容器の外側全体をワイプで拭くように指示されました。 現場研究者は手袋やその他の個人用保護具を着用して容器を受け取り、参加者の識別番号と収集日が記載されたステッカーを貼り、アイスパックの入ったクーラーに入れました。 新型コロナウイルス陽性者の自宅ベースの募集では、現場の研究者らが陽性反応を示した患者に電話をかけて、調査研究への参加への関心を判断した。 その後、フィールド研究者はサンプル収集キットを参加者の自宅に届けました。 キットには、サンプル収集のための視覚的説明書と書面による説明書、および事前にラベルが貼られた開口型容器が含まれていました。 現場研究者は参加者に電話でサンプル収集を案内した。 現場研究者は完了後に参加者からキットを回収し、唾液サンプルをアイスパックの入ったクーラーに入れました。 その後、サンプルはドライアイス上でカリフォルニア大学バークレー校に輸送されるまで -80 °C で保存され、その後再び -80 °C で保存されました。 すべてのサンプルは、カリフォルニア大学バークレー校被験者保護委員会の倫理的監督の下で収集されました。

検査の準備ができたら、唾液の不活化には 5 分間で十分であるにもかかわらず、研究で入手した 66 個のサンプルすべてを解凍し、BSL-2 の大学 EH&S ガイドラインに基づいて 95 °C で 20 分間加熱不活化しました 37。 唾液サンプル自体はこれまでに検査されていなかったため、サンプルセットの陽性プロファイルを取得するために各サンプルに対してRT-qPCRが実行されました。 Luna Universal Probe ワンステップ RT-qPCR キット (NEB E3006) を使用して、ウイルス RNA の最終濃度を決定するための N 遺伝子ターゲティングプライマー、およびプロセスコントロールとして ACTB ターゲティングプライマーに対して RT-qPCR を実行しました。 スクリーニングされた 66 個のサンプルから、Ct 値の範囲 (補足表 5) にわたって 13 個のサンプル (陽性 10 個、陰性 3 個) が選択され、DISCoVER マイクロ流体デバイスで実行され、すでに確認されている陰性サンプルと陽性サンプルを区別するデバイスの能力を検証しました。 RT-qPCR におけるゴールドスタンダードアッセイによる。 これらの唾液ドナーサンプルのそれぞれは、考案されたサンプルのワークフローに記載されているプロトコルに従ってマイクロ流体システムで実行され、各ターゲットの陽性の指標としてバックグラウンドカートリッジの2倍の蛍光増加を観察しながら同様に分析されました（図） .5g）。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

使用されたすべての核酸配列は、原稿または補足情報に提供されています。 臨床サンプルの生データはソース データとして提供されます。 この研究中に生成されたすべての生のデータセットと分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から研究目的で利用できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

イメージング ハードウェアの制御に使用されるコードは、補足情報として入手できます。

Lavezzo、E. et al. イタリアのヴォー市におけるSARS-CoV-2の流行の抑制。 ネイチャー 584、425–429 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Wölfel、R. et al. COVID-2019 の入院患者のウイルス学的評価。 ネイチャー 581、465–469 (2020)。

記事 Google Scholar

Zhao、J.ら。 新型コロナウイルス感染症患者における SARS-CoV-2 に対する抗体反応 2019。臨床感染症 71、2027–2034 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Vandenberg, O.、Martiny, D.、Rochas, O.、van Belkum, A.、Kozlakidis, Z. 新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の診断検査に関する考慮事項。 Nat. Rev. Microbiol. https://doi.org/10.1038/s41579-020-00461-z (2020)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

IGI テスト コンソーシアム。 ポップアップ SARS-CoV-2 検査ラボの青写真。 ナット。 バイオテクノロジー。 38、791–797 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

ブルーム、JS 他プールおよびバーコード化された鼻および唾液サンプルの次世代シーケンスによる、SARS-CoV-2 RNA の検査が大規模にスケールアップされました。 ナット。 バイオメッド。 工学 5、657–665 (2020)。

記事 Google Scholar

Rabe, BA & Cepko, C. 等温増幅と、サンプルの不活化と精製のための迅速かつ安価なプロトコルを使用した SARS-CoV-2 検出。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 117、24450–24458 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Myhrvold, C. et al. CRISPR-Cas13 を使用した現場展開可能なウイルス診断。 サイエンス 360、444–448 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

Weickmann、JL & Glitz、DG ヒトリボヌクレアーゼ。 血清、尿、臓器標本中の膵臓様酵素の定量。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 257、8705–8710 (1982)。

記事 CAS Google Scholar

岩崎 晋 ほか鼻咽頭ぬぐい液と唾液における SARS-CoV-2 検出の比較。 J.感染する。 81、e145–e147 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

アラバマ州ウィリーら。 SARS-CoV-2 検出用の唾液または鼻咽頭ぬぐい液標本。 Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 383、1283–1286 (2020)。

記事 Google Scholar

East-Seletsky、A.ら。 CRISPR-C2c2 の 2 つの異なる RNase 活性により、ガイド RNA プロセシングと RNA 検出が可能になります。 ネイチャー 538、270–273 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

グーテンバーグ、JS et al. CRISPR-Cas13a/C2c2 による核酸検出。 サイエンス 356、438–442 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

チェン、JS 他 CRISPR-Cas12a 標的結合は、無差別な一本鎖 DNase 活性を解き放ちます。 サイエンス 360、436–439 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

アブダイェ、OO 他 C2c2 は、単一コンポーネントのプログラム可能な RNA ガイド型 RNA ターゲティング CRISPR エフェクターです。 サイエンス 353、aaf5573 (2016)。

記事 Google Scholar

ラマチャンドラン、A. et al. CRISPR ベースの迅速診断と SARS-CoV-2 の検出への応用のための電場駆動マイクロ流体工学。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 117、29518–29525 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

ニング、B.ら。 スマートフォンで読み取る、新型コロナウイルス感染症の超高感度かつ定量的な唾液検査です。 科学。 上級 7、(2021)。

ブローガン、DJ 他 SARS-CoV-2 の迅速かつ高感度な CasRx ベースの診断アッセイの開発。 ACS センサー 6、3957 ～ 3966 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

リー、S.-Y. 他。 CRISPR-Cas12a は、一本鎖 DNA に対してシス切断活性とトランス切断活性の両方を持ちます。 セル解像度 28、491–493 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

Fozouni, P. et al. CRISPR-Cas13a と携帯電話顕微鏡による SARS-CoV-2 の増幅を伴わない検出。 セル 184、323–333.e9 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Nagamine, K.、Hase, T. & Notomi, T. ループプライマーを使用したループ媒介等温増幅による反応の加速。 モル。 細胞。 プローブ 16、223–229 (2002)。

記事 CAS Google Scholar

Hardinge, P. & Murray, JAH 偽陽性が減少し、消光蛍光プライマーを使用したループ媒介等温増幅のレポートが改善されました。 科学。 議員 9、7400 (2019)。

記事 Google Scholar

リュー、TYら。 タンデム CRISPR ヌクレアーゼを使用した RNA 検出の加速。 ナット。 化学。 バイオル。 17、982–988 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

East-Seletsky, A.、O'Connell, MR、Burstein, D.、Knott, GJ & Doudna, JA 機能的に直交するタイプ VI-A CRISPR-Cas 酵素による RNA ターゲティング。 モル。 セル 66、373–383.e3 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

パーク、G.-S. 他。 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) を対象とした逆転写ループ媒介等温増幅アッセイの開発。 Ｊ．Ｍｏｌ． 診断します。 22、729–735 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Yu、L.ら。 逆転写ループ媒介等温増幅（RT-LAMP）診断プラットフォームを使用した、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）コロナウイルスの迅速検出。 臨床化学 66、975–977 (2020)。

記事 Google Scholar

Zhang、Y.ら。 比色 LAMP を使用した SARS-CoV-2 (COVID-19) ウイルス RNA の迅速な分子検出。 bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.02.26.20028373 (2020)。

ラム、LE、バルトロン、SN、ワード、E、および首相、MB 逆転写ループ媒介等温増幅による新型コロナウイルス/重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) の迅速検出。 PLoS ONE 15、e0234682 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Notomi, T. ループを介した DNA の等温増幅。 核酸研究所 28、63e (2000)。

記事 Google Scholar

Dao Thi、VL 他。 臨床サンプル中の SARS-CoV-2 RNA を検出するための比色 RT-LAMP アッセイおよび LAMP シーケンス。 科学。 翻訳。 医学。 12、eabc7075 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Song, J. et al. 1 段階および 2 段階の密閉チューブ、ポイントオブケア、SARS-CoV-2 の分子検出。 アナル。 化学。 93、13063–13071 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

オストハイム、P. et al. ヒト唾液遺伝子発現測定における課題を克服します。 科学。 議員 10、11147 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

チン、AWH 他。 さまざまな環境条件における SARS-CoV-2 の安定性。 ランセット微生物 1、e10 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

メルドラム、オウ、他。 ムチンゲルの集合は、非ムチンタンパク質、ジスルフィド架橋、Ca2+媒介結合、および水素結合の集合的な作用によって制御されます。 科学。 議員第 8 号、5802 (2018)。

記事 Google Scholar

Tabachnik, NF、Blackburn, P. & Cerami, A. 嚢胞性線維症患者からの喀痰ムチンの生化学的およびレオロジー的特徴付け。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 256、7161–7165 (1981)。

記事 CAS Google Scholar

デイビス、NG et al. 英国における SARS-CoV-2 系統 B.1.1.7 の推定伝播性と影響。 サイエンス 372、6538 (2021)。

記事 Google Scholar

Stahl、EC et al. LuNER: 臨床綿棒および廃水サンプルにおける SARS-CoV-2 の多重検出。 PLoS ONE 16、e0258263 (2021)。

記事 Google Scholar

バテジャット、C.、グラッサン、Q.、マヌゲラ、J.-C. & Leclecq、I. 重症急性呼吸器症候群コロナウイルスの熱不活化 2. J. Biosaf. バイオセキュリティ。 3、1–3 (2021)。

記事 Google Scholar

ブロートン、JP et al. CRISPR–Cas12 に基づく SARS-CoV-2 の検出。 ナット。 バイオテクノロジー。 38、870–874 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Joung、J.ら。 SHERLOCK ワンポット検査による SARS-CoV-2 の検出。 Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 383、1492–1494 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Patchsung、M. et al. SARS-CoV-2 RNA 検出のための Cas13 ベースのアッセイの臨床検証。 ナット。 バイオメッド。 工学 https://doi.org/10.1038/s41551-020-00603-x (2020)。

グーテンバーグ、JS et al. Cas13、Cas12a、および Csm6 を備えた多重化されたポータブル核酸検出プラットフォーム。 サイエンス 360、439–444 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

ノット、GJ et al. CRISPR-Cas12a の広範囲の酵素阻害。 ナット。 構造体。 モル。 バイオル。 26、315–321 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

スミス、Ｋ．ら。 CIDRE: 光学顕微鏡用の照明補正方法。 ナット。 方法 12、404–406 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

支援とアドバイスをくださった Hsu、Savage、Fletcher、Doudna 研究室のメンバー全員、そして有益な議論をしていただいた AJ Ehrenberg、E. Charles、B. Thornton に感謝します。 天然唾液サンプルの収集を調整してくれた M. Ott と R. Kumar に感謝します。 この研究は、Shuurl & Kay Curci Foundation、匿名の寄付者、Emergent Ventures、国立衛生研究所 (NIH)、および DARPA によって、賞 N66001-20-2-4033 の下で支援されました。 表明された見解、意見、および/または調査結果は著者のものであり、国防総省または米国政府の公式見解または政策を表すものとして解釈されるべきではありません。 NIH のサポートに感謝します (PDH R01GM131073、DP5OD021369、DFS R01GM127463)。 JAD は、ハワード ヒューズ医学研究所 (HHMI) の研究者です。 AF は NSF 大学院研究フェローシップによって支援されました。

これらの著者は同様に貢献しました: Sita S. Chandrasekaran、Shreeya Agrawal、Alison Fanton、Aditya R. Jangid。

カリフォルニア大学バークレー校生物工学科、バークレー、カリフォルニア州、米国

シタ・S・チャンドラセカラン、シュリーヤ・アグラワル、アリソン・ファントン、アディティア・R・ジャンギッド、ソンミン・ソン、アブドゥル・ブイヤ、レオン・ダービーのマリア・ディアス、アンドリュー・R・ハリス、リアナ・F・ラロー、ダニエル・A・フレッチャー、パトリック・D・スー

革新的ゲノミクス研究所、カリフォルニア大学バークレー校、バークレー、カリフォルニア州、米国

シタ・S・チャンドラセカラン、シュリーヤ・アグラワル、アリソン・ファントン、アディティヤ・R・ジャンギッド、ノーム・プライス、マリア・ルカルスカ、ディラン・CJ・スモック、ギャビン・J・ノット、チー・ダン、イーライ・ドゥガン、シン・キム、ティナ・Y・リュー、ジェニファー・R・ハミルトン、ヘンリー リンシャオ、エリザベス C. スタール、コナー A. 土田、ピーター ジャンニコプロス、マシュー マケルロイ、シャナ マクデヴィット、アリエル ザー、イマン シルヴァン、アリソン シーリング、マデリーン ジュー、クララ ウィリアムズ、アリーシャ ボールドウィン、エリカ A. モーレ、リアナ F.ラロー、ジェニファー・A・ダウドナ、パトリック・D・スー

カリフォルニア大学バークレー校 – カリフォルニア大学サンフランシスコ校生物工学大学院プログラム、米国カリフォルニア州バークレー

シタ・S・チャンドラセカラン、アリソン・ファントン、ベレニス・チャレス、アブドゥル・ブイヤ、マリア・ディアス・デ・レオン・ダービー

Wainamics Inc.、米国カリフォルニア州プレザントン

アーサー・M・エスカヘダ、ロジャー・マッキントッシュ、フエン・トラン、ミン・X・タン

米国カリフォルニア州サンノゼ、サンノゼ州立大学物理天文学部

ニール・A・スイス

米国カリフォルニア州バークレーのローレンス・バークレー国立研究所、分子生物物理学および統合バイオイメージング部門

マキシム・アームストロング & ジェニファー・A・ダウドナ

カリフォルニア大学バークレー校、分子細胞生物学部、米国カリフォルニア州バークレー

マリア・ルカルスカ、ディラン・C・J・スモック、ギャビン・J・ノット、エリック・ヴァン・ディス、イーライ・ドゥガン、シン・キム、ティナ・Y・リュー、サラ・A・スタンレー、ジェニファー・A・ダウドナ、デヴィッド・F・サベージ

カリフォルニア大学バークレー校、公衆衛生学部、感染症およびワクチン学科、米国カリフォルニア州バークレー

スコット・B・ビアリング & エヴァ・ハリス

計算生物学センター、カリフォルニア大学バークレー校、バークレー、カリフォルニア州、米国

アマンダ・モック

モナシュ生物医学発見研究所、モナシュ大学生化学および分子生物学部、クレイトン、ビクトリア州、オーストラリア

ギャビン・J・ノット

環境研究および地域保健センター (CERCH)、カリフォルニア大学バークレー校公衆衛生学部、米国カリフォルニア州バークレー

キャサリン・コガット & ブレンダ・エスケナージ

カリフォルニア大学バークレー校公衆衛生学部、バークレー、カリフォルニア州、米国

サラ・A・スタンリー

カリフォルニア大学バークレー校ハワード・ヒューズ医学研究所、米国カリフォルニア州バークレー

ジェニファー・A・ダウドナ

カリフォルニア大学バークレー校化学科、バークレー、カリフォルニア州、米国

ジェニファー・A・ダウドナ

Gladstone Institute of Data Science and Biotechnology、グラッドストーン研究所、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

ジェニファー・A・ダウドナ

アーク研究所、パロアルト、カリフォルニア州、米国

パトリック・D・スー

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

SSC、SA、AF、ARJ は実験を設計および実行し、データを分析して原稿を作成しました。 PDH は、すべての著者からの意見をもとに、このプロジェクトを考案し、実験を設計し、この研究の全体的な監督を提供し、原稿を執筆しました。 DFS と JAD は実験的な意見を提供し、原稿を編集し、この研究を共同監督しました。 BC はマイクロ流体の専門知識を提供し、原稿を編集しました。 AME、HT、RM、および MXT は、マイクロ流体カートリッジと診断機器を設計および構築しました。 SS、AB、NAS、MA、ARH、MDdLD は、DAFNP の監督の下、マイクロ流体デバイスと統合された光学機器を設計および構築し、原稿を編集し、ML とともに実験設計に貢献しました。 QD は標準的な定量実験を実行しました。 DCJS、TYL、および GJK はアッセイ用にタンパク質を精製し、ED および SK と協力して生化学の専門知識を提供しました。 AM は LFL を使用したガイド RNA 選択のための計算手法を開発し、SBB と EVD は EH と SAS の監督の下で BSL-3 作業を実行しました。 IGI テスト コンソーシアム (JRH、EL-S.、ECS、CAT、PG、MM、SM、AZ、 IS、AC、MC、および CW) は、呼吸器スワブサンプルの診断 qPCR 検査を実施しました。 EAM、KK、および BE は、サリナスバレーの農場労働者研究における唾液サンプルの収集を調整しました。

ジェニファー・A・ダウドナ、デビッド・F・サベージ、またはパトリック・D・スーとの通信。

カリフォルニア大学理事会とワイナミクスは、この研究に関連する特許を申請しました。 PDH は、Spotlight Therapeutics および Moment Biosciences の共同創設者であり、取締役会および科学諮問委員会のメンバーを務めており、Vial Health および Serotiny の科学諮問委員会のメンバーでもあります。 DFS は Scribe Therapeutics の共同創設者であり、Scribe Therapeutics および Mammoth Biosciences の科学諮問委員会メンバーでもあります。 JAD は、Caribou Biosciences、Editas Medicine、Scribe Therapeutics、Mammoth Biosciences の共同創設者です。 JAD は、Caribou Biosciences、Intellia Therapeutics、eFFECTOR Therapeutics、Scribe Therapeutics、Mammoth Biosciences、Synthego、Algen Biotechnologies、Felix Biosciences、および Inari の科学諮問委員会メンバーです。 JAD はジョンソン・エンド・ジョンソンの取締役であり、バイオジェン、ファイザー、アップルツリー パートナーズ、ロシュのスポンサーによる研究プロジェクトを行っています。 他の著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Biomedical Engineering は、この研究の査読に貢献してくれた Jin Wang と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

FIP および BIP プライマーは、XX に対する F3 および B3 プライマーによって補助され、F2c および B2c で標的 DNA に結合し、DNA の相補領域をアンプリコン (F1c および B1c) に追加します。 F1 および B1 に対するそれらの相補性によりループ構造が形成され、ループ (F2c および B2c) でのさらなる FIP および BIP 結合と伸長が促進され、長いコンカテマーの形成を介して標的が増幅されます。 Floop および Bloop プライマーはさらにループに結合して伸長することができ、増幅がさらに増加し​​ます。 ループプライマーの 5' 末端に T7 プロモーターを追加すると、T7 ポリメラーゼの転写基質が提供され、その結果、標的アンプリコンの逆方向反復を含む RNA 産物が得られます。

(a) 市販の唾液サンプルに対するプロセス コントロール プライマー セットのスクリーニング。 (b) RNA 抽出物および市販の唾液サンプルに設定された ACTB プライマー上の T7 プロモーターの位置のスクリーニング。 (c) カートリッジ設計の概略図。 反応は 3 つのステップに分けることができます: 1. 増幅反応; 2. 2. 増幅後のメータリング + Cas13 ミックス。 3. 検出チャンバー内の Cas13 反応。 カートリッジに保存された試薬は、反応の早期開始を避けるために独自の疎水性溶液を介して分離されます。 LAMP 反応後、サンプルは 2 つの反応に分割されます。カートリッジの左側はサンプルを N 遺伝子 crRNA にさらし (ステップ 2a)、カートリッジの右側は ACTB crRNA のみを含む内部対照として機能します (ステップ 2b)。 ）。 （ d ）25個の個々の唾液サンプルに対するオンボードDISCoVERの結果（500 cp/μLのSARS-CoV-2ゲノムRNAを含む20個のサンプル、5個の予想陰性サンプル）。 10 分でブランクカートリッジと比較して蛍光が 2 倍増加することが、実験的に決定された陽性結果の基準でした。 10 分時点でこの閾値を下回る値を持つサンプルは陰性と宣言されました。

補足的な表、図、ビデオキャプション。

LAMP、rLAMP、RT–qPCR、Cas13 の配列。

DISCoVER ワークフローのデモンストレーション。

イメージング ハードウェアを制御するための MATLAB スクリプト。

図のソースデータ。 5c、d、7d。

Springer Nature またはそのライセンサーは、著者または他の権利所有者との出版契約に基づいて、この記事に対する独占的権利を保持します。 この記事の受理された原稿バージョンの著者によるセルフアーカイブには、かかる出版契約の条項および適用される法律のみが適用されます。

転載と許可

チャンドラセカラン SS、アグラワル S.、ファントン A. 他 Cas13 を介した唾液中の SARS-CoV-2 RNA の迅速な検出。 ナット。 バイオメッド。 Eng 6、944–956 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41551-022-00917-y

引用をダウンロード

受信日: 2020 年 12 月 1 日

受理日: 2022 年 6 月 30 日

公開日: 2022 年 8 月 11 日

発行日：2022年8月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-022-00917-y

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

ネイチャー生体医工学 (2023)

ネイチャー レビュー バイオエンジニアリング (2023)

分子細胞生化学 (2023)

獣医学研究コミュニケーション (2023)

ネイチャー生体医工学 (2022)