進化実験の視点から見たバイオフィルムの抗菌剤感受性

Oct 13, 2023

npj Biofilms and Microbiomes volume 8、記事番号: 82 (2022) この記事を引用

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5 引用

12 オルトメトリック

メトリクスの詳細

細菌集団を抗菌処理に繰り返し曝露する実験的進化実験、およびその結果として進化した細菌の遺伝子型と表現型を調べることは、感受性低下の背後にあるメカニズムを解明するのに役立ちます。このレビューでは、実験進化にバイオフィルムを含めることがなぜ重要なのか、バイオフィルムの実験進化を研究するためにどのようなアプローチが利用できるのか、そして実験進化がバイオフィルムの耐性と耐性について何を教えてくれたのかについて概要を示します。最後に、実験的進化研究中に得られたデータによって裏付けられた、バイオフィルムの抗菌剤感受性に関する新たなコンセンサス見解を提示します。

実験進化 (ボックス 1) は、実験者によって課され制御された条件に応じて集団内で発生する進化プロセスの研究です1。最初の微生物の実験進化研究は 1880 年代に遡ります 2 が、実験進化は 1950 年代にフランシス J. ライアンによって細菌学に導入され 3、リチャードレンスキーによって開始された長期進化実験 (LTEE) によってよく知られるようになりました。 1980 年代に開始され、75,000 世代以上にわたって実行され続けています4,5。 LTEE および他の多くの実験的進化実験は、構造化されていない環境、つまり、ほとんどの細菌が浮遊状態にある振動を伴う液体培養で行われます。しかし、すでに構造化された環境での初期の進化実験では、適応度の進化（ボックス 1）と集団内の変動性の点で、プランクトン培養で通常観察されるものと比較して顕著な違いが観察されています 6,7。

バイオフィルムは、表面に付着しているか、浮遊または埋め込まれた凝集体として発生する構造化された微生物群集です8。バイオフィルムにはさまざまな勾配（酸素、栄養素、抗菌剤など）が存在し、その結果、異なる環境条件を持つ空間的に構造化されたニッチが発達し9、これらの微小環境は細菌の増殖に直接影響を与えるため、バイオフィルム関連感染の結果を共同決定します。および代謝、ならびに抗菌治療の効果10、11、12、13。

実験進化一般 14 とバイオフィルムにおける実験進化の特定の側面 15 が最近レビューされました。詳細については、これらのレビューを参照してください。進化の過程でバイオフィルム集団がより多様になる理由の簡単な概要を以下に示します。

その不均一性により、バイオフィルムには複数の生態学的ニッチが含まれていますが、そのすべてが既存の遺伝子型によって使用されるわけではありません。これらの未使用のニッチは、新しい遺伝子型の機会を提供します16。さらに、新しい遺伝子型は、周囲の環境を変えることによって追加のニッチを作り出すことができます (「ニッチ構築」) 7,17。空間的不均一性のため、バイオフィルム集団は独立して進化する部分集団の集合体と考えることができ、この集団の断片化により有効な集団サイズが減少します。多様性に対する遺伝的浮動 (ボックス 1) の相対的な寄与は、より小さな部分集団でより高いため、空間的異質性は最終的により多様性をもたらします 16,18。集団の断片化により、特定の部分集団に比較的小さな影響を与える有益な突然変異の固定（ボックス 1）も可能になります。実際、大きな影響を与える有益な突然変異は、小さな影響を与える有益な突然変異よりも頻度が低く、前者がすべての部分集団に現れる可能性は低いです。その結果、影響が小さいさまざまな有益な突然変異が空間的に離れたさまざまな部分集団で発生し維持されることが予想され、集団全体の多様性がさらに高まる19。最近の実験研究とモデリングでは、空間的に構造化された環境では有益な突然変異の広がりが増幅され、有益な突然変異が失われる可能性が低いことが示されました 20。その理由は、構造化された環境では、選択により、特定の部分集団における有益な突然変異の頻度が、この突然変異が他の部分集団に移動するよりも速く増加する可能性があるためです。結果として、この有益な変異を保有する変異体は、繰り返し新しい部分集団に移動できる可能性が高く、最終的には遺伝的浮動によるこの変異の消失の可能性を低減します20。異なる有益な突然変異を持つ突然変異体間の競争 (クローン干渉、ボックス 1) により固定時間が増加し (つまり、特定の突然変異が他のすべての突然変異を打ち負かすまでに時間がかかります)、空間的に構造化された環境ではクローン干渉がより頻繁に発生します (有益な突然変異は遅いことを示すため)。、「波状」が人口全体に広がります）21。結果として、複数の有益な突然変異がバイオフィルム内で同時に発生する可能性があり、結果として再びより高い多様性が得られます22,23。嚢胞性線維症（CF）患者の肺で遭遇する条件と最も類似した条件（すなわち、合成CF培地[SCFM]）における緑膿菌のin vitro進化は、より低い並列性（すなわち、より多様性）につながるという最近の観察）最小培地での進化よりも、多様性を生み出すために空間的に分離された部分集団の存在が重要であることが確認されています24、25。最小培地とは対照的に、SCFM にはムチンが含まれており、これにより有効集団サイズが小さい空間的に構造化された部分集団の作成が可能になり、複製集団で同じ有益な変異が見つかる可能性が低くなります 25。

最後に、抗菌剤に曝露された均質な集団では、均一で高濃度の抗生物質による根絶を避けるために、完全な耐性に必要なすべての突然変異を同時に獲得する必要があります。しかし、バイオフィルムへの抗菌剤の浸透が妨げられる可能性があり、濃度勾配9、26、27、28、29が生じ、「聖域」、つまり抗菌剤の濃度が低く作用できるバイオフィルムの部分が形成される可能性があります。集団が一つずつ突然変異を獲得することを可能にする「踏み台」として。考慮すべきその他の重要な側面は、バイオフィルム細胞でよく観察される突然変異率の増加と、細菌バイオフィルムにおける水平遺伝子伝達 (HGT) 速度の増加です (ボックス 2 で詳しく説明します)。ほとんどの実験的進化研究は単一の種を対象として実施されるため（以下を参照）、HGT は通常、これらの研究において進化的変化を引き起こす要因ではないことに注意する必要があります。

バイオフィルム: 多糖類、細胞外 DNA、その他の成分で構成される細胞外マトリックスに埋め込まれた微生物からなる、構造化された微生物群集 (表面に付着、浮遊した凝集体、または組織に埋め込まれた凝集体)。

クローン干渉: 異なる有益な突然変異を保有する突然変異体間で集団内で発生する競合。

実験進化：実験者によって課され制御された条件や治療に応じて、実験者によって確立された集団内で起こる進化プロセスの研究14、15。

適応度: 適応度の低い競合他社よりも多くの子孫を生み出す能力 (したがって、時間の経過とともに頻度が増加する)。理想的には、将来の世代に対する競合他社の相対的な貢献を評価する直接競合アッセイで測定されます。フィットネスは、成長率や感受性を測定することによって間接的に評価されることがよくあります 14,15。

固定化: 遺伝子の特定のバリアント (突然変異) が集団内に唯一残っている (つまり、他のすべてが競争に負ける) 状況 14,15。

遺伝的浮動: 偶然による集団内の遺伝子の特定のバリアント (突然変異) の頻度の変化 14,15。

最小殺害期間 (MDK): 人口の一部を殺害するのに必要な最小時間。たとえば、MDK99 と MDK99.99 は、それぞれ集団内の細胞の 99% と 99.99% を死滅させるのに必要な時間です 31,32。

最小発育阻止濃度 (MIC): 浮遊細胞の増殖を防ぐ抗生物質の最低濃度 31,32。

変異体選択ウィンドウ (MSW): 耐性変異体の適合性が野生型よりも高くなる濃度範囲 79,91。

持続性: 集団内に少なくとも 2 つの部分集団が存在する現象。1 つは抗生物質によって急速に死滅する細胞で構成され、もう 1 つは生き残る耐性細胞で構成されます48。感受性株と持続株の間で MIC と MDK99 に差はありませんが、後者の MDK99.99 は大幅に高くなります 31,32。

耐性: 抗生物質耐性細胞は、感受性のある細菌の増殖を防ぐ抗生物質濃度での増殖を可能にする 1 つ以上のメカニズムを備えています。例としては、抗生物質の取り込みの減少と排出の増加、標的の修飾、および抗生物質の（酵素的）不活化が挙げられます31、32、125。

耐性: 耐性機構が関与することなく、抗生物質（MIC を超えるレベル）に曝露されても集団が生き残ることを可能にする集団レベルの現象。耐性細胞は多くの場合、成長しないか、成長が遅く、抗生物質が除去された後に再成長する可能性があります。耐性株と感受性株の間で MIC に差はありませんが、MDK99 は感受性株より耐性株の方が大幅に高くなります 31,32,125。

細菌の点突然変異の割合は、複製ごとに bp あたり 10-10 ～ 10-9 の間で変化します 93,133 が、ハイパーミューテーター (DNA ミスマッチ修復遺伝子の突然変異により突然変異頻度が上昇した菌株 134) では突然変異率が 100 ～ 1000 倍高くなる可能性があります。 135,136）。

いくつかの生物（緑膿菌、大腸菌、肺炎球菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌を含む）の浮遊培養物とバイオフィルムの間で変異率が比較され、バイオフィルムでは大幅に（4～100倍超）高いことが判明した104,116,118,137。

しかし、バイオフィルム内の化学勾配は生理学的不均一性をもたらし9、これは遺伝子発現と増殖速度の顕著な違いにも反映されており、バイオフィルムには多くの場合、ゆっくりと増殖する非分裂細胞がかなりの割合で含まれています138,139。このため、不均一なバイオフィルムとよく混合された浮遊培養物との間の突然変異率（通常、複製ごとの bp ごとに表される）の直接比較が複雑になります 114。

バイオフィルムで成長した緑膿菌 PAO1 では、酸化的 DNA 損傷に対する保護を与える酵素をコードする遺伝子の発現が下方制御されていたため、突然変異率の増加は酸化ストレスに関連している可能性があります。たとえば、katA (変換に関与する主要なカタラーゼをコードする) の発現が減少しました。過酸化水素から酸素と水への変換）は 7.7 倍下方制御されました 137。これと同様に、他の研究では、過酸化水素の生成が連鎖球菌およびブドウ球菌の突然変異率の増加に重要であることが判明しました116,118。

酸化ストレスの関連性は、内因性酸化ストレスによって引き起こされる二本鎖 DNA 切断と、その後の突然変異導入機構によるこれらの切断の修復とバイオフィルムの適応とを結びつける観察によって確認されている 117,122。

バイオフィルムも HGT に十分な機会を提供しており、その発生率は通常、プランクトン培養よりもバイオフィルムの方が高い 140,141 が、ドナーとレシピエントの空間的距離 142、プラスミドの種類 143、特定の DNA の配列と長さによって影響を受ける可能性があります。フラグメント144、および全体的なバイオフィルム構造（マトリックス中のエキソ多糖の存在を含む）145。

抗菌剤耐性は、最小発育阻止濃度 (MIC、ボックス 1) によって定量化されます 31。耐性生物が感受性生物の MIC を超える濃度で増殖する能力は、1 つ以上の耐性機構の存在と関連しており 32、耐性表現型に向かう進化の軌跡は複雑になる可能性があります 33。培養物を（抗生物質の濃度が一定または徐々に増加する存在下で）連続継代する実験的進化と全ゲノム配列決定（WGS）を組み合わせて、耐性および耐性への軌跡を特定するために使用できます34。例えば、カルバペネムの存在下で大腸菌を連続継代することにより、カルバペネムの標的である mrdA (PBP2 をコードする) および ftsI (PBP3 をコードする) の変異や、 acrB (AcrAB-TolC 流出ポンプの内膜関連部分をコードする)35。クロラムフェニコールの存在下で実験的に進化した大腸菌は、marR の DNA 結合領域に突然変異を誘発し、これにより AcrAB-TolC 流出ポンプを上方制御することができ、また、acrB および acrR にも突然変異が発生しました（acrR の中断は acrAB の上方制御につながります）36。肺炎球菌では、モキシフロキサシンとレボフロキサシンの濃度を増加させた状態での進化実験により、gyrB の新規変異が同定され、gyrA および parC の変異と組み合わさって高レベルのフルオロキノロン耐性が引き起こされました 37。緑膿菌を用いた実験的進化研究では、予期されたもの（例、セフタジジム存在下での進化後にAmpCの過剰産生を引き起こす変異、メロペネム存在下での進化後にポーリンの不活化を引き起こすoprDの変異）と新規（例、セフタジジムの存在下での進化後の AmpC の構造修飾を引き起こす機能獲得変異、シプロフロキサシンの存在下での進化後の gyrA の新規変異）耐性機構が同定されました 38。代謝適応と抗菌薬感受性の低下が密接に関係しているという一連の証拠が増えており 39,40 、プランクトン性大腸菌集団を用いたいくつかの進化実験研究で最近これが確認されています。大腸菌をグルコース（呼吸または発酵による急速な増殖をサポート）または酢酸（呼吸のみによる遅い増殖をサポート）を含む最小培地で増殖させると、耐性はグルコースに対してはるかに速く発現し、環境条件が耐性の発現速度を制限していることが確認されています41。観察された変化のほとんどは、抗生物質による治療によって直接影響を受けない代謝プロセスに関係しています。たとえば、グルコースとクロラムフェニコールの存在下で進化した培養物は、野生型大腸菌やグルコースのみの存在下で適応した大腸菌と比較して、より多くのグルコースを消費し、より多くの酢酸を分泌し、酸素摂取量が減少します。これは、呼吸から呼吸への代謝の切り替えを示しています。発酵。このスイッチは、AcrAB 排出ポンプ (クロラムフェニコール耐性に必要) の過剰発現と、排出ポンプと酸化的リン酸化に関与するタンパク質の間のスペースの競合による膜プロテオームのリモデリングに関連しています 41。抗菌薬耐性の発現における代謝変化の役割に関するさらなる証拠は、従来の実験的進化プロトコルと、細菌を曝露することによってすべての条件で同等の選択ダイナミクスを確保するように設計された「代謝進化プロトコル」の両方を使用した浮遊性大腸菌の実験的進化から得られます。異なる温度での抗生物質（つまり、代謝状態がますます高まった状態）42。従来の環境下で進化すると、MIC が増加し、個体数の増加がより遅くなります。これらの集団で頻繁に見られる変異は、既知の耐性機構に関連する遺伝子にあります。ただし、クローンのサブセットは、中心代謝 (TCA サイクル、電子伝達) に関連する遺伝子を含む他の遺伝子に変異を生じます。「代謝進化」実験の終了時に得られた集団は、祖先野生型株と比較して、指数関数的増殖速度の低下やラグタイムの増加がなく、殺傷アッセイにおける生存率の増加を示しました（増殖が遅いため耐性[Box 1]を除外）。 6 つの代謝遺伝子における変異体を操作すると、すべての変異体で少なくとも 1 つの抗生物質に対する MIC が増加したため、これらの変異の関連性がさらに確認されました。これらの変異が耐性をもたらすメカニズムはさまざまですが、そのうちの少なくとも 1 つ (TCA サイクル酵素 2-オキソグルタル酸デカルボキシラーゼをコードする sucA) では、変異は基礎呼吸を低下させ、それによって抗生物質を介した TCA サイクル活性の誘導を妨げることによって耐性をもたらします。これは、さまざまな生物で以前に観察されたメカニズムです43、44、45。これらの進化実験で特定されたコード配列変異の 39% は、配列決定された大腸菌ゲノムにも見られます。さらに、代謝遺伝子のいくつかの変異がこれらのゲノムに豊富に存在し、その一部は臨床分離株である大腸菌に統計的に豊富に存在しており、それらが生体内で関連していることが示唆されています42。

抗生物質に対する感受性の低下は耐性だけが原因ではなく、耐性と持続性（ボックス 1）も重要な役割を果たしています 31,32,46,47,48。耐性細胞は、従来の耐性機構を持たずに抗生物質への曝露を生き延び、抗生物質の除去後に増殖を再開します 32。寛容をもたらす要因は、遺伝的（例、遅延時間の増加につながる突然変異49、50）または環境的（例、保護バイオフィルムマトリックスの生成51、52、微環境条件による成長の遅さ53、54）である可能性があります。耐性と持続性は両方とも、殺害までの最小期間によって定量化できます (MDK、ボックス 1)。さらに、持続性は通常、二相性の死滅曲線の存在によって特徴付けられます 31,32。浮遊性大腸菌培養物をアンピシリンに周期的に曝露すると、MDK が増加しました。この増加は、単一細胞の遅延時間が延長されたためでした。 MIC の変化は観察されず、耐性が除外されました 49。さまざまなESKAPE病原体の浮遊集団をアミノグリコシドへの曝露と再増殖の間でサイクルさせた場合、進化したクローンの処理により開始培養と比較して持続細胞数の37〜213倍の増加が観察されましたが、やはりMIC55の増加はありませんでした。進化した高持続性クローンのWGSは、この表現型が、これまで持続性に関与していなかったoppB、gadCまたはnuoN遺伝子のいずれかにおける単一の変異に起因する可能性があることを示した56。

進化の実験は、耐性と粘り強さの発達が耐性の発達への「踏み台」になり得ることを示しています。浮遊性大腸菌培養物がアンピシリンの存在下で進化した場合、β-ラクタマーゼをコードするampCのプロモーター領域の変異により、7～17サイクル後にMICが増加しましたが、3～4サイクル後にはすでに増殖の遅延が観察されました。、耐性の発達は耐性の発達に先立って行われました57。最初の耐性クローンの WGS では、すべてが追加の変異を保有していることが示され、その一部はラグタイムの増加によって耐性が増加すると以前に特定されていました 49。追加の配列決定により、ampC 耐性変異が出現する前に同じ耐性変異が存在していたことが明らかになりました。いくつかの遺伝子の変異は寛容につながる可能性があるため、寛容につながる変異の標的サイズは耐性の標的サイズよりも大きくなります（ampC が唯一の標的です）。その結果、耐性変異がより頻繁に発生し、より早期に検出できるようになります。野生型株およびすでに耐性を発現した株から進化実験を開始したところ、耐性突然変異が耐性クローンでより早く確立されることが実証されました。高濃度のアンピシリンに曝露された際に耐性突然変異によってもたらされる生存上の利点は、耐性突然変異（ampC 耐性突然変異など）のそれに匹敵します。部分的な抵抗しか生じません)。その結果、数サイクル後に耐性変異が集団内で優勢になり始め、これらの変異の存在により、抗生物質治療中に耐性変異が失われる確率が減少します57。同様の観察が緑膿菌についても行われた。連続曝露により、緑膿菌は生存率が段階的に上昇しながら高濃度のトブラマイシンに急速に適応し、7〜8サイクル後には進化したすべての系統が祖先株よりも実質的に高いMICに達した58。 WGS は、対立遺伝子が特定の順序で発生し、固定に達することを示しました。呼吸とエネルギー代謝に関与する遺伝子の変異 (耐性につながる) は、通常、耐性変異の獲得に先行し、緑膿菌の野生型とさまざまなレベルの変異体が定期的に暴露されます。トブラマイシンに対する耐性の増加により、耐性獲得率はすべてのグループで同様であるが、耐性系統は最初の選択で生き残る可能性が高いことが確認されました。これは、耐性が高い細菌集団は、耐性が低い、または耐性がない集団よりも耐性を発現する可能性が高いことを示唆しています58。最後に、結核菌 59、シュードモナス属 60 および大腸菌 61 など、いくつかの研究が持続性と耐性発現の可能性との関連性を指摘しています。

利用可能なバイオフィルム法の詳細な概要については、最近のレビュー 62、63、64、65 を参照してください。重要なのは、ほとんどの進化実験の一般的な設定は似ていますが（成長、治療、新しい環境への移動のサイクルを繰り返す）（図1a）、使用されるモデルは実験の結果に大きな影響を与える可能性があり、すべてに影響を与えるわけではありません。 vitro モデルは in vivo の進化を模倣します。たとえば、多くのモデルは、in vivo 条件をあまり反映しない表面と増殖培地を使用します 15。

a バイオフィルムの抗菌処理を含む進化実験の一般的なセットアップの概略図。 b 緑膿菌は SCFM2 内で容易に凝集体を形成するため、これを関連する微小環境における進化を研究するのに適した増殖培地としています。 c 全ゲノム配列分析（例 89 に示す、フラノン C-30 に繰り返し曝露した後に緑膿菌 PAO1 に発生する変異）に基づいて、変異の頻度を計算し、タンパク質機能に対する変異の影響（例 89 に示す fusA1）を計算することができます。推定。 d 表現型の特徴付けは、通常、抗菌薬感受性（ここではディスク拡散で示されています）とCFUの数（トブラマイシンへの繰り返し曝露サイクル後の3つの複製B.セノセパシア集団におけるCFUの数を例70として示しています）を決定することから始まります。バイオフィルムにおける実験的進化は、しばしば小型コロニー変異体 (SCV) の発生につながります (例として緑膿菌 AA2 を示し、写真提供: A. Sass 博士)。最後に、代謝の変化は進化の過程で起こり、微量熱量測定などを使用して測定できます。 WT 緑膿菌 PAO1 (左) またはトブラマイシンの存在下で進化した同じ菌株 (右) の処理後の代謝活性を例として示します。

静的システムでは、バイオフィルムが成長して処理され、その後細胞が収集されて新しいサイクルが開始されます。動的システムでは、バイオフィルムは破壊されることなく継続的に成長し、処理されます。

プラスチックまたはガラスビーズ上に形成されたバイオフィルムは、進化を研究するために頻繁に使用されます17、66、67、68、69、70、71、72。ビーズモデルはもともと、Burkholderia cenocepacia 22 によるビーズへの毎日の付着およびビーズからの分散を選択するために開発されました。このセットアップでは、ビーズは、ビーズに付着してバイオフィルムを形成する細菌と一緒にインキュベートされます。次に、バイオフィルムを含むビーズを、新しい空のビーズと新鮮な培地を含む別の受容チューブに移します。これにより、バイオフィルムを乱すことなく新しいビーズのコロニー形成が可能になります。抗菌治療に対する反応の研究に向けてより調整されたこのモデルの変形も開発されています 70,73。表面に付着したバイオフィルムのみを研究できるという事実にもかかわらず、使いやすさと、さまざまな生物や増殖培地との適合性により、これは魅力的なモデルとなっています。

コロニーバイオフィルムは、試験微生物を接種したメンブランフィルター上に形成され、その後、適切な増殖培地に置かれます 74,75。栄養素は膜を通って拡散し、細菌はフィルター膜上にバイオフィルムを形成します。実験中にフィルターを別の寒天プレートに移動すると、バイオフィルムが抗菌剤に簡単にさらされる可能性があります。サイクルの終了時に細菌細胞が膜から剥離され、得られた懸濁液を新しいフィルター膜の接種に使用できます。

カルガリーバイオフィルムデバイスは、96 ウェルプレートとペグ付きの蓋で構成されており、それぞれがウェルに沈められ、バイオフィルムの形成をサポートします。この装置は元々、最小バイオフィルム除去濃度を測定するために開発されました76。実験の進化中に、ペグ付きの蓋を新しい 96 ウェルプレートに簡単に移すことができ、超音波処理によってバイオフィルムをペグから分散させることができます。得られた細胞懸濁液を使用して、新しい蓋のペグ上でバイオフィルムの形成を開始できます77。概念的に同様のシステム (FlexiPeg) が最近開発され、バイオフィルムにおける競争と適応性を研究するために使用されました 78,79。

動的モデルシステムでは、栄養分と老廃物がそれぞれ継続的に追加および除去されながら、表面上でバイオフィルムが成長します。技術的にはより要求が厳しいものの、これらのシステムの利点は、異なる治療サイクルの間にバイオフィルムを分散させる必要がないことです。例には、ガラス表面を備えたアクリル製フローセル 80、ザルトリウスバイオリアクター 81、82、83、およびさまざまなマイクロ流体デバイス 84、85、86 が含まれます。

多くの研究では標準的な増殖培地 (LB ブロスなど) が使用されていますが、検証済みの in vivo 様培地を使用することで、in vivo 環境をより厳密に模倣することが可能です。これには、懸濁した細菌バイオフィルム凝集体が急速に形成されるさまざまな人工 CF 喀痰培地 87 が含まれ（図 1b）、緑膿菌バイオフィルムにおけるシプロフロキサシン耐性 88 およびトブラマイシン / フラノン C-3089 の組み合わせに対する耐性の発現を研究するために使用されました。

適切な選択圧の選択は進化実験における重要な決定であり、実験の結果に大きな影響を与える可能性があります。

適応のメカニズムを研究する場合、抗生物質の濃度は細菌に影響を与えるのに十分な高さである必要がありますが、十分な数の細菌が生存して次の実験サイクルを開始できるように高すぎてもいけません。どの濃度範囲がバイオフィルムの変異体選択ウィンドウ (MSW、ボックス 1) を構成するかについての情報はなく、バイオフィルム生物学のさまざまな側面がこのウィンドウに影響を与える可能性があります 90,91。バイオフィルムの成長が MSW91 の変化や歪みを引き起こすと予測されていますが、大腸菌を用いた最近の研究では、(5 種類の異なる抗生物質に対する) 最小選択濃度値が浮遊培養物とバイオフィルムの間で差がないことが示されました 79。バイオフィルム MSW に関する不確実性のため、抗生物質濃度は MIC70 または最小バイオフィルム阻害濃度 74 に基づいて選択されることがよくあります。別の戦略は、例えば吸入療法後の CF 患者の喀痰など、生体内で達成可能な抗菌濃度を使用することです 75。選択の強さは、進化の軌跡に大きく影響する可能性がある。例えば、チゲサイクリン MIC が低い緑膿菌変異体に対してチゲサイクリンの亜致死濃度を選択し、致死濃度で選択された変異体よりも他の抗生物質に対して MIC が高いなど。一般に、穏やかな選択圧の存在下での in vitro 進化はより多様な集団をもたらしますが、高い選択圧にさらされると中間の感受性を持つ細菌が排除され、最も強い影響を持つ変異のみが検出されます 93。感染部位での抗生物質の濃度は投与方法に依存し、吸入療法や局所塗布では高濃度が達成できる可能性がありますが、抗生物質が全身投与される場合、感染部位での抗生物質濃度は大幅に低くなることがよくあります94,95。。さらに、バイオフィルムは独立した薬理学的微小区画と考えることができ 96,97、拡散制限によりバイオフィルム内に抗生物質の濃度勾配が形成されることがよくあります 26,27,28,29,98。

進化の軌跡は、異なるクラスに属する抗生物質間で異なります。たとえば、緑膿菌が亜致死濃度のトブラマイシンまたはチゲサイクリンの存在下で進化した場合、変異体は亜致死濃度のチゲサイクリンのみで選択されました92。これらの軌跡は抗菌剤の作用機序に依存しますが、さまざまな種類の殺菌抗生物質には、主に高分子（DNA、タンパク質、ペプチドグリカン）の生合成を阻害し、代謝の変化を誘導して細菌の形成を促進するなどの共通の側面もあります。活性酸素種99,100。さらに、一部の抗生物質の活性は微生物の代謝に強く依存しますが、他の抗生物質の殺菌活性は代謝に弱くしか依存しません101。前者のグループの抗生物質に対しては耐性が急速に発達しますが、後者に対してはそうではありません102。

最後に、治療計画は、その後の進化の軌跡に影響を与える可能性があります。抗菌剤の濃度は、進化実験の過程で一定に保つこともできます 70,75 、または細菌を徐々に増加する抗菌濃度に曝露することもできます 82,85。曝露は連続的に行うこともできます 69,74,75,82,85 または断続的に行うこともできます 70,77,103,104。各治療サイクル後のバイオフィルムの再成長により、実験全体を通じて同様の細胞密度を持つバイオフィルムが確実に研究され、再成長段階では 2 つの治療間の抗生物質濃度の減少を模倣することができます。さらに、継続的な曝露は成長に依存した選択を課す可能性がありますが、これは抗生物質を使用しない成長のラウンドごとに治療を分けることで回避できます42。

抗菌薬感受性の実験的進化は、より複雑な設定ではまだ広範囲に研究されていないが、いくつかの研究は、多微生物バイオフィルムを用いた進化実験が実行可能であることを示している。例としては、ベンジルアルコール上で進化した二重種バイオフィルム（アシネトバクター属 + シュードモナス・プチダ）105、黄色ブドウ球菌106またはCFマイクロバイオームのメンバーの存在下での緑膿菌の進化107、ストレプトマイシンに繰り返し曝露された34種のモデル細菌群集108が含まれる。 in vivo 研究の例には、マウスの鼻腔定着の繰り返しによる肺炎連鎖球菌の連続増殖 109 や、ゼブラフィッシュ幼生の腸内でのシュワネラオナイデンシスの生活への適応 110 が含まれます。最近、Caenorhabditis elegans 感染モデルを使用して、B. cenocepacia を非メバロン酸経路の阻害剤である抗病原性化合物 FR900098 に繰り返し曝露しても、この化合物に対する感受性の変化が生じないことが示されました 111。

実験的進化研究のために分離株を選択するとき、および結果を分析するときは、株間の変動を考慮する必要があります。たとえば、in vitro バイオフィルム形態および転写プロファイルに基づいて、臨床緑膿菌分離株を異なるクラスターにグループ化することができ、異なるクラスター内の菌株は、制限されたコアバイオフィルム転写プロファイルのみを共有します。これらの違いは、バイオフィルムの成熟状態ではなく、個々の菌株の遺伝的背景によって形成されるようです112。また、耐性は個々の株の背景によって大部分が決定され、この株依存性の耐性は抗生物質にも依存しており、臨床緑膿菌分離株の交差耐性はシプロフロキサシンとトブラマイシンでは観察されるが、コリスチンでは観察されない113。この株間の変動は、実験進化中の進化の軌跡に重大な影響を与える可能性があり、感受性の低下に対する特定の耐性および耐性メカニズムの寄与の解明を複雑にする可能性があります。同時に、並行した解決策を考え出す細菌性病原体の多用途性も強調しています。

抗菌剤感受性の変化は、抗菌剤の存在下で集団が進化した場合に観察されるだけでなく、抗生物質の非存在下でバイオフィルムが進化するいくつかの実験的進化研究でも観察されています（例、大腸菌114およびP.緑膿菌74,115)。これらの変化は、バイオフィルムの高い突然変異率の結果である可能性が高く（ボックス 2）、感受性の低下に関与する他のさまざまなメカニズムと組み合わせると 12,39、結果として生じる多様性が集団の生存に役立ちます（「保険仮説」）15,116,117,118。ただし、次のセクションでは、抗生物質への曝露中に発生するバイオフィルムの抗菌剤感受性の変化を調査する実験的進化研究に焦点を当てます。

抗生物質の存在下での進化実験中に緑膿菌バイオフィルムで変異した遺伝子の非網羅的な概要を表 1 に示します。

ポリカーボネート膜上に形成された緑膿菌 PAO1 コロニーバイオフィルムでは、阻害濃度以下の濃度のシプロフロキサシンに曝露すると、この抗生物質に対する感受性の低下が急速に誘導されました 74。 7継代後、耐性亜集団のサイズはプランクトン集団よりもバイオフィルムの方が著しく大きく、シプロフロキサシンで進化したバイオフィルムに由来する選択されたコロニーに対するシプロフロキサシンの平均MICは実験進化中に大幅に増加した。後者は浮遊培養物に由来するコロニーでは観察されませんでした（ただし、最も高い MIC 値を持つクローンは浮遊培養物に由来しました）74。突然変異の数と突然変異スペクトルの両方が進化した集団間で異なりました。シプロフロキサシンで進化した集団では有意に多くの非同義突然変異が観察され、浮遊性集団では遷移がより頻繁に発生し、バイオフィルムではトランスバージョンとインデルがより頻繁に発生しました（後者は後者）。酸素が制限された条件下での挿入配列のより高い活性に潜在的に関連している119,120)。 mexR (排出ポンプの調節因子 MexAB-OprM)、nfxB (MexCD-OprJ)、および mexS (MexEF-OprN) の変異は、シプロフロキサシンの存在下で発生したバイオフィルムで頻繁に見られましたが、nalC および nalD (MexAB-OprM の調節因子) の変異は頻繁に見られました。 gyrA と gyrB だけでなく、シプロフロキサシンによって進化した浮遊生物集団でも頻繁に見つかりました。さらに、代謝に関連する遺伝子の低頻度の突然変異が、シプロフロキサシンの存在下で発生したいくつかのバイオフィルムで見つかりました。変異遺伝子には、PA1252 (リンゴ酸デヒドロゲナーゼ)、nuoJ、および PA1054 (NADH デヒドロゲナーゼ) が含まれます 74。シプロフロキサシンに曝露されたバイオフィルムで同定された代謝に関連する追加の変異には、TCAサイクル（例、sdhA）、ポリアミンおよびアルギニンの代謝および輸送（例、argS）に関連する遺伝子の変異、およびさまざまなシグマ因子（rpoNを含む）をコードする遺伝子の変異が含まれる。および rpoS)121。後者の変異は、進化したバイオフィルムから回収されたシプロフロキサシン耐性クローンで観察された遅滞期の延長と倍加時間の増加を説明するのに役立つ可能性があります。全体として、これらのデータは、阻害濃度以下のシプロフロキサシン濃度に曝露されたバイオフィルムで増殖した緑膿菌細胞は、低レベルの耐性につながる変異をより頻繁に保有しており、その結果、生体内でのシプロフロキサシン耐性の段階的発現を促進する可能性があることを示唆しています74。興味深いことに、同じ実験条件下では、主要な緑膿菌カタラーゼ KatA の欠如により、バイオフィルム内のシプロフロキサシン耐性集団の割合が増加し、進化した ΔkatA バイオフィルムではより多くの変異が観察され 75、酸化ストレスが生物多様性の生成に果たせる役割を再度強調しています。バイオフィルム122。それにもかかわらず、嫌気的条件下でバイオフィルムが進化した後にもシプロフロキサシン耐性変異体が出現するという観察は、酸化ストレスが唯一の機構ではないことを実証している75。

ビーズベースのモデルを使用して、トブラマイシン濃度の増加の非存在下または存在下で緑膿菌 PA14 バイオフィルムを進化させました。トブラマイシンの存在下で進化したバイオフィルムでは、MIC 値が 16 倍に増加し、実験終了時には、トブラマイシンに曝露されたすべてのバイオフィルムが fusA1 (伸長因子 G をコードする)73 に変異を獲得していました。 fusA1 変異はトブラマイシンに曝露された浮遊生物集団でも発生しましたが、それらはすべての最終バイオフィルム集団で優勢でしたが、浮遊生物的に進化した集団ではその頻度はよりばらつきがありました。進化した変異体クローンを調べると、fusA1変異だけでトブラマイシンMICが2～4倍増加し、バイオフィルムが生き残るトブラマイシン濃度が少なくとも6倍増加することが明らかになった。緑膿菌バイオフィルム集団は、orfKHLN 遺伝子（O 抗原生合成酵素をコードする）にも頻繁に変異を獲得しており、orfN に変異と fusA1 変異を有する変異体は、fusA1 のみに変異を有する変異体よりも耐性が高かった。

最後に、最近、緑膿菌バイオフィルムおよび浮遊培養物における実験的進化を利用して、人工カチオン性抗菌ペプチド WLBU2123 に対する耐性メカニズムを特定しました。 WGSは、生存集団が3つの重要な機能カテゴリー、すなわちLPS修飾（pmrB）、O抗原生合成（orfN）およびバイオフィルム形成（wspFおよびmorA）のうち少なくとも2つの変異を有することを明らかにした。 pmrB と orfN はカチオン性ペプチドに対する耐性に関与することが知られていますが、wsp 経路の遺伝子 (バイオフィルムと浮遊培養物の両方で選択される) における変異の発生はさらに予想外でした。 wsp 変異を持つ耐性クローンはより多くの凝集を示し、凝集および/またはバイオフィルム形成の増加自体が WLBU2 耐性に寄与する可能性があることを示唆しています 123。

抗生物質の存在下での進化実験中に A. baumannii バイオフィルムで変異した遺伝子の非網羅的な概要を表 1 に示します。

蠕動ポンプに取り付けられたプラスチックチューブ内で A. baumannii バイオフィルムが形成される流動モデルを使用して、シプロフロキサシン (0.5 x MIC) およびテトラサイクリン (0.25 x MIC) への曝露の影響が調査されました 124。抗生物質に曝露されたバイオフィルムから分散した細胞はより高いMICを有し、シプロフロキサシン処理バイオフィルムからの分離株の93%がシプロフロキサシンに対する耐性の増加を示し、テトラサイクリン処理バイオフィルムからの分離株の53%がテトラサイクリンに対する耐性の増加を示した。シプロフロキサシン処理バイオフィルムからの分離株の 80% もテトラサイクリンに対する耐性の増加を示しましたが、テトラサイクリン処理バイオフィルムからの分離株では交差耐性は観察されませんでした。シプロフロキサシンで処理したバイオフィルムからの細胞で選択された変異は、多くの場合、耐性に直接関連している可能性があります。たとえば、smpB の変異（その欠失は、おそらく染色体の断片化に対する予防効果により、フルオロキノロンに対する耐性の増加につながります）および adeS の変異（これは、 AdeABC流出システムの過剰発現）124。 K 遺伝子座 (莢膜多糖類の生成) に属する 2 つの遺伝子の変異が、いずれかの抗生物質に曝露されたサンプルで見つかり、これらの変異は多くの場合、抗生物質耐性表現型と関連していました。テトラサイクリン処理バイオフィルムからの分離株では、いくつかの遺伝子が一般的に変異していた。これらの変異は、テトラサイクリンに対する耐性の増加ではなく、バイオフィルム形成の増加と正の相関があることが多く、c-di-GMP レベルの調節に関与するタンパク質をコードする領域に 8706 bp の大きな欠失が含まれています 124。

上述のビーズモデルは、シプロフロキサシン 69 またはトブラマイシン 73 の存在下での A. バウマンニバイオフィルムの進化を研究するためにも使用されています。濃度を増加させながらシプロフロキサシンに曝露した浮遊培養物とバイオフィルムを比較すると、浮遊培養物では高レベルの耐性が急速に発現（MIC が約 160 倍増加）する一方、低レベルの耐性を持つ変異体（MIC が約 6 倍増加）が発生したことが示されました。バイオフィルム69。リプレッサー adeL (AdeFGH 排出ポンプの調節因子) または adeN (AdeIJK 排出ポンプの調節因子) を破壊する変異は、それぞれバイオフィルムと浮遊性クローンで優勢であり、他の生物で以前に確認されているように、ライフスタイル特異的な排出システムの存在を示唆しています 125。興味深いことに、adeS (AdeABC流出ポンプの調節因子) の変異は露出したバイオフィルムに出現しましたが、その後、adeL 変異によって打ち負かされました。これは、A. baumannii124 を用いた別の研究では観察されなかったものです。いくつかの突然変異は浮遊生物集団ですぐに固定に達しましたが（adeN 突然変異を含む遺伝的背景における gyrA の単一の高頻度突然変異を含む）、バイオフィルムではより多くの多様性が維持されました。トブラマイシン選択下で増殖した A. baumannii バイオフィルムは、MIC の 8 ～ 32 倍の増加を示し、またこの種では、fusA1 の変異がトブラマイシンに曝露されたすべての反復集団で発生しました 73。緑膿菌バイオフィルムとは対照的に、トブラマイシン処理した A. バウマンニバイオフィルムは、ptsP (ホスホエノールピルビン酸ホスホトランスフェラーゼをコードする) に変異を急速に蓄積し、fusA1 と ptsP の変異は、処理したバイオフィルムと浮遊菌集団で同様の頻度に達しました。 fusA1 の変異のみを持つ進化した変異体クローンは MIC の 4 倍の増加を示しましたが、fusA1 ptsP 二重変異体は 8 倍の増加を示しました。 fusA1 (必須遺伝子) とは対照的に、ptsP 変異はフレームシフトを引き起こすインデルであるため、機能喪失型変異である可能性があります。さらに、cyoAB（電子伝達系に関与するシトクロムbo3ユビキノールオキシダーゼの2つのサブユニットをコードする）の6つの変異は、バイオフィルムでのみ発生した。しかし、これらの突然変異は、より高いトブラマイシン濃度では fusA1 ptsP 遺伝子型によって競合されました 73。

リファンピシンまたはカナマイシンの存在下でフローセル内で増殖した大腸菌バイオフィルムは、バイオフィルム内での増殖が、抗生物質の非存在下でより適応力の高い非耐性細胞との競争から耐性細胞をどのように保護できるかという問題に取り組むために使用されました80。物理的制約とバイオフィルムの不均一性のため、個々の細胞は他の細胞のサブセットとのみ競合すればよいと合理的に想定できます 15 が、構造化されていない浮遊性集団では、細胞は他のすべての細胞と競合しなければならないグローバル競争を経験することになります 126。接種材料にはすでに低レベルのカナマイシン耐性変異株とリファンピシン耐性変異株が含まれており、抗生物質の非存在下でバイオフィルムが形成されると、その数は約 45 倍に増加しました。リファンピシンによる処理はリファンピシン耐性の固定をもたらしました（すなわち、集団全体が耐性になりました）が、カナマイシン処理では52％の耐性細胞を含む集団が生じました。治療を中止しても耐性細胞の割合は変化しなかったが、バイオフィルム細胞を浮遊培養に移すと、カナマイシン（リファンピシンではない）耐性は徐々に元の低いレベルに戻った80。この研究は、バイオフィルムの耐性は新たな突然変異の結果である可能性があるが、バイオフィルム環境の外ではあまり適合しない既存の突然変異体の選択によるものである可能性があることを示しています。シリコンディスク上で増殖させ、高濃度 (5 x MIC) および非常に高濃度 (80 x MIC) のアミカシンに断続的に曝露された大腸菌バイオフィルムは、最初の処理後に生存細胞数が大幅に減少しますが、生存細胞数は減少します。細胞は急速に増加します（5 x MIC への曝露では約 100% の生存、80 x MIC への曝露では約 1% の生存）104。浮遊培養では、最初の処理後の減少はより顕著で、5 x MIC への曝露で最終的に生き残る細胞はわずか約 0.1% です (80 x MIC への曝露では 3 サイクル後に生存者は観察されません)。バイオフィルムにおけるこの生存率の増加は、処理されたバイオフィルムにおける MIC の急速な増加と関連していますが、浮遊培養における MIC の増加ははるかに低いです。 sbmA (アミノグリコシドに対する大腸菌耐性の増加に以前は関連していた内膜ペプチド輸送体をコードする) の変異は、処理したすべてのバイオフィルム集団と処理した浮遊菌集団の 3 つのうち 2 つで見つかりましたが、未処理の対照では見つかりませんでした。 6 つの進化したバイオフィルム集団のうち 5 つに複数の sbmA 変異があり、クローン干渉が示唆されました。 fusA の変異は、いくつかの中間バイオフィルム集団で選択され、実験の最後には 1 つのバイオフィルム集団で選択されました。浮遊培養物では fusA 変異は選択されませんでした。 fusA と sbmA はバイオフィルム集団内に共存できますが、fusA 変異は sbmA 変異よりも早く (または同時に最も遅く) 現れます 104。抗生物質の非存在下では、fusA 変異体は sbmA 変異体よりも適応度が低く、前者はバイオフィルム内で維持されている間にプランクトン培養での処理間の期間に逆選択されたことが示唆されます。 sbmA 遺伝子の機能喪失型変異は、MIC の中程度の増加 (16 μg/ml から 24 μg/ml) を引き起こしますが、fusA 変異は MIC 値 48 μg/ml を引き起こします。最も高いMIC値（128μg/ml）は、fusAの変異と、sbmAの機能喪失変異およびfre（NAD(P)Hフラビン還元酵素をコードする）の変異を組み合わせたクローンで観察された。または、yfgZ（酸化ストレスおよびFe-Sクラスター合成中の修復に関与するタンパク質をコードする）の変異と組み合わされたfusAの変異を保有しています。一般に、浮遊培養では、多様な遺伝子セットに変異を持つクローンが選択され、これらのクローンの MIC は通常、バイオフィルム条件下で進化したクローンよりも低かった 104。興味深いことに、処理されたバイオフィルムから回収されたクローンは、プランクトン培養で増殖した場合と比較して、バイオフィルムで増殖した場合の方が処理後の生存率が高く、進化したバイオフィルム集団の大部分には、タイプ 1 線毛の FimH 先端接着因子をコードする fimH の変異が含まれていました。 fimH 変異体はバイオフィルム形成の強化とアミカシン感受性の低下を示します。これらのデータを総合すると、耐性の増加につながる変異が存在しない場合でも、バイオフィルム環境自体が、新たな遺伝的耐性変異の発生を増加させることにより、アミカシンへの曝露時の生存率の向上に寄与していることが示唆されます104。

アジスロマイシン、セフォタキシム、およびシプロフロキサシンの存在下および非存在下で、ガラスビーズ上および浮遊培養物上で増殖させたネズミチフス菌バイオフィルムの実験的進化により、バイオフィルムおよび浮遊培養物が同じ時間枠でこれらの抗生物質に対する耐性を発現することが示された72。ただし、進化した変異体の表現型は条件によって異なります。例えば、セフォタキシムに曝露された浮遊生物集団（主にセフォタキシムに対して耐性になる）とは対照的に、セフォタキシムの存在下で進化したバイオフィルムは広範囲の抗生物質に対して耐性を示します72,127。進化した浮遊生物およびバイオフィルム集団では、同じ遺伝子がしばしば変異していました。たとえば、acrB および ramR (アジスロマイシンへの曝露後)、envZ (セフォタキシム) および gyrA (シプロフロキサシン) の変異です。ただし、正確な変異は異なる場合もありました（例、ramR: 浮遊培養物の term194Tyr 対バイオフィルムの Thr18Pro; gyrA: 浮遊培養物の Ser83Tyr 対バイオフィルムの Ser83Phe）72,127。これらの変異は、流出（アジスロマイシン）、膜透過性の低下（セフォタキシム）、および標的修飾（シプロフロキサシン）が、観察された感受性の低下に関与する最も重要なメカニズムであることを示唆していますが、他にも多くの変異が同定されており、WGS は、異なる変異体が異なる経路をたどることを明確に示しました。適応。

LTEE や他の多くの研究から、全体として多様化には高度な並行性があり、進化は複製系統間および異なる研究室で行われた異なる実験間で再現可能であるようであり、観察された進化的変化がランダムなアーチファクトではないことを示唆していることがわかっています。。このことのさらなる証拠は、実験的に進化した緑膿菌分離株と、CF の慢性気道感染症からの変異を含む臨床分離株の突然変異の直接比較からもたらされます。全体として、これらの比較は、インビトロで観察された変化がインビボでの感受性の進化に関連していることを裏付ける。例えば、異なるシプロフロキサシン耐性機構の選択はライフスタイル依存性である74。これは、慢性感染症から回復した分離株ではあまり一般的ではない、急性感染症（例、尿路感染症）からの分離株におけるシプロフロキサシン標的遺伝子の変異の有病率の高さと一致している128。。同様に、緑膿菌遺伝子 fusA1 および ptsP の変異は、in vitro 進化中に高頻度で発生し、同一の変異が臨床分離株でも観察されています 73,89。緑膿菌の慢性感染症への適応はCFだけで起こるわけではありません。例えば、慢性閉塞性肺疾患患者から回収された分離株でも、進化実験研究で頻繁に同定される遺伝子（mexA、mexB、oprM、oprF など）に突然変異が発生します129。

間接的な証拠は、in vitroで進化した分離株の表現型と慢性感染時に関与する分離株の表現型の比較から得られます54。例えば、若いCF患者から回収された緑膿菌分離株は、通常、抗生物質に対する耐性と耐性が低く、年齢が上がるにつれて薬剤耐性分離株の頻度が増加しました。耐性分離株の頻度の増加は高齢の患者でのみ観察されました58。これらの高齢患者には2つの亜集団が存在し、1つは高耐性の分離株で構成され、もう1つは低レベルの耐性を保持した超耐性の分離株で構成されており、in vivoでの耐性も耐性発現への「足がかり」となり得ることが示唆されている58。最後に、バイオフィルムは少なくとも一部の急性気道感染症にも存在し、急性感染症と慢性感染症の主な違いは、それぞれ浮遊性ライフスタイルとバイオフィルムライフスタイルとの関連ではなく、むしろ代謝の違いに関連している可能性があるという最近の発見130代謝に関連する遺伝子の変異は実験進化中に頻繁に同定されるため、これは in vitro 実験進化研究の観察と一致しています 73,74,121。

in vitro と in vivo の進化の間のこれらの類似点は、in vitro で特定された遺伝子変化が in vivo で起こることと関連していることを強く示唆していますが、一方ではこれらの遺伝子変化 (代謝関連遺伝子などにおける) の関連性が実験的に検証され、他方では抗菌剤感受性の低下は依然として必要である。

実験進化中のバイオフィルム形成能力の変化も、バイオフィルム感受性に影響を与える可能性があります。ダプトマイシンの存在下では、バイオリアクター内で増殖したエンテロコッカス・フェカリスのバイオフィルムはすぐに抗生物質に対する耐性を獲得しますが、同時にダプトマイシン耐性株ではバイオフィルムの形成が増加しました81。 WGS は、最終的にバイオフィルム形成の増加につながる変異の組み合わせを特定しました。このバイオフィルム形成の増加は耐性増加の必須条件ではありませんが、耐性系統の大部分で観察されました 81。バイオフィルム形成の増加は、A. バウマンニバイオフィルムの実験進化中にも観察され（ビーズモデル 69 およびフローシステム 124 の両方）、未処理およびシプロフロキサシン処理バイオフィルムからの分離株は、両方の研究において開始培養物と比較してバイオフィルム形成能力の増加を示しました。さらに、フローシステムでは、テトラサイクリン処理バイオフィルムからの多くの分離株がバイオフィルム形成のさらなる増加を示しました124。バイオフィルム形成の増加に関連するいくつかの変異は処理サンプルと未処理サンプルで発生しましたが（例、バイオフィルム関連タンパク質BapをコードするABUW_0885の変異）、その他の変異（例、線毛付着因子をコードするABUW_2055の変異）は未処理のバイオフィルムでのみ発生しました124。すでに上で概説したように、fimH 変異は、未処理の対照と同様に、アミカシンで処理した大腸菌バイオフィルム集団の大部分で見つかりました。 fimH 変異体は、高濃度のアミカシン 104 に曝露すると、バイオフィルム形成能力の増加と生存率の増加を示しました。ガラスビーズ上で増殖させたネズミチフス菌バイオフィルムを用いた研究では、抗菌剤耐性とバイオフィルム形成との間に明らかなトレードオフが観察された 72,127。実験の過程で、未処理のガラスビーズから回収されたコロニーではバイオフィルム形成能力（クリスタルバイオレット染色で測定）が増加しました。これは、複数の未処理ガラスビーズで発生したcytRのミスセンス変異（バイオフィルム形成を増加させることが知られています）と関連していました。血統72．しかし、抗生物質（特にアジスロマイシンとセフォタキシム）の存在下で発生したバイオフィルムから回収されたコロニーは、非曝露のバイオフィルムと比較してバイオフィルム形成の減少を示し、それらのコロニーにはcytR72の変異は含まれませんでした。阻害濃度以下のセフォタキシムに曝露すると、EnvZ の C 末端触媒/ATP 結合ドメインの変異が選択され、その結果ポリン OmpF レベルが低下し、透過性が低下します。しかし、EnvZ はカーリ生成も制御しており、envZ 変異体ではカーリ生成の減少とバイオフィルム形成が観察され、バイオフィルム感受性とバイオフィルム形成の間のトレードオフが示唆されています。全体として、これらのデータは、実験進化中のバイオフィルム形成の変化と抗菌薬感受性との関連性が複雑であり、おそらく種、モデル、抗生物質に依存していることを示唆しています。

上で論じた研究では異なるモデル系、抗生物質、種、菌株が使用されていますが、いくつかの共通のパターンが現れています。

実験進化中の感受性の低下は浮遊生物集団とバイオフィルム集団の両方で発生しますが、関与するメカニズムとこの感受性の低下に向けた軌跡は同一ではありません。抗生物質の存在下で進化した浮遊生物集団では、抗生物質の標的をコードする遺伝子の変異が頻繁に発生するが（例、シプロフロキサシンの存在下で進化した後のgyrAの変異）、進化したバイオフィルム集団にも関連する遺伝子に広範囲の変異が含まれている。排出と代謝における69,74,121。阻害濃度以下の抗生物質を使用した場合、よく混合された浮遊培養物での増殖は高レベルの耐性が選択される一方、空間的に構造化されたバイオフィルムでの増殖ではより低いレベルの耐性を持つ変異体が優先されます 69,74,121。しかし、進化の過程で段階的に増加または致死濃度の抗生物質が使用される場合、これは常に当てはまるわけではありません69、73、88、104。種依存性および/または抗生物質依存性の影響をまだ排除することはできませんが、このことは、治療計画自体が浮遊生物およびバイオフィルム集団の最終的な MIC レベルの決定に重要な役割を果たしているということを示唆しています。

進化したバイオフィルム集団は、対応する浮遊性集団よりも高い多様性を維持しており、成功した突然変異はすぐに固定に達し、バイオフィルム環境は、浮遊性培養物ですぐに打ち負かされる、適合度の低い耐性突然変異体のネガティブセレクションから保護されている可能性があります121。しかし、最近の研究では、表面関連大腸菌バイオフィルムにおける耐性の適応コストは、浮遊培養におけるものと変わらないことが示されました 79。さらに、別の最近の研究では、特定の環境が特定の突然変異に関連する適応度と耐性のレベルを共同決定することが示されています131。さまざまな（構造化された）環境でのフィットネスに影響を与えるパラメータについてより深い洞察を得るには、明らかにさらなる研究が必要です。さらに、バイオフィルム形成の増加につながる突然変異は、抗菌薬曝露を生き延びる耐性集団のサイズを増加させる可能性があり、その後耐性が発現する可能性があります104。

一部の遺伝子の変異は生物全体で見られますが（例、fusAの変異は緑膿菌、A.バウマンニ、および大腸菌で観察されています）、結果として生じる表現型は類似している可能性がありますが、異なる生物でも異なる遺伝子に変異が蓄積されます（表） 1)。このような並行戦略の一例は、緑膿菌 orfKHLN および A. バウマンニ cyoAB の変異です。これらの遺伝子は非常に異なる細胞プロセス (それぞれ O 抗原生合成と電子伝達) に関与していますが、いずれかの変異により、アミノグリコシドおよびアミノグリコシドの透過性が低下し、アミノグリコシド感受性の低下につながる可能性があります73。同様に、多くのさまざまな代謝遺伝子やシグマ因子の変異は、成長の低下や「遅れによる耐性」を引き起こす可能性があります。これは、突然変異、突然変異遺伝子、または異なる生物間で共有される代謝や遺伝子発現の違いを特定できない場合でも、バイオフィルム感受性の低下の背後にある基本的なメカニズムが、異なるクラスの抗生物質および異なる生物で類似している可能性があることを示唆しています。したがって、実験進化のデータは、バイオフィルムにおける抗菌薬耐性の共通の遺伝的または生化学的根拠の証拠は見つからなかったが、多くの遺伝子、タンパク質、代謝経路が集合的に生理学的状態を決定していると結論付けた最近の研究の結論と一致しています。およびバイオフィルム内の細菌細胞の感受性132。

私たちは、実験の進化が、バイオフィルムの抗菌薬感受性の低下の背後にあり、抗菌治療の結果を決定する耐性、耐性、および持続性の相互作用を解明するのに役立ち、そして今後も役立つと信じています。しかし、さまざまな生物体および多微生物群集における変異、遺伝子発現および代謝の変化の複雑なパターンを特定するには、学際的かつ全体的なアプローチが必要であり、関連するモデルシステムの使用から大きな利益が得られます。

現在の調査ではデータセットが生成または分析されていないため、データ共有はこの記事には適用されません。

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TC と TB は、ルンドベック財団からの支援を認めます。 TC は FWO-Vlaanderen からのサポートを認めます。 MB はゲント大学の特別研究基金によって支援されました。

ゲント大学、薬剤微生物学研究室、ゲント、ベルギー

トム・コーニー & モナ・ボヴェ

コスタートンバイオフィルムセンター、コペンハーゲン大学、コペンハーゲン、デンマーク

トム・コーニー & トーマス・ビャルンショルト

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TC がこのレビューを考案しました。著者全員が執筆と編集に協力しました。

トム・コーニエへの手紙。

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転載と許可

Coenye, T.、Bové, M. & Bjarnsholt, T. 進化実験のレンズを通して見たバイオフィルムの抗菌剤感受性。 npj バイオフィルムマイクロバイオーム 8、82 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41522-022-00346-4

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受信日: 2022 年 6 月 7 日

受理日: 2022 年 10 月 4 日

公開日: 2022 年 10 月 18 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-022-00346-4

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