高い

Oct 11, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 3213 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

循環腫瘍細胞 (CTC) は、患者の血流内で原発腫瘍または転移腫瘍から広がることはほとんどない希少ながん細胞です。これらの超常現象細胞の遺伝的特徴を決定することにより、がんの病期分類と治療の指針となる重要なデータが得られます。マイクロ流体チップを使用した細胞集束は、CTCを濃縮するための効果的な方法として実装されています。シミュレーションにおけるマイクロチャネル幅全体にわたる異なる直径の粒子の明確な平衡位置は、中程度のレイノルズ数で WBC から乳がん細胞 (BCC) を分離および濃縮できることを示しました。したがって、CTCとWBCの両方を高効率で分離するための、従来型ではない（長いループとUターンの組み合わせ）スパイラルマイクロ流体デバイスによる流体力学に基づく受動的なサイズベースのラベルフリーマイクロ流体法を使用して、BCCのハイスループット分離を実証します。約 1.7 mL/min の流速で純度 (90% 以上) が得られ、同様のものと比較して高いスループットを実現します。この黄金の流速では、最大 92% の CTC が細胞懸濁液から分離されました。処理時間の速さ、簡素さ、および大量の患者の血液から CTC を収集できる可能性があるため、この方法は多くの用途で実際に使用できます。

がんは世界で 2 番目に多い死因として認識されています。がん関連の死亡者数は、2030 年までに 1,300 万人に達すると推定されています。世界保健機関 (WHO) は、がんの転移が起こる前に患者が診断され治療を受けていれば、これらの死亡の少なくとも 30% を防ぐことができると考えています。がん転移は、循環腫瘍細胞 (CTC) が原発または二次腫瘍部位から末梢血流に広がった後に発生します1。原発腫瘍が死亡を引き起こす可能性は低いですが、最終的には転移細胞が全死亡の 90 パーセントを占め、0.01 パーセントが転移を引き起こし、ほとんどの CTC は血流中で死亡します 2。突然変異により、原発腫瘍は転移性 CTC と比較して異なるゲノム情報を持つ可能性があります。腫瘍学者は CTC と原発腫瘍を比較し、CTC の方が原発腫瘍よりも有益であることを発見しました。 CTC は約半世紀前に発見されましたが、がん生物学における CTC の重要性が明らかになったのはつい最近です。この遅れは主に、CTC (患者の血液中の白血球約 1,000 ～ 5,000 個中、CTC は約 1 ～ 100 個の割合で発生します) の分離が困難であることに起因します 3,4,5。

CTC の迅速かつ効率的な分離を可能にする分離技術には大きな動機があります 6。原発腫瘍の一般的な診断戦略は、臨床症状の分析と画像技術によって異なります。これらの方法は腫瘍が一定の大きさに達した場合に使用できますが、初期段階では腫瘍の存在を検出することはできません 7,8。原発性固形腫瘍由来のがん細胞は血球よりも大きいため、研究者らはアプローチを親和性ベースの技術からサイズベースの分離に変更しました。この変更により、初期段階のがん患者をより簡単に特定できるようになりました9。マイクロ流体法は、サイズごとに細胞を高スループットに集束させるための効率的かつ強力なツールとして注目されています 10,11。マイクロ流体分離は、エネルギー消費量に応じて 2 つのカテゴリに分類されます。受動的な方法では主に流体力学的な力が使用されますが、能動的な方法ではセルを分離するために外力またはコントローラーが必要です12。アクティブな方法はより正確な分離を提供しますが、高価で複雑なコンポーネントがあり、スループットが低くなります。外力が粒子に作用し、流体力学的な力に打ち勝つには、より多くの時間が必要です13、14。

非常に低いレイノルズ数 (Re ≪ 1) により慣性が無視できる従来のマイクロ流体工学手法とは異なり、慣性マイクロ流体工学は中程度のレイノルズ数 (1 < Re < 100) の範囲内にあります。この範囲では、慣性と流体粘度は有限であり、(i) 慣性移動や (ii) 二次流れなどの興味深い効果を生み出します 15,16。直線、蛇行、特に螺旋パターンでの慣性マイクロ流体工学は、サイズベースの分離の最も魅力的な方法の 1 つです。慣性マイクロ流体工学は、その高スループット、シンプルさ、低コストにより、幅広い生物医学応用における有望な候補となっています 17,18。瀬尾ら。 Papautsky らは、2006 年にスパイラルマイクロチャネルを使用して粒子分離を初めて実行しました。その後、2008 年に Papautsky et al。は、この方法を使用して 1.9 um の粒子を 7.32 um の粒子から分離しました19。 2009 年に、ディカルロら。らは、この分離が曲線螺旋マイクロチャネル内の揚力と抗力のバランスによるものであることを示しました20。 2010 年以来、シンプルで低コストのプラットフォームを使用して、これらの方法の効率とスループットを向上させるために多くの努力が払われてきました 21,22。

2012 年に、Sun ら。第 1 フェーズの最後に、S 字型のスパイラルマイクロチャネルを設計しました。マイクロチャネルは効率と純度が高い一方で、いくつかの欠点があり、最も重大な問題は分離速度が約 0.5 ml/min と低いことでした 23。このタイプのスパイラルマイクロチャネルの分離速度は、その後の数年間で 2 倍になりました。 2017 年にロッサムらは、 1 ml/分を超える流速で 88% の効率と 91% の純度で細胞を分離します24。 2014 年に、Karabacak ら。は、血液成分を線形化し分離するために蛇行アレイマイクロチャネルを使用しました25。 2015 年に Sprenger らは、は、特殊なスパイラルマイクロチャネルを作成し、2 ～ 18 μm の細胞、つまり血球の全範囲を高い流量と精度で分離しました 26。 2017 年に、Sonmez ら。創造的に統合された蛇行パターンと螺旋パターン、および高いスループットと効率で細胞を分離しました27。 2018 年に、Ding らは循環癌細胞を分離するために、2 つの螺旋チャネルと曲がりくねった蛇行チャネルを含むデバイスを設計しました 28。

2017 年、リンら。は、長いループ、鋭角、および特定の幾何学模様を備えたスパイラルマイクロチップを設計し、90% 以上の純度と効率ですべての血液成分を分離することに成功しました29。 2019 年に、Kosar ら。および張ら。寸法、曲率半径、蛇行配列パターンを変更することで、がん細胞を正確に分離できるマイクロ流体チップを作成しました。これらのグループの研究の価値は、チップの単純さと低コストであり、これらはマイクロ流体チップの製造における 2 つの重要な基準です 2,30。 2017 年、キムら。細胞を分離するために独特の断面を持つ直線チャネルを使用しました31。 2021 年に、Warkiani らは細胞分離にさまざまな幾何学的パターンを備えた台形断面を使用し、新しい断面を導入しました。 2020 年に、ブライドルらはは、実験的方法を利用して、スパイラルマイクロチャネル内の細胞の変形を詳細に調査しました。一般に、実験の効率と速度を向上させるために多くの努力が払われてきました32、33、34。

この研究は、高効率および高スループットで癌細胞を分離するための、従来にないスパイラルマイクロチャネルの性能を示すことを目的としています。この目的のために、いくつかのパターンがシミュレートされ、調査されました。最後に、らせん配列パターンと蛇行配列パターンを組み合わせ、それらの利点を同時に利用することにより、U ターンを伴う新しいパターンが設計され、慣性力と二次流れの利点を同時に活用して、高スループットで効率的な細胞分離を達成しました。アスペクト比が大きいことで最大速度が動きやすくなり、曲率が大きいことで二次流れの操作が容易になります。

マイクロチャネルは、詰まりの防止、チップ製造とテストの簡素化、高効率と精製、高スループットなどのすべての基準を考慮して設計されています。次の段階では、標準的な粒子の移動挙動が調査され、CTC をそのサイズと形状に基づいて分離するための設計されたチップの機能が実証されました。最後に、BCC と WBC の混合培養をモデルシステムとして使用し、これらの細胞は 1.7 ml/min の黄金流速で 92% 以上の効率で分離に成功しました。これはシミュレーションおよび実験とよく一致しています。結果。実際のがん細胞の結果では、硬い標準粒子と比較して分離効率が約 2 ～ 3% 低下することが示されていますが、これは弾性慣性力の影響に関係しています。

直線状のマイクロチャネルでは、粒子はせん断応力を受けて抗力と法線応力が発生し、流れの方向に垂直な揚力が生じます 35。慣性マイクロ流体工学では、粒子の分離は慣性揚力と抗力の間のバランスに依存します 36,37。ニュートン流体では、長方形断面のマイクロチャネル内に粒子がランダムに放出されると、粒子はシステムの対称性に従い、内壁と外壁の中央にある 2 つの平衡位置に集束します 38,39。しかし、マイクロ流体工学の一般的な応用では、粘性と弾性挙動を伴う非ニュートン流体では、粒子が変形してチャネルの中心線に移動します。図 1 に示すように、粒子はポアズイユ流の 6 つの主な力の影響を受けて特定の横方向の位置に集中します40。

マイクロチャネル内の異なる横方向および縦方向の位置で粒子に適用される支配的な力。 (A) マイクロチャネルの長さ: 緑色の矢印は、マイクロチャネルに沿って粒子を移動させる流体抗力 (Ff) を示します。青い矢印は、粒子をマイクロチャネルの中心に向かって押す壁誘起揚力 (Fw) を示します。茶色の矢印は、粒子をマイクロチャネル壁に向かって押すせん断勾配揚力 (Fs) を示します。 (B) マイクロチャネル断面: オレンジ色の矢印は、チャネル壁の中央に粒子を収集する回転揚力 (Fr) を示します。紫色の矢印は、粒子を内壁から外壁に押し出すディーン抗力 (FD) を示します。最後に、赤い矢印は、粒子をチャネルの中心線に向かって押す弾性慣性揚力 (Fe) を示します。

最初の成分はせん断勾配揚力 (FS) と呼ばれ、流体要素間の速度の大きさの差に起因し、各領域でせん断速度を生み出します。このせん断勾配により、粒子はより高いせん断速度の領域に移動します。したがって、マイクロチャネルの中央に近い粒子はチャネルの壁に向かって推進されます41。ただし、粒子が壁の近くで閉じられると、流線が乱されます。その結果、粒子とマイクロチャネル壁の間の圧力が増加します42。壁誘起揚力 (FW) と呼ばれる 2 番目の成分は、せん断勾配揚力に対抗して粒子をチャネルの中心に向かって押し戻す、マイクロチャネル壁付近の圧力勾配によるものです。浮遊細胞は、これらの慣性揚力が平衡する位置に移動します。平衡位置の数はチャネルの断面積に関係します42。

3 番目の成分は、回転揚力 (Fr) と呼ばれる小さな力です。この力は粒子の回転によるものです。マイクロチャネル内で粒子の平衡位置が特定されるとすぐに、回転揚力が支配的になり、粒子は徐々に 4 つのチャネル壁すべての中心点に引き寄せられます 43,44。粒子の直径がマイクロチャネルの水力直径と比較して小さい場合 (粒子閉じ込め比 (λ = a/Dh、λ > 0.07))、正味慣性揚力 (FL) の大きさは Asmolov45 によって報告されています。

ここで、Rec と Rep (Rep = Rec λ2 > 1) は、それぞれマイクロチャネルと粒子のレイノルズ数です (慣性集束が λ、Rec、Rep などの無次元パラメーターに依存することが認められています)。 ρ は流体の密度、μ は流体の粘度、CL (Rec, xc) は正味慣性揚力の揚力係数であり、マイクロチャネル断面における正規化された粒子の位置の不定関数です。チャネルレイノルズ数。この係数は数値シミュレーションまたは実験測定から取得できますが、一般的なマイクロ流体アプリケーションでは、その値は 0.5 であると想定できます。せん断勾配揚力は、チャネルの中心線付近の粒子で支配的ですが、マイクロチャネルの中心から約 2.0 DH を超えると、揚力係数の符号が変化します。これは、せん断勾配に対する壁誘起揚力の優位性を示します。揚力20、36、43、46。

真っ直ぐなマイクロチャネルに曲率を導入すると、遠心効果により粒子をマイクロチャネルの内壁から外壁に向かって押す二次流れが生成されます。この二次流れは、マイクロチャネルの上壁と下壁の近くの領域を通って逆流します。したがって、ディーン渦と呼ばれる曲線マイクロチャネル内に 2 つの往復渦が生成されます。ディーンフローは、ディーン抗力 (FD) と呼ばれる新しい力を粒子に追加します。これは、マイクロチャネル内の粒子の集束位置を操作するのに役立ちます。 FD と FL の間のバランスにより、マイクロチャネル全体にわたるサイズベースの粒子選別メカニズムが実現します。この二次流れの速度は以下のように推定できます。ここで、Um = 3/2 Uavg はマイクロチャネルの最大速度、a は粒子直径、Dh は水力直径、r はチャネルの曲率です 47,48。 49、50、51。

揚力は粒子を平衡位置に固定しますが、ディーン抗力は粒子を断面の周りで移動させます。新しい平衡位置は、FL と FD の比から推定できます (δ は曲率比 29)。 FD は、速度場やマイクロチャネルパターンなどのさまざまなパラメータに基づいて、FL と等しいか、FL より大きく、または FL より小さくすることができます。流量が非常に低い場合、FD と FL は粒子を集束するには小さすぎるため、粒子はチャネル内に散乱したままになります。非常に高い流量では、FD が優勢となり、粒子をディーン二次流に強制的に従わせ、粒子を集束させるのではなく混合させます。したがって、黄金の流量範囲 FL/FD = 1 は 1 つの鋭い平衡位置のみを形成します 36,42。

チャネルの上壁および下壁近くの大きな粒子の場合、逆 FD は水平方向のせん断勾配と関連付けられ、粒子を内壁に向かって押します。より大きな粒子が内壁近くの領域に到達すると仮定します。その場合、大きな粒子はより多くの FL を経験し、小さな粒子よりも内壁に近い流線をたどることになるため、粒子はディーンの渦には従わなくなります。 FL はそれらに対峙し、より大きな粒子が効果的に集束できる力のバランスを作り出します。ただし、図 2 に示すように、FL は粒子が小さい場合に弱く、FD と競合できません。したがって、より小さい粒子は、外壁に到達するまでディーン二次流をたどります。この領域では、粒子の位置により力が弱く、より小さな粒子を循環させることができず、より小さな粒子の集束位置が作成されます。大きな粒子と小さな粒子の集束挙動のこの違いは、主に速度場と曲率比に依存し、粒子を分離する機会を提供します。したがって、ディーンフローは、中間 FL/FD 2、19、36、42、52、53 の潜在的な平衡位置の 1 つだけに粒子を集中させるのに役立ちます。

湾曲したチャネル内での細胞分離に対する二次流れの影響。大きな粒子は内壁近くに蓄積し、小さな粒子は外壁近くに蓄積します。まず、揚力が粒子に作用し、粒子は壁の中央の平衡位置に蓄積します。最後に、横方向の二次流れの存在により、小さな粒子が外壁に向かって移動します。赤い矢印は揚力を示し、青い矢印は抗力を示します。チャネルの曲率により、最大速度がチャネルの外側半分に伝達されます。大きな粒子はより大きな揚力を受けるため、外側半分を通過できず、最初は外側半分にあった大きな粒子は揚力と抗力の両方によって内壁に押し込まれます。一方、小さな粒子に対する垂直揚力は、粒子を流路内を上下に送り流して流れに従うのに十分ではないため、外壁に残ります。

流れ抵抗力 (Ff) と弾性慣性力 (Fe) を考慮すると、曲線マイクロチャネル内の粒子の最終的な位置を見つけるには 6 つの力を考慮する必要があります。弾性慣性力は主にレイノルズ (Re) 数とワイセンベルグ (Wi) 数に依存します。これら 2 つの無次元数の比は弾性数 (El) に対応し、これはチャネルの寸法と流体の特性にのみ依存します 40、54、55。血球のさまざまな成分は変形可能であり、そのサイズに基づいて曲線のマイクロチャネル内で分離できます。 FL は粒子直径の 4 乗に比例するため、血球は CTC に比べてサイズが小さいため、マイクロ流体チャネルに集中することがより困難になります。より小さな粒子を平衡位置に移動させるには、これらの粒子をより適切に集束させるために、より重要な混合力が必要です2,56,57。

この研究では、λ、Re、De を使用した一連の包括的な研究が開発されました。結果は、幅の広いチャネルでは速度プロファイルが滑らかになるにつれて、せん断勾配速度がこの方向に減少し、幅の広いチャネルではディーン抗力が粒子に対して支配的であることが示されました。マイクロチャネルに曲率を加えると、速度プロファイルの再分布を通じてせん断勾配揚力の方向と大きさが同時に変化します。したがって、慣性集束を設計するには単純な力の比では不十分であり、曲率の正確な設計が必要です46,58。この設計と以前のスパイラルマイクロチャネルの主な違いは、流路上にある U ターンです16。このターンは、従来のスパイラルチャネルの「ループ」の滑らかな曲率よりも鋭い曲率を持っています。長いループと鋭い回転の組み合わせにより、大細胞 (CTC) と小細胞 (WBC) の両方の集束が向上しますが、従来のスパイラルマイクロチャネルでは小さな細胞の集束にはあまり成功しません。これらの機能は、高流量およびマイクロチャネル曲線の正確な設計とともに、集束性を向上させます。これはシミュレーション結果ではっきりと確認できます 2,29,59。

この研究では、COMSOL Multiphysics 6.0 を使用してマイクロチャネル内の流れ場を解析し、断面速度プロファイルを取得しました。流れは単相で非圧縮性であると考えられ、層流モジュールを使用してナビエ・ストークス方程式が解かれました。境界条件については、マイクロチャネルの入口では一定の流量が仮定され、マイクロチャネルの出口では圧力がゼロに設定されました。さらに、壁には滑り止めと跳ね返り条件が適用されました。 3D モデルの構築には、物理制御された非常に細かいメッシュが使用されました。完全なメッシュは、およそ 0.9 のメッシュ品質を持つ約 500,000 のドメイン要素で構成され、他のデフォルトソルバーの中から GMRES 溶媒が選択されました。粒子に作用する揚力と抗力は、コーディングと粒子追跡モジュールによって適用されました。最後に、粒子を曲線座標で出口まで追跡し、シミュレーション結果が理論と一致し、傾向を説明していることを観察しました。

マイクロチャネルの全長は 187 mm です。この長さは、小さな粒子と大きな粒子が平衡状態で相互の最大距離に到達するために必要な経路を提供できます。経路がさらに長くなると、チャネルの詰まりや粒子の堆積の可能性が高まる可能性があります60。その幅は 500 μm、高さは 180 μm で、アスペクト比が大きいため、マイクロチャネル断面内の最大速度をシフトすることが容易になり、粒子を操作する能力が向上します61。マイクロチャネルの幅は、流れが出口にそらされる前に 500 µm から 900 µm に増加し、この拡張により出力の設計とそのイメージングが容易になります 62。曲率は集束に大きく影響するため、マイクロチャネルパターンは主にこの特徴に基づいています。マイクロチャネルは 4 つのループと 1 つの U ターンで構成され、BCC を WBC から分離するのに適切な曲率を持ち、より小さな細胞の集束を向上させます 29。このマイクロ流体チップは、PDMS とガラス基板を用いたソフトリソグラフィー法を使用して作成されています63。設計したマイクロチャネルの概略図を図 3 に示します。

詳細を含むマイクロチャネルの幾何学的パターンと、実験用に設計されたセットアップの概略図。

リンパ系は広範囲にわたる血管網であり、転移性乳がん細胞 (BCC) を拡散させる主な経路と考えられます。 BCC がリンパ節内の離れた部位に移動するダイナミクスは、最近よく理解されています。粒子追跡技術を使用して、BCC およびリンパ内の細胞の流れをシミュレートするために使用されたさまざまな直径の標準固体粒子の挙動を分析しました。 BCC と粒子の挙動間の明確な違いは、形態とサイズがリンパ流状態に対する反応に影響を与えることを示しています 64。

BCC は互いに付着して凝集粒子を形成し、その挙動は不規則でした。リンパ流速では、中央領域を移動する MDA-MB-231 細胞と比較して、MCF-7 はチャネル全体に均一に分布しており、転移性 MDA-MB-231 細胞が受けるせん断応力の範囲が低いことが示されています。生体内。これは、リンパ管における BCC の挙動をモデル化する際には、サイズと変形性を考慮する必要があることを示唆しています。この研究では、ヒト乳房細胞株 MDA-MB-231 (11 ～ 22 μm)、MCF-7 (11 ～ 19 μm)、および WBC (6 ～ 16 μm) を使用しました 64,65。白血球の約 3 分の 2 は 12 ～ 14 μm の範囲にあり、白血球の約 3 分の 1 は 6 ～ 9 μm の範囲にあるため、平均直径は約 12 μm であると推定されます。表 1 に、本研究で使用した細胞の特性を示します。これらの細胞は、タルビアトモダレス大学のバイオテクノロジーセンターから入手しました。

実験システムの性能を評価するために、2 ～ 20 μm の多分散微粒子 (中空ガラス製の平均直径 10 μm) がテスト用に選択されました。これらの粒子サイズは、インビボのリンパ管で見られる細胞サイズと一致するように選択されました。したがって、BCC の挙動を模倣するために単分散粒子 (直径 5、15.6 μm) が使用されます。粒子を蒸留水中０．０８％の割合で混合した。％のＴｗｅｅｎ－２０界面活性剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ダブリン、アイルランド）を溶液に添加して、粒子の凝集を防止した。蒸留水とリンパ液の動粘度はそれぞれ 1 mPa s、0.9 ～ 1.5 mPa s の範囲、蒸留水と粒子の密度は 1000 kg/m3、1050 ～ 1090 の範囲です。それぞれkg/m3。それらと蒸留水とのわずかな違いにより、ある割合のグリセロールが粒子溶液６６に添加された。

流体または他の粒子に対する粒子の影響（一方向結合）を防ぐには、粒子のサイズと距離が適切であると仮定して、調製した懸濁液中の粒子の相互作用を最小限に抑えて、適切な濃度の均一な懸濁液を提供する必要があります。同様に、流体中の粒子の幾何学的位置は、辺が L に等しい三角柱内にあります。粒子間の相互作用を避けるために、粒子の濃度は L/D = 15 とみなされました。ここで、D は粒子の直径、 L は分子平均自由行程です67。

BCC を 3% FBS を含む PBS に 1,000,000 細胞/ml の濃度で懸濁し、細胞株を 20 分間インキュベートしました。細胞の最終数は、０．０５％トリプシンおよび１ｍＭＥＤＴＡを使用して３％ＦＢＳを含むＰＢＳに再懸濁することによって、１ｍｌあたり１５０，０００細胞に調整した。 BCC 濃度は、データの視覚化と分析の目的で選択され、主に文献で報告されている実際の数値 (血液 1 ミリリットルあたり 1 ～ 100 CTC のスケール) よりも高く選択されました 42,60,64。

サンプル懸濁液は、10 mL プラスチックシリンジを使用してシリンジポンプによってマイクロチャネルに注入されました。実験は最小流量 500 μL/min で開始し、最後の流量 2500 μL/min まで継続しました。テストの再現性をチェックするために、各実験を 3 回繰り返しました。 TYGONチューブ（内径：250μm、長さ：15cm）およびフィッティングを使用して、シリンジチップをチップに接続した。サンプルを注入する前に、マイクロチャネルを 70% エタノールと蒸留水で洗浄し、エアレーションと滅菌を行いました。その後、チャネル表面への細胞接着を防ぐために、PBS をマイクロチャネルにポンプで注入しました 60、68。

実験は最初に標準粒子を使用して実行され、流量の最適化はさまざまな流量で実行されました。細胞集束のためのこのマイクロ流体チップの性能は、各実験で細胞/粒子を計数することによって表現できます。細胞サンプルにおいて、CTC 分離の効率は、両方の出口から出てきた癌細胞の総数に対する、目的の出口から出てきた CTC の数の比率であり、このパーセンテージはマイクロ流体の全体的な効率に等しくなります。デバイス。同様に、精製により、がん細胞の目的の出口から出てきた全細胞の何パーセントが標的細胞であるかがわかります。

イメージングはオンラインとオフラインの両方で行われ、オンラインイメージングは粒子の追跡に使用され、オフラインイメージングは粒子のカウントに使用されました。オフラインイメージングは出口で行われ、各出口から出てくる粒子が別の容器に収集され、懸濁液が均質化され、その1ミリリットルがサンプルとして採取されました。スライドを使用して、サンプルから 5 つの画像をランダムに取得し、ImageJ ソフトウェアを使用して粒子の数を数え、粒子の平均直径も計算しました。データをより適切に解釈するために、破片が結果に影響を与えず、標的細胞を失わないよう、各画像に適切な閾値が選択されました。図 3 は、実験セットアップの概略図を示しています 42,60。

シミュレーション結果に基づくと、バッファーの流量は 1150 μL/分、サンプルの流量は 550 μL/分に等しく、これは類似のものと比較して顕著です。標準的な多分散 (2 ～ 20 μm) および単分散 (5、15.6 μm) 粒子を使用したテストは、シミュレーション結果と非常によく一致しています。最後に、実際のセル (BCC および WBC) を分離することで、チップの優れた性能と、理論、シミュレーション、および標準的な粒子テストに完全に準拠していることが確認されました。

可能な限り実際に近いシミュレーションを行うために、WBC および BCC の動作を模倣するために 12 および 18 μm の粒子が使用されました。まず、直線状のマイクロチャネル内で粒子の分離をシミュレートしました。次に、チャネルに徐々に曲率を加えていき、最初に粒子が内壁に向かって移動することが観察されました。次に、大きな抗力により、より小さな粒子が外壁に移動します。最後に、これらの湾曲した部分の配列が形成され、粒子が入力から出力まで追跡されました。結果は、これらのマイクロチャネルの効率、精製、および流量が低いことを示しています。シミュレーション結果を表 2 と図 4 に示します。それぞれが個別に解釈および分析されます。

COMSOL ソフトウェアでシミュレーションされた結果。最初は直線のマイクロチャネル内で粒子が追跡され、次にマイクロチャネルに曲率が徐々に追加され、二次ディーン流により小さな粒子が外壁に向かって移動し始めることが示されました。最後に、これらの湾曲したピースのアレイが形成されました。赤い粒子の直径は 18 μm、青い粒子の直径は 12 μm です。これらの粒子は、それぞれ WBC と CTC の動作を模倣します (COMSOL Multiphysics® バージョン 6.0 が入手可能です: https://www.comsol.com/release/6.0)。

その後、分離を完了するには粒子の軌道を増加させる必要がありました。この目的のために、チャネルはらせん状に続き、曲率半径は大きく変化しません。曲率がほぼ一定であることは、利点にも欠点にもなり得ます。前述したように、この抗力が一定の限界を超えると粒子が混合してしまいますが、一方で従来のスパイラルでは効率はあまり高くありません。蛇行マイクロチャネルでは、この問題は突然の任意の曲率によって解決されます。これら 2 つのマイクロチャネルの機能を同時に使用することができ、従来にないスパイラルマイクロチャネルを、所望の曲率を備えたほぼ一定の長い曲率経路で設計できます。したがって、U 字型、L 字型、および S 字型のターンを粒子の移動パスに埋め込むことができます。

スパイラルマイクロチャネル内の細胞の挙動をより深く理解するために、いくつかの従来型および非従来型のスパイラルマイクロチャネルにおける粒子の集束を、異なる流速 (500 ～ 2500 μL/分) でシミュレートしました。 20μm、18μm、15μm、12μm、5μmのサイズの粒子の動きを調べ、これらのマイクロ流路における分離能を調べた。これらのシミュレーションを通じて、MCF-7 (11 ～ 18 μm)、MDA-MB-231 (11 ～ 22 μm)、および WBC (6 ～ 16 μm) の分離挙動を調査しました。

たとえば、テストの実行に必要な時間、テストの実行と繰り返しの簡単さ、標準ツールを使用してチップを作成できるかどうかなど、考慮すべき重要な要素は他にもあります。一方、経路が長すぎてターン数が多すぎると、流路の詰まり、粒子の堆積、気泡の発生の可能性が高くなります。この設計では、チップは大幅な効率、優れた流量、容易な製造、およびテストの簡素化を同時に実現しました。表 3 と図 5 にシミュレーション結果をまとめます。出口で 2 つの別々の部分に存在するセルの平衡位置は、2 つの横方向の頂点の存在を示しており、理論が裏付けられます。

COMSOL ソフトウェアのシミュレーション結果では、最初に粒子が従来のマイクロチャネル内で 0.9 mL/min で追跡され、その後粒子の進行方向に U ターンが追加され、より高い曲率比により、より小さな粒子が完全に外側に向かって移動することが示されました。 1.7 mL/minで壁に塗布します。出口で 2 つの別々の部分に存在するセルの平衡位置は、2 つの横頂点の存在を示します。赤い粒子の直径は 18 μm、青い粒子は 12 μm です。これらの粒子は、それぞれ WBC と CTC の動作を模倣します (COMSOL Multiphysics® バージョン 6.0 が入手可能です: https://www.comsol.com/release/6.0)。

曲がりのある曲線マイクロチャネルでは、曲率比の突然の変化により、ディーン流の方向と大きさが一定ではなく変化する可能性があります。結果を解釈する前に、細胞に作用する力をより適切に分析するには 3 つの重要な要素を考慮する必要があることに言及すると役に立ちます。ディーン抗力の方向と大きさは、マイクロチャネル内の細胞の垂直位置に依存します。流速の最大シフト。せん断勾配揚力の大きさに影響します。直線状のマイクロチャネルの速度プロファイルは放物線状であるため、最大速度はマイクロチャネルの中央に位置します。マイクロチャネルパターンに曲率を追加すると、FD が作成されるだけでなく、Re、曲率比、断面積に応じて最大速度の位置も変化します。細胞に作用する力の方向と存在は、マイクロチャネル内の細胞の位置によって異なります。

ソフトリソグラフィー法で作製したチップのイメージを図6に示します。U字ターンによる最大速度変位をシミュレーションしています。より小さい細胞が領域 1 にある場合、最大速度はマイクロチャネルの外側半分にあり、これらの細胞は FD の影響によって外壁に向かって押されます。 FLとFDのバランスにより、マイクロ流路の中心線付近に外壁に向かって傾いた濃縮細胞株が形成されます。ただし、大きな粒子では揚力が優勢であるため、この力で大きな粒子を押すことはできません。細胞が領域 2 に到達すると、最大速度は断面の中心線付近にあるため、それまで外壁に近かった小さな粒子が FL と FD の両方によって内壁に向かって移動し始めます。細胞が領域 3 に到達すると、最大速度は直線のマイクロチャネルのように中心線にあり、強化された FD と FL により小さな粒子が外壁に向かって押し出されます (内壁が外壁になり、その逆も同様です)。

高回転比による最大速度変位。 (A) ソフトリソグラフィーで作られたマイクロ流路の回転を顕微鏡で示したもの。 (B) マイクロチャネルに沿った速度場と最大速度変位を示します。 (C) このプロットは、マイクロチャネル内部の流れ場の流線を示しています。これらの流線の圧縮が U ターン後に増加することは明らかです。(D( は、最大速度が外壁から内壁にシフトしたことを示しました)。

粒子が領域 4 に到着すると、FD と FL が強化されるため、小さな粒子が外壁の近くに移動する可能性があります。この領域では、FS の垂直方向と水平方向の大きさが増加し、以前の位置からすでに外壁にあった大きな粒子がチャネルの上部と底部に移動します。揚力は直径の 4 乗に直接関係しているためです。 , 図2に示すように、大きな粒子はマイクロ流路の上部と底部に近づき、その後、強化されたFDとFLの両方により、より大きな粒子が内壁に移動し始めます。細胞が領域 5 に到着しても、より大きな粒子は依然として内壁に移動し、内壁付近で平衡線を形成します。一方、小さい粒子は他の壁の近くの平衡線にあるため、小さい粒子と大きい粒子の間の距離は大幅に増加します。

低い Re では、比較的小さい慣性揚力とディーン抗力が低い流速と組み合わさることにより、小さな細胞がまず中心線付近の広い帯域に集中します。 Re または曲率が増加すると、焦点合わせがわずかに改善されます。一見すると、FS と FD はそれぞれ ap3 と ap によって変化するため、完全な評価がなければこの細胞の挙動は予想外です。流量が増加すると、FS と FD の両方が増加します。ただし、より大きな粒子では FS が FD よりも増加し、移動が起こります。より小さい粒子では、そのサイズのため、この移動挙動は明確に見られません。小さな粒子に作用する FS の水平成分と垂直成分は、同じ流量では大きな粒子よりも小さくなります。図 6 は、前述の 5 つの領域のそれぞれにおける最大速度の変位を示しています。

理論によれば、シミュレーションでは、1000 個の白血球と 10 個のがん細胞を使用して、分離プロセスとこれらの細胞を現実にできる限り近づけて分離する実現可能性をシミュレートしました。実験では、このシミュレーションを検証するために、まず直径 2 ～ 20 μm の標準粒子を使用しました。細胞からこの範囲を分離することは主な目的ではなく、この研究では白血球とがん細胞が互いに分離されますが、この粒子径の範囲には血液中のすべての細胞が含まれます。この範囲の分離もシミュレーションで調査されましたが、粒子の直径が互いに近い場合、それらを分離するのはより困難になるため、12 μm と 18 μm の粒子を分離するのが適切である可能性があることに注意してください。さまざまな血液成分の平均直径を考慮して選択します。最後に、実際の細胞サンプルが分離され、流速 1.7 mL/min で細胞が 90% 以上の効率と純度で分離されました。これはシミュレーション結果と非常によく一致しています。

単分散 (5 および 15.6 μm) 微粒子と多分散 (2 ～ 20 μm) 微粒子の混合物を使用して、分離の検証と実現可能性をテストしました。粒子は、Q = 1 mL/min になるまでマイクロチャネル内に分散したままになります。 Q = 1.25 mL/min では、粒子はおおよそマイクロチャネル上に集束し始めます。集束線は 1.5 mL/min でより狭くなり、ほぼすべての粒子が目的の出口に向けられます。次に、流量を Q = 1.7 mL/min に増やすと、粒子は急激に集束し、ほぼすべての粒子が約 94% の集束効率で目的の出口から出ます。流量が高くなると、粒子が再び混合し始め、効率が大幅に低下します。表 4 に標準粒子を用いた実験結果の詳細を示します。

Q = 1.4 ～ 1.7 mL/min の流量では、分離効率は 80% 以上でした。流量が Q = 1.4 mL/min から 1.7 mL/min に増加すると、分離効率は 81 % から 94% に増加しました。流量が過剰に増加すると効率が大幅に低下するため、Q = 2 mL/min での所望の出力ではターゲット粒子の 65% のみが観察されました。図 7 は、流量 1.4、1.55、および 1.7 mL/min での実験テストの結果を示しています。図 8 に示すように、分離を最適化するために粒子の挙動は流量に応じて大幅に変化し、シミュレーションには 12 および 18 μm の粒子が使用され、実験テストには多分散粒子が使用されました。

さまざまな流量での粒子分離結果の棒グラフ。

さまざまな流速での粒子分離のシミュレーションと実験結果。最適な流速を見つけるために、流速を 1 mL/min から 2 mL/min に増加させ、各段階で出口を画像化して分析します。 (A) 粒子分離の実験結果。(A) と (B) は、それぞれ 1.4 mL/min でのより小さな粒子とより大きな粒子の望ましい出口を示しています。 (C～F) それぞれ 1.55 mL/min と 1.7 mL/min で同じ結果を示しました。 1.7 mL/min の結果は他の流量よりも優れていました。 (B) 標準粒子のサイズ分布を示します。 (C) シミュレーションと実験法の両方で得られた最適流量は約 1.7 mL/min でした。この流量では、小さい粒子と大きい粒子の 90% 以上が分離されます。

より深く理解するには、粒子の挙動はサイズに大きく依存するため、結果の分析における優先順位は、セルと粒子間のサイズの近さに依存します。 WBC のサイズは 6 ～ 16 μm で、平均直径は 12 μm です。 WBC の集束傾向は 10 μm 粒子により似ています。さらに、MCF-7 のサイズ分布は 11 ～ 21 μm で、MCF-7 細胞の平均直径は 15 μm で、20 μm と比較して 15.6 μm に近く、MCF-7 の集束挙動は7 セルは 15.6 μm の粒子と同様です。 MDA-MB-231 細胞の平均直径は 15 ～ 20 μm の間で 18 μm です。このセルの分離傾向は、15.6 μm と 20 μm の粒子の傾向を組み合わせたものです。

最高の効率は Q = 1.7 mL/min で発生します。これは、標準粒子が細胞の挙動を模倣できることを証明しています。実験とシミュレーションで得られた黄金流量に基づいて実際の細胞（WBCとBCCの混合物）を用いて同様の試験を行い、細胞数に基づいて分離性能を定量化しました。赤血球の干渉を防ぐために、血液サンプルは前処理で処理され、マイクロチップへの注入前に溶解されました。これらのサンプル中の BCC の数は、健康な血流で見つかった 2 CTC 様細胞/mL よりもはるかに多いと考えられました。この実験は、設計されたチップが癌細胞の分離に有用であり、患者の血液サンプルから癌細胞の 90% 以上を高スループットで分離できることを示しました。図 9、10、および表 5 は、BCC と WBC の分離性能の結果を示しています。各実験は 0.2 の標準偏差で 3 回繰り返され、実験の再現性が良好であることが示されました。

黄金流速での細胞分離の実験結果。 (A) と (B) は、前処理を行っていない白血球とがん細胞の行サンプルをそれぞれ示しています。(C) は白血球 (小さな細胞) の目的の出口を示し、(D) はがん細胞の目的の出口を示しています(より大きな細胞）を 1.7 mL/min で流します。この流量では、CTC と WBC の両方の 90% 以上が分離および精製されます。

さまざまな流量での実際のセルと剛体粒子の比較。

硬い粒子とは対照的に、細胞の変形能により、弾性慣性揚力が細胞に作用し、粒子の横方向の移動を引き起こす可能性があります。したがって、細胞に加わる力の合計は、ポアズイユ流の同じ体積の剛球に作用する力よりも大きくなります。 CTC の生存能力を大幅に損なうことなく、集束力も大幅に向上したことは注目に値します。図 10 は、固体粒子と変形可能セルの結果を比較しています。実際のセルの結果では約 2 ～ 3% のわずかな低下が示されています。この効率低下の理由は、弾性慣性揚力と変形可能セルの変形に関連しています。これは、セルの変形もシミュレーションで考慮する必要があることを示しています。

図11に示すように、硬質粒子の高濃度懸濁液の処理ビデオから得られた粒子軌道はシミュレーション結果とよく一致しました。シミュレーションでは、集束帯域は実験結果よりも狭かったです。固体粒子が完全に球形ではないという事実が、この結果のわずかな違いの理由です。ただし、これらの結果は、Q = 1.7 mL/min が分離効率を最大化する黄金の流量であることも示しており、これはシミュレーション結果とかなり一致しています。

(A) と (B) は、それぞれ、より大きな粒子とより小さな粒子に関連付けられた出力を示しています。 (C) 黄金流量での高濃度細胞サンプルのオンライン軌跡。

マイクロフロー、微粒子運動、およびゲノム特性評価ツールの物理学の最近の進歩により、NGS 法を使用することで、腫瘍の進行と治療をより深く理解するための腫瘍の不均一性の研究がこれまでよりも容易になりました。専門家らは、血液から分離されたCTCの遺伝学を研究することが、この病気の診断と治療において非常に重要になる可能性があると考えている。この方法は、マイクロ流体チップによって分離された CTC のゲノム情報をバイオマーカーとして使用し、固形がん細胞の治療をモニタリングする将来の臨床研究に使用できます。

真のラベルフリーの方法で血液成分を互いに分離するために、慣性マイクロ流体工学を使用した戦略を開発しました。この戦略は、慣性力とディーン抗力の微妙なバランスを使用するだけでなく、流体の方向を変えるために高曲率回転を組み合わせます。流線型。粒子の途中でUターンしたスパイラルマイクロ流路内で、平均直径12の白血球、平均直径18のMDA-MB-231、平均直径15のMCF-7の挙動を観察しました。この調査での動議。

シミュレーション結果は、WBC と CTC 間の最大距離により、Q = 1.7 mL/min で WBC と CTC の集束が可能であることを実証しました。この黄金流量では、CTC と WBC のそれぞれ約 93% と 92% が混合物から分離されました。検査されたチップの性能は、シミュレーション結果および理論原理と完全に一致することを示しました。

他の慣性集束方法とは異なり、スパイラルパターンで高曲率比ターン (U ターン) を使用して内側ループから外側ループに移動することにより、CTC と WBC の両方の集束動作が強化され、その結果、大幅に高いスループットで高純度が得られます。

このテストでは、サイズベースの粒子分離が約 1.7 mL/min のハイスループットで実行され、改善されました。これにより、他の同様のマイクロチップと比較して約 2 倍の流量が得られます。

セルと標準粒子の平衡位置を比較すると、将来のシミュレーションでは剛性と弾性の影響を考慮する必要があることがわかりました。

慣性マイクロ流体工学の最近の進歩により、幅広い用途が提供されています。この研究の結果によると、従来にないスパイラルマイクロチャネルを使用して、高スループットで患者の血流から CTC を分離することが可能です。ただし、このチップを臨床環境に導入するには、さらに研究を行う必要があります。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータはこの記事に含まれており、現在の研究中に使用されたその他の追加のデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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イラン、テヘランのタルビアト・モダレス大学機械工学科

ヴァヒド・オムラニ & モハマド・ザベティアン・タルギ

タルビアト・モダレス大学医科学部、テヘラン、イラン

ファテメ・ラーバリザデ

モナシュ大学機械航空宇宙工学部、メルボルン、ビクトリア州、3006、オーストラリア

ノスラティに祈りなさい

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V. オムラニ: 監督、調査、方法論、プロジェクト管理、データキュレーション、形式分析、執筆 - 原案。 M. Zabetian: リソース、概念化、資金調達、検証、原稿の編集。 F. Rahbarizadeh: プロジェクト管理、原稿編集。 R. ノスラティ: 概念化、検証、視覚化、原稿の編集。

モハマド・ザベティアン・タルギ氏への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Omrani、V.、Targhi、MZ、Rahbarizadeh、F. 他最大速度の方向、大きさ、位置を変更することにより、スパイラルマイクロチャネル内でがん細胞をハイスループットに分離します。 Sci Rep 13、3213 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-30275-x

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受信日: 2022 年 9 月 10 日

受理日: 2023 年 2 月 20 日

公開日: 2023 年 2 月 24 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30275-x

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