ハイドロゲル

Oct 11, 2023

Scientific Reports volume 12、記事番号: 17781 (2022) この記事を引用

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2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

細胞外マトリックス環境、細胞、生理学的に関連する灌流を組み合わせたマイクロ流体デバイスは、細胞培養プラットフォームとして有利です。 我々は、ポリエチレングリコール（PEG）ヒドロゲルでカプセル化されたU87神経膠芽腫細胞をポリジメチルシロキサン（PDMS）の膜で覆われたウェルにロードすることにより、ヒドロゲルベースのマイクロ流体細胞培養プラットフォームを開発しました。 多層マイクロ流体細胞培養システムは、細胞培養チャンバーの 2D アレイに負荷をかけて生体模倣的に灌流する構成で、以前に報告された設計機能を組み合わせています。 アレイの 1 つの次元はマイクロ流体濃度勾配発生器 (MCGG) によって供給され、直交する次元は別の層の細胞培養チャンバーの列を満たすローディング チャネルを提供します。 典型的なツリー状 MCGG ミキサーとは対照的に、入力マイクロチャネル幅を調整することにより、初期溶質濃度の 1、1/2、1/4、および 0 の段階的段階希釈が達成されます。 ハイドロゲルはすべてのウェルに効率的かつ再現性をもってロードされ、細胞はハイドロゲル全体に均一に分布し、最長 4 日間 > 90% の生存率を維持します。 薬物スクリーニングアッセイでは、灌流溶液からハイドロゲルにカプセル化された U87 細胞へのテモゾロミドとカルムスチンの拡散が測定され、用量反応曲線が生成され、神経膠芽腫微小環境の in vitro 模倣物としての有用性が実証されます。

腫瘍学介入用に開発された薬剤のほぼ 97% が、不適切な薬剤モデル、特に in vitro の 2 次元 (2D) 細胞培養モデルに依存しているため、臨床試験中に失敗します 1。 in vitro 2D 細胞培養モデルは使いやすいですが、細胞の挙動は通常使用される硬い平面プラスチックの平らな形態の影響を受けるため、複雑な腫瘍微小環境を適切に表すことができません 2,3。 2D 細胞培養モデルに関する懸念に対処するために、より生理学的に適切な腫瘍微小環境の模倣として、3 次元 (3D) がん細胞培養モデルへの移行が見られています4。 全体として、3D 腫瘍モデルは、いくつか例を挙げると、スフェロイド、オルガノイド、マトリックスベースの培養および共培養など、さまざまな形式を取ることができます5、6。 複雑さを加えて生理学的関連性を高めるために、3D 腫瘍モデルをマイクロ流体デバイスと組み合わせて、灌流を可能にしたり、血管新生を模倣したりすることができます7。 細胞、細胞外マトリックス、灌流を組み合わせたマイクロ流体システムは、生体内腫瘍微小環境をよく模倣しており、低コストで再現性があり、少量の培養容量での使用が可能で、目的の用途に合わせて最適化できる制御可能な設計となっています8、 9. 灌流ベースの細胞培養システムは、生体内物質輸送を模倣し、可溶性因子を生物学的濃度に近づけることを目的とした方法で細胞に栄養素を提供し、代謝老廃物を除去します10。 さらに、マイクロ流体システム内で時間的および空間的勾配を生成できるため、薬物スクリーニング プラットフォームとしての価値がさらに拡大します8。 しかし、付着哺乳類細胞の 3D 培養のための堅牢なマイクロ流体灌流システムを設計して操作することは困難です 3。 課題は、適切な培養構成、材料、マイクロ流体ネットワーク製造の選択などのデバイス設計に関連する場合もあれば、滅菌、デバイスへの細胞播種、細胞生存率を最大化するための質量輸送および流動せん断応力の最適化などの純粋に技術的な場合もあります。灌流チャネル内の気泡を回避します。

グラジエントミキサーは、マイクロ流体システム用に開発されており、オンチップ混合を提供して、細胞の維持、幹細胞の分化、またはさまざまな生物学的質問への回答に使用できる細胞培養システムに可溶性因子の離散濃度を供給するために使用できます11。 これらのマイクロ流体ミキサーの多くは、本明細書で使用される設計と同様に、各段階の終了前に完全な混合を必要とする複数の段階を備えたツリー状構造を利用している8、12、13。 オンチップグラジエント形成により、ピペッティングエラーの可能性が排除され、汚染の可能性が減少し、外部で生成されたグラジエントを備えたマイクロ流体デバイスと比較して、マイクロ流体注入口の数が少なくなるためセットアップが簡素化されます14、15。

灌流 3D 細胞培養システムの生理学的関連性の強化を認識して、肝臓および癌組織モデルに重点を置いた薬物スクリーニング用途のためのマイクロ流体細胞培養デバイスに焦点を当てた研究が増えています 16,17。 たとえば、腫瘍スフェロイドモデルは、マイクロ流体チップ内の濃度勾配発生器に接続された細胞培養マイクロウェル内で成長させられ、薬物スクリーニング用途に使用されました18、19。 これらの 3D システムには細胞外マトリックス模倣物が組み込まれておらず、細胞培養チャンバーを満たすために細胞捕捉に依存していました。 巧妙な設計を利用して、3D マイクロ流体セル アレイにがん細胞と内皮細胞の両方を組み込み、腫瘍環境をエミュレートしました 7。 最下層には、ヒドロゲルが埋め込まれた癌細胞を含むマイクロチャンバーがあり、クラスター化した細孔を備えた透過膜を介して内皮細胞の上部マイクロチャネル層から分離されており、このデバイスには濃度勾配発生器は含まれていませんでした。 次に著者らは、システム内の薬物応答を静的 3D 培養における薬物応答と比較し、薬物浸透の障壁として機能する上部マイクロチャネルで形成された内皮が原因である可能性のある応答の遅延に注目しました。 内皮細胞層とがん細胞層を組み込んだ 2D および 3D 細胞培養用の別の毛細管力ベースのマイクロ流体デバイスが、薬物スクリーニング用途向けに開発されました。このデバイスでは、特殊な装置を必要とせずに勾配を生成できます 20。 トーら。 は、薬物の肝毒性を試験するための 3D マイクロ流体セル アレイ チップを開発しました。このチップでは、肝細胞を培養し、勾配薬物用量に曝露しました 21。 3D 微小環境はコラーゲンとターポリマーのコアセルベーションによって生成され、マイクロピラー アレイによって維持されます。 全体として、マイクロ流体細胞培養デバイスは、細胞外マトリックス模倣、細胞と細胞の共培養、生理学的に適切な灌流、多重細胞培養チャンバー、濃度勾配または希釈ジェネレーターなどの複数の有用な機能を組み合わせることができ、これらにより医薬品などの用途にとって魅力的になります。上映22．

ここでは、ヒドロゲルベースの 3D 細胞培養用に設計されたマイクロ流体デバイスについて説明し、2 つの異なるヒドロゲル マトリックスを使用したその有用性と、2 つの化学療法剤を使用した用量反応曲線の構築を紹介します。 細胞培養チャンバーの 2D アレイは、1、1/2、1/4、および 0 の希釈率を提供する連続分数希釈を作成するツリー状 MCGG によって灌流されます。細胞とゲル前駆体溶液は、デバイスとハイドロゲルに簡単にロードされます。光開始またはマイケル型添加後に、細胞生存率に影響を与える可能性のある灌流チャネルの閉塞や圧力上昇を伴わずに形成されます。 このマイクロ流体システムを使用して、3D ポリエチレングリコール (PEG) ベースのヒドロゲル内で神経膠芽腫細胞を培養し、灌流による薬物送達とテモゾロミド (TMZ) およびカルムスチン (BCNU) による治療後の細胞生存率を測定しました。

Ｓｙｌｇａｒｄ（商標）１８４シリコーンエラストマーキット（ポリジメチルシロキサンまたはＰＤＭＳと呼ばれる）は、Ｄｏｗ Ｓｉｌｉｃｏｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ミシガン州ミッドランド）から入手した。 ポリエステル (PETE) 膜フィルター (透明、孔径 0.2 μm、厚さ 12 μm、2e6 孔/cm2) は、Sterlitech Corporation (ワシントン州ケント) から入手しました。 事前に洗浄した 75 mm × 50 mm × 1 mm の平板ガラス スライドは、Corning Incorporated (Corning, NY) から入手しました。 イントラメディック ポリエチレン (PE) チューブ (ID 1.40 mm、OD 1.90 mm、および ID 1.14 mm、OD 1.57 mm) は Clay Adams 製でした。 シリコン (SI) ウェーハは、University Wafer Inc (ボストン、マサチューセッツ州) から入手しました。 SU-8 2025 フォトレジストと SU-8 現像液 (98 ～ 100% 酢酸 1-メトキシ-2-プロピル) は、Kaaku Advanced Materials Inc (マサチューセッツ州ウェストボロー) から入手しました。 MIL PRF 131k クラス 1 フォイル、厚さ 150 μm (MarvelSeal® 470) は Berry Global (Evansville、IN) から入手しました。 A1 フレーム、薄いポリマー フィルム (A4 インクジェット防水フィルム) は CisInks (カリフォルニア州サウス エル モンテ) から入手しました。 ポリエチレングリコールジアクリレート (PEGDA; 5 kDA)、4 アーム ポリ(エチレングリコール)-アクリレート (4 アーム PEG-Ac; 10 kDa)、およびポリ(エチレングリコール)-ジチオール (PEG-diSH; 3.4 kDa) は、 Laysan Bio Inc. (アラバマ州アラブ)。 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、10 X、pH 7.4)、トリパン ブルー (0.4%)、蛍光ポリスチレン ビーズ (Fluoro-Max™ 蛍光レッド、542/612 nm、d = 2 μm)、およびテモゾロミド (TMZ) は Thermo 製でした。 Fisher Scientific (マサチューセッツ州ウォルサム)。 Ｉｒｇａｃｕｒｅ ２９５９はＢＡＳＦ社（ニュージャージー州フローハムパーク）から入手した。 ウシ胎児血清 (FBS) およびペニシリン/ストレプトマイシン (P/S) は Hyclone (ユタ州ローガン) から入手しました。 ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）−１６４０培地および０．０５％トリプシン／０．０２％エチレンジニトリロ四酢酸（ＥＤＴＡ）は、Ｃｏｒｉｎｇ（Ｃｏｒｉｎｇ、ＮＹ）から入手した。 アクリジン オレンジ (AO) とカルムスチン (BCNU) は、Millipore Sigma (ミズーリ州セントルイス) から入手しました。 ヨウ化プロピジウム (PI) は MP Biomedical LLC (オハイオ州ソロン) から入手しました。 細胞染色剤 3,3'-ジオクタフェシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩 (DiOC) は、Life Technologies (カリフォルニア州カールズバッド) から入手しました。 ブリリアント ブルー FCF (CAS 番号: 3844-45-9) は、青色の食品着色料として地元の食料品店から購入しました。 ホモサピエンスの脳神経膠芽腫 U87 細胞は ATCC (バージニア州マナッサス) から入手しました。 グリシン-アルギニン-システイン-アスパラギン酸-アルギニン-グリシン-アスパラギン酸-セリン（GRCD-RGDS）、グリシン-アルギニン-システイン-アスパラギン酸-アルギニン-グリシン-アスパラギン酸-セリン-FITC（GRCD-RGDS-FITC）、アスパラギン酸-アルギニン-システイン-グリシン-バリン-プロリン-メチオニン-セリン-メチオニン-アルギニン-グリシン-システイン-アルギニン-アスパラギン酸（DRCG-VPMSMR-GCRD）ペプチドはGenic Bio（上海、中国）から入手した。

マイクロ流体デバイスは、支持ガラス製顕微鏡スライド (75 mm × 50 mm × 1 mm)、パターン化された PDMS の 2 層 (上部灌流層と細胞ローディング チャネルを備えた下部細胞培養チャンバー層)、16 枚の PETE 膜 (キャッピング) を組み立てることによって製造されました。 16 個の細胞培養マイクロウェル）、および 3 つのチューブ - 2 つの入口チューブ（PE チューブ; ID 1.14 mm、OD 1.57 mm）と 1 つの出口チューブ（PE チューブ; ID 1.40 mm、OD 1.90 mm）（図 1、補足図）。 S1)。 上部の灌流層の厚さは 3 mm、下部の細胞培養マイクロウェル層の厚さは 250 μm でした。 灌流チャネルと細胞ローディングチャネルの高さは 50 μm でした。 ウェルの深さ 250 µm は、サンプル全体のイメージングを可能にしながら、個々の細胞よりも大きくなるように選択されました。 ほとんどの灌流チャネルの幅は 150 μm でしたが、主要な例外である 50 μm と 75 μm は段階希釈シリーズを実現するために設計に組み込まれていました。 これらの部分希釈チャネルを使用して、初期溶質濃度の 100%、50%、25%、0% の濃度勾配を生成しました。 最下層の細胞ローディングチャネルも幅 150 μm でした。

マイクロ流体デバイスの設計。 (A) 入口 (画像の左側) と出口 (画像の右側) チューブを備えたマイクロ流体デバイスの写真。 黒いスケールバーは1cmを表します。 (B) マイクロチャネルのチャネル幅と、これらのチャネル幅で生成される濃度希釈。 (C) インレット チューブ (左)、混合チャンバー (赤)、細胞培養チャンバー (緑)、およびアウトレット チューブ (右) を表示する、作製されたマイクロ流体デバイスの側面図。

上部と下部の両方の PDMS 層は、パターン化された Si マスター上で PDMS 前駆体を硬化することによって製造されました (標準的なフォトリソグラフィー SU-8 2025 手順で製造: https://kaakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/SU-82000DataSheet2025thru2075Ver4-3) .pdf) 75 °C で一晩加熱します。 簡単に説明すると、厚さ 50 μm の SU-8 2025 フォトレジストを Si ウェハ上に 1700 rpm (SP-100 スピナー、BidTec) でスピンコートし、ホットプレート上で 65 °C で 3 分間、その後 95 °C で 1 分間ソフトベークしました。 9分プレプリントされたマスク上のパターンは、UV 照射 (Flood Exposure Model 60、ABM-USA, Inc.、米国カリフォルニア州サンノサにある 160 mJ/cm2) によってフォトレジスト層に転写され、露光後ベークされました (ホットプレートで65℃で6分間、その後95℃で7分間）、補足図S2に示す標準プロセスによって現像されました。 ＵＶ放射は露光されたＳＵ－８を架橋し、ＳＵ－８現像液は架橋されていないＳＵ－８を溶解し、架橋されたＳＵ－８パターンだけを残した。

底部の細胞培養PDMS層も同様に調製し、厚さを制御するために変更を加えました（補足図S3）。 底部 PDMS 層の厚さを 250 μm にするために、150 μm の Al フォイル フレーム スペーサーを使用しました。 PDMS 前駆体を Si マスターと Al フレーム上に注いだ後、薄いポリマー フィルムと硬いガラス スライドがその上に置かれました。 柔軟なポリマーフィルムは、PDMS 前駆体とスライドガラスの接触を避けるために追加されました。そうしないと、PDMS の硬化後に硬質ガラススライドを取り外すことができなくなりました。 PDMS 層の厚さを均一にするために 5 ポンドの重りを上部に追加し、PDMS を 80 °C で一晩硬化させました。 厚さは、Alpha-Step IQ表面形状計(KLA-TENCOR Alpha D500、KLA Corp.、ミルピタス、カリフォルニア、米国)によって測定した。 PDMS前駆体の粘度が高いため、重合前に余分なPDMSがすべてエッジから押し出されたわけではないため、PDMS層はスペーサーよりも厚かったことに注意してください。

PDMS 層が硬化した後、16 個の細胞チャンバー (2 mm ID)、2 つの入口 (1.5 mm ID)、および 1 つの出口 (2 mm ID) を生検パンチで切り取りました。 直径 3 mm の生検パンチで切断した 16 枚の円形 PETE 膜 (孔径 0.2 μm) を、内径 2 mm の細胞培養マイクロウェルのそれぞれに個別に配置して、2 つの PDMS 層を分離し、培養チャンバー内の細胞と材料が内部に漏れるのを防ぎました。灌流チャネル。 2 つの PDMS 層 (デバイスの上層と下層) 間の接着を改善し、漏れを防ぎ、経時的な安定性を確保するために、1 つのピースではなく個別の膜ピースが選択されました。 個々のピースは、一体の膜層で発生する可能性のあるウェル間のクロストークも防ぎます。 直径 3 mm のメンブレンは ID 2 mm のウェルよりわずかに大きいため、メンブレンの端が PDMS の滑らかな表面に接触し、自然に接着し、その後の酸素プラズマと位置合わせ中に安定した状態を保ちます。 次に、実験室用コロナ処理装置 (BD-20AC モデル、Electro-Technic Products、米国イリノイ州シカゴ) を使用して、2 つの PDMS 表面をプラズマで 1 分間処理して酸化しました。 2 つの PDMS 層は、角の 4 つの位置合わせマークと目視で位置合わせされました。 2 つの PDMS 層を間に PETE 膜を挟んで一緒に押し付けた後、ガラス スライドの表面と PDMS アセンブリをプラズマで 1 分間さらに酸化して、付着を改善しました。 入口および出口チューブを入口および出口の位置に挿入し、未硬化の PDMS で密封しました。 シールを改善し、PDMS を硬化させるために、デバイスを 75 °C で少なくとも 2 時間加熱しました。 詳細なデバイスアセンブリの概略図を補足図S4に示します。

灌流では、ミキサーの両側への入力が同じ流量になるように、灌流液をデュアルシリンジポンプ (New Era Pump Systems Inc、ファーミングデール、ニューヨーク州) の 3 mL シリンジに入れました。 シリンジを、針（２１Ｇ）およびチューブ（ＰＥチューブＩＤ １．１４ｍｍ、ＯＤ １．５７ｍｍ）を用いて装置の入口ポートに接続した。 試験された体積流量は、1、1.5、2、5、および 10 μL/分でした。 混合効率を研究するために、ブリリアント ブルー FCF の溶液（視覚化を支援するため）を最終濃度 25 μM（ランバート ベールの法則によって測定）23 になるように PBS に溶解し、プレーン PBS と組み合わせて使用​​して、マイクロミキサー。 倍率 5 倍の倒立顕微鏡 (Zeiss、Axiovert 200 M、Oberkochen Germany) を使用して、灌流中のマイクロミキサーの 3 つの領域 (入口、中央、出口) で画像を取得しました (図 2B)。 次に、ImageJ ソフトウェア 24 を使用して RGB チャネルを分割し、「プロット プロファイル」機能を使用してマイクロミキサー内の青色 RGB チャネルの強度を (マイクロミキサー幅の関数として) 測定しました。 画像の各セットの値は 0 ～ 1 で正規化され、グレー値 1 は青色に割り当てられ、グレー値 0 はマイクロ流体チップの背景色に割り当てられました。 絶対混合指数 (AMI) は次のように計算されました。

ここで、Ii は局所的なピクセル強度、< I > は断面内の平均ピクセル強度、NI はピクセルの総数です25。

ローディングと灌流のセットアップ。 (A) インスリン針を使用して、ローディング ポートを介してデバイスの下部ローディング層の膜で覆われたマイクロウェルにヒドロゲル前駆体溶液をローディングする概略図。 (B) 灌流流体を含む 3 mL シリンジをマイクロ流体デバイスの入口ポートにチューブで接続する灌流セットアップの概略図。 赤い丸は、混合分析のためにマイクロミキサー内の画像が撮影された場所 (入口、中間、出口) を示します。 青い丸は、濃度勾配分析のためにマイクロミキサーの最後で画像が撮影された場所を示します。

さらに、設定された体積流量でマイクロ流体デバイスによって生成される濃度勾配を決定するために、各マイクロミキサーの最後でも画像がキャプチャされ、その後、ImageJ ソフトウェアを使用してマイクロミキサーによって生成された色素の平均強度を比較しました。

分子を硬い球としてモデル化し、ストークス・アインシュタイン方程式を使用して分子の拡散係数を計算しました。

ここで、D は拡散係数、\(k\) はボルツマン定数、\(\mu\) は 37 °C における水の動粘度、\(r\) は粒子の流体力学半径です。 粒子の分子体積が球形に相当すると仮定すると、各分子の流体力学的半径は次のように計算されます。

ここで、MW は粒子の分子量 (王立化学会によって提供)、NA はアボガドロ数、\(\rho\) は粒子の密度 (王立化学会によって提供) です。 分子がチャネルの幅全体に拡散するのに必要な時間は、次のように計算されました。

ここで、 \(t\) は拡散が起こるのに必要な時間、 \(x\) は拡散距離です。

ヒト神経膠芽腫 U87 細胞を 10% FBS および 1% P/S を補充した RPMI-1640 培地で培養し、37 °C、5% CO2 の加湿インキュベーター内でインキュベートしました。 約80%のコンフルエンシーに達したら、細胞をトリプシン/EDTAに5分間曝露して継代し、培地を2日ごとに交換した。 継代 10 ～ 20 の細胞を実験に使用しました。 さらなる実験を行う前に、細胞を DiOC (20 μM) とともに 24 時間培養してすべての細胞を染色しました。

非分解性、非粘着性の PEGDA ハイドロゲルは、UV 光重合によって調製されました。 簡単に説明すると、光開始剤のストック溶液を調製するために、1% w/v Irgacure 2959 を脱イオン水 (DI 水) に溶解し、90 分間超音波処理 (Branson、モデル #2800、40 kHz) し、室温で保管しました。光から最長 2 週間保護されます。 Irgacure 中の 20% w/v および 0.1% w/v の PEGDA ヒドロゲル前駆体溶液 (250 μL) を PBS で調製し、30 秒間ボルテックスして完全に混合したことを確認しました。 インスリン針を使用して、ヒドロゲル前駆体溶液をマイクロ流体デバイスの細胞培養マイクロウェルに装填ポートを通して装填した（図２Ａ）。 各マイクロウェルには約 0.2 μL のヒドロゲル前駆体溶液が含まれていました。 したがって、16 個のマイクロウェルすべてを満たすには 3.14 μL の溶液が必要でした。 溶液がローディングチャネル内に残らずにマイクロウェルに確実に到達するためには、過剰量の前駆体溶液が必要でした。 過剰な前駆体溶液がマイクロウェルを覆う膜を押すのではなく、デバイスから排出できるように、デバイスのローディング層の設計にリリーフチャネルが組み込まれています。 次に、ヒドロゲルを UV ランプ (4.81 mW cm2、1 W、365 nm、Blak-Ray® XX-15L UV ベンチ ランプ、UVP、カリフォルニア州アップランド) で 10 分間重合させました26。 これらのゲルは全体を通して PEGDA と呼ばれます。

分解性、接着性の 4 アーム PEG-Ac ヒドロゲルをマイケル型付加によって調製しました。 まず、以前に開発されたプロトコルに従って 4 アーム PEG-RGDS を調製しました 27。 各 4 アーム PEG-Ac のアクリレート基の平均 1 つを RGDS で修飾し（修飾効率 80%）、凍結乾燥した生成物をアルゴン下、乾燥容器内で -20 °C で最長 6 か月間保存しました。 次に、4 アーム PEG-Ac と 4 アーム PEG-RGDS (RGDS 中 0.8 mM) の混合物、および PEG-diSH と酵素分解性ペプチド架橋剤 DRCG-VPMS↑MR- の 50:50 架橋剤混合物を使用してヒドロゲルを形成しました。 GCRD。 すべてのゲルについて、4 アーム PEG-Ac、PEG-diSH、および 4 アーム PEG-RGDS の 20% w/v ストック溶液を、使用直前に TEA 緩衝液 pH 8 で調製しました。 原液を混合し、ペプチド架橋剤を粉末として加えて、アクリレート対チオールのモル比が１：１、最終ポリマー濃度が１０％ｗ／ｖ、最終ペプチド架橋剤濃度が７．８ｍＭのヒドロゲル前駆体溶液を得た。 ヒドロゲル前駆体溶液をピペッティングで 30 秒間混合し、上記のようにマイクロ流体デバイスに注入し、37 °C、5% CO2 の加湿インキュベーター内で 20 分間ゲル化させました。 これらのゲルは全体を通して 4 アーム PEG-Ac と呼ばれます。

ハイドロゲルの再現性とマイクロ流体デバイスの細胞培養マイクロウェルへの細胞ローディングを評価するために、DiOC 染色した U87 細胞を 106 細胞/mL で PEGDA ハイドロゲル前駆体溶液に添加しました。 次いで、前駆体溶液を、インスリン針を使用してマイクロウェルにロードし、上記のようにＵＶ下でゲル化させた。 倒立蛍光顕微鏡を使用して各ウェルの画像を撮影し、ImageJ を使用して各ウェル内の細胞の数を数えました。 ハイドロゲル内の蛍光標識細胞の分布を、共焦点顕微鏡 (Leica Confocal SP8、Leica Microsystems Inc、Buffalo Grove、IL) を使用して 10 倍の倍率で画像化し、Fiji ソフトウェア (無料ダウンロード http://fiji.sc) を使用して処理しました。 。 共焦点イメージングの場合、ヒドロゲルは、我々が以前に記載したように、蛍光 GRCD-RGDS-FITC ペプチドを共有結合的に組み込むことによって蛍光を与えられました 27。

20% w/v PEGDA、0.1% v/v Irgacure、および 106 細胞/mL (DiOC 染色 U87 細胞) を含むヒドロゲル前駆体溶液を、上記のようにマイクロ流体デバイスの細胞培養マイクロウェルに注入および重合させて、非分解性、非粘着性の PEGDA ハイドロゲル。 ゲル化直後、10% FBS および 1% P/S を補充した RPMI 培地をデバイスを通して 48 時間灌流しました。 48時間で、灌流培地を、両方の入口で0.2μg/mLのPI（死んだ細胞の核の染色）、一方の入口で2mM TMZまたは10μM BCNUを含む補足培地と交換し、デバイスを通して48時間灌流した。 同様に、106 細胞/mL の DiOC 染色 U87 細胞を含む分解性接着性 4 アーム PEG-Ac ハイドロゲルを上記のように調製し、48 時間培養し、TMZ に 48 時間曝露しました。 カプセル化された細胞は、Axiovert 200 M 倒立蛍光顕微鏡を使用して倍率 10 倍で画像化されました。 細胞生存率は次のように計算されました。

ここで、NL は生細胞の数を表し、ND は死細胞の数を表します。

蛍光相関分光法 (FCS; Zeiss LSM 510 蛍光顕微鏡、Zeiss、ドイツ) を使用して、20% w/v PEGDA ハイドロゲル スラブ中のモデル蛍光団 (Atto 655) の in situ 拡散率を測定しました。 ヒドロゲルは、Atto 655 (0.5 nM) をヒドロゲル前駆体溶液に添加するという修正を加えて、上記のように形成した。 FCS 測定では、ドイツ製の #1 ホウケイ酸塩底を備えた 8 チャンバーのカバーガラスでヒドロゲル (150 μL) を調製しました。 次に、ヒドロゲルから周囲の培地へのAtto 655の濃度による拡散を避けるために、フェノールレッドを含まず、0.5nMのAtto 655を含むDMEM培地にヒドロゲルを一晩浸漬した。 脱イオン水中の Atto 655 (0.5 nM) も、FCS 機器の共焦点体積を校正するために使用されました。 633 nm ps パルスレーザーを使用して、各サンプル位置について 300 秒の測定を 6 回行いました。 自己相関関数 G(τ) が各測定値に対して得られました。

ここで、N は蛍光粒子の数、p = ro/zo は機器定数、ro は半径、zo は集束レーザー ビーム スポットの軸長、τd は溶質の拡散時間、T は三重項状態の振幅、 τT は三重項の寿命です。 自己相関関数は、より高いレーザー強度での分子三重項状態の励起の可能性を考慮して、三重項モデルを使用して適合されました。 最後に、自己相関関数は次のように正規化されました。

ここで、G(τD) は式 (1) の値です。 各時点での式 (6) であり、G(τ0) は式 (6) の値です。 (6) 初期時点。 溶液中の各タンパク質の有効トレーサー拡散係数は、τD から次のように計算されました。

TMZ と Atto 655 の分子量が比較的類似しているため (それぞれ 194 g/mol と 887 g/mol)、拡散率が類似していると仮定して、ゲル内の予想される TMZ 濃度をゲルの深さと時間の関数としてモデル化しました。 TMZ 濃度は、次の境界条件を使用して 1 次元形状 (薄いスラブ) の拡散のフィックの第 2 法則によって計算されました: c(x = 0) = 2 mM TMZ および c(x = ∞) = 0 mM TMZ at t = 0 時間、c は TMZ 濃度、x はゲルの位置、t は時間です。

すべてのデータは、3 ～ 4 回の独立した実験から決定された平均値 (± SD) として表示されます。 濃度勾配分析と負荷再現性の統計分析は、Holm-Sidak による一元配置分散分析または GraphPad Prism 6® を使用したダンの多重比較テストを使用して実行されました。 強度プロファイルの傾き対体積流量の統計分析は、GraphPad Prism 6® を使用した線形回帰分析を使用して実行されました。 p < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。

ここでは、ヒドロゲルでカプセル化された細胞を膜で覆われた細胞培養マイクロウェルにロードし、さまざまな濃度の目的の生体分子または薬物を含む流体で灌流できるマイクロ流体デバイスを設計しました（図1、補足図S1）。 このデバイスには、3D ハイドロゲルベースの灌流細胞培養に適したいくつかの機能が組み合わされています。(i) 細胞ローディング チャネルを備えた密閉構造です。 (ii) 灌流層への汚染や細胞の漏出を防ぐために膜で蓋をされた細胞培養チャンバーの 2D アレイがあります。 (iii) 生体模倣 3D 細胞培養用に細胞をハイドロゲル内にロードします。 (iv) 反転したデザインにより、下からのイメージングが可能になります。 (v) MCGG は、長さではなくチャネル幅を使用して混合比を変更します。

マイクロ流体デバイスは、製造が簡単で、不活性、非細胞毒性、ガス透過性があり、蛍光イメージングに適しているため、マイクロ流体アプリケーションで一般的に使用されている PDMS で構築されました 3,28,29。 私たちの設計にとって重要なのは、PDMS が問題なく、マイクロウェルに細胞とゲルをロードするためにインスリン針の使用を可能にしたことです。 マイクロ流体システムは 2 つのマイクロ流体チャネル層で構成され、底部の細胞ローディング チャネルを密閉する膜で分離されています。 上部の灌流層 (図 1、2B) には、膜上に流れを提供して下の培養チャンバー内の細胞に栄養を供給する灌流チャネルにつながる蛇行マイクロミキサーが含まれています。 2 段マイクロミキサーは、第 1 段の上流で 150/75/150/150 μm、第 2 段の上流で 150/50/150/50/150 μm の供給チャネル幅を有し、1:1/2 の分別濃度希釈シリーズを生成します。 :1/4:0 (図 1B)。 灌流チャネルは、クロストークを避けるために細胞培養チャンバーに流体的に並行してアクセスします。 このデバイスは数日間にわたって安定した動作を提供し、消費量は 1.5 mL/日未満であり、細胞毒性を避けるために新鮮な培地で細胞を灌流します。 体積流量 1 μL/min では、細胞培養チャンバー上の灌流層までの供給チャネル内の線速度は約 1.1 mm/s であり、これは毛細管を通る in vivo 流量と同様です 30。 たとえば、Giulitti et al. は、灌流が遅すぎる場合 (例: 0.6 μL/h)、下流の細胞が栄養分 (上流の濃度が高い) と廃棄物 (下流の濃度が高い) の不均一な分布により細胞毒性を経験する可能性があることを実証しました 31。 流速が高くなると (例: 30 ～ 60 μL/h、この研究で使用した 1 μL/分と同様)、マイクロ流体デバイス全体内でより均一な細胞培養が得られます。 デバイスの設計に基づいて、流量が高すぎる (例: 40 μL/分) と、不完全な混合やせん断応力誘発性の細胞毒性が生じる可能性もあります 32。

細胞を培養チャンバーにロードするためのマイクロチャネルが最下層に組み込まれました。 細胞培養チャンバーの各列は 1 つの入口からロードされます。 同じ細胞を含む溶液が各入口にロードされる場合、この研究で実行されたように 4 つの生物学的複製が作成されます。 各細胞培養チャンバーを通過するマイクロチャネルの長さが同じである場合 (入口からマイクロウェルまでとマイクロウェルから出口までのチャネル長の合計)、マイクロウェルを同時に並行して充填できる場合、ローディングは最も安定します (図2A）。 各細胞培養マイクロウェルから出口までのチャネルは、ローディングプロセスを容易にし、ヒドロゲル前駆体溶液をマイクロウェルにローディングする際に必要な圧力を軽減するサンプルリリーフチャネルとして機能しました。 リリーフチャネルは、ヒドロゲルでカプセル化された細胞が灌流層に逃げて、過剰な負荷圧力下でゲル化する際に灌流をブロックするのを防ぎます。 各細胞培養ウェルは PETE 膜 (孔径 0.2 μm) で蓋をされており、これにより細胞と灌流液の間での栄養素と老廃物の交換が可能になりますが、大きな粒子、細菌、細胞の交換は制限され、汚染が起こらないことが保証されます。灌流によって起こります。 最後に、ゲルマトリックス内に含まれる細胞は、生体内システムの再現を改善するために、循環灌流液の流体力学的剪断応力から保護されました。 流路内に直接位置する細胞は流体力学的剪断応力にさらされるため、灌流流に対する培養チャンバーの位置は重要であり、これは細胞の形態、細胞骨格の構成、増殖、細胞シグナル伝達経路、遺伝子とタンパク質に影響を与える可能性があります。表現3。

ここでは、典型的な MCGG とは対照的に、供給チャネルの幅を変えることによって部分的連続希釈が達成されます。 拡散ベースのミキサーには、完全な混合が達成される最大速度があるため、供給チャネルの長さではなく幅を変えることで、よりコンパクトな混合構造が可能になります。 以前は、さまざまな形状に必要なミキサーの長さを決定するために、無次元パラメータが作成されていました33。 グラジエント混合の最大速度は、図 2B に示すように、長さ 18.5 mm の角の蛇行チャネルで顕微鏡を使用して実験的に測定されます。 流速 1、5、10 μL/min でのチャネルの入口、中間、端での混合を測定した画像を示します (図 3A)。 合計 5 つの体積流量 (1、1.5、2、5、および 10 μL/分) を使用して、混合チャネルの出口での混合の程度を決定しました。 完全な混合は、マイクロチャネル幅全体にわたる均一な溶液濃度によって示され、強度対距離のプロットの傾きがゼロになります。 図３Ｂにおいて、ＡＭＩ０は完全な混合を示す。 1 μL/分の流速では、AMI 値は 1 μL/分の流速で 0.012 と計算されました。 流量が増加すると、AMI が増加し、混合が不完全であることを示します。流量が増加すると混合の程度が減少します。 全体として、混合は体積流量に直線的に依存します (R2 = 0.93)。 デバイス上のこの固定混合長を考慮して、図 3B に示すように、1 μL/分で適切な混合が確実に行われるように、混合の流量依存性を測定しました。

混合効率。 (A) 10、5、2、1.5、および 1 μL/分での混合チャネル内の対象の入口、中間、出口領域における PBS と PBS 中のブリリアント ブルー FCF の混合の進行を示す代表的な顕微鏡画像。 (B) 灌流体積流量の関数として混合チャネルの出口領域での混合効率を示す強度プロファイルの傾き。 混合チャネルの出口領域における絶対混合指数 (AMI) を灌流体積流量の関数として計算しました。 AMI 値がゼロの場合は、混合が完了していることを示します。

混合は拡散に依存するため、流量の関数としての混合効率は分子サイズに依存すると予想され、MW とサイズが分子の拡散率を決定します 34。 混合を特徴付けるために、分子量 (MW) 792.9 g/mol のブリリアント ブルー FCF を使用しました。これは、表 1 に示すようにほとんどの化学療法剤よりも大きいです。PBS に溶解したブリリアント ブルー FCF の完全な混合は 1 で達成されました。 μL/min、拡散に必要な時間は 34.0 秒でした。 チャネルの幅を横切る拡散に必要な拡散係数と時間も、FDA が承認したいくつかの化学療法薬 (テモゾロミド、パクリタキセル、ドキソルビシン、カルムスチン、ロムスチン) について計算されました。 たとえば、我々の計算によれば、テモゾロミドはブリリアントブルー FCF よりも直径が小さく拡散率が高く、チャネル幅全体にほぼ 2 倍の速さで拡散します。 この結果は、体積流量が 1 µL/min を超えても完全な混合が起こる可能性があることを意味します。 一方、パクリタキセルは、サイズおよび拡散性がブリリアントブルー FCF と同様であり、チャネル幅全体に拡散するのに同様の時間を必要とします (31.2 秒)。 したがって、完全な混合を達成するには、体積流量 1 μL/min を使用する必要があります。 全体として、考慮したすべての分子は使用した Brilliant Blue FCF よりも小さいため、化学療法薬などの小分子の濃度希釈を目的としたほとんどの実験では、生理学的 1 μL/min の体積流量で完全な混合を達成するのに十分であると予想されます。 。

MCGG によって生成された濃度は、「100% インレット」では PBS 中の 25 μM のブリリアント ブルー FCF を、「0% インレット」では PBS を 1 μL/分で灌流することによって測定されました (図 4A)。これにより、100 の濃度が得られました。 %:51%:26%:0% (図 4B)、予想される希釈率 100%、50%、25%、0% と同様です。 希釈画分は、分割前の 100% および 0% マイクロチャネルの強度を使用して補間されました (図 4C)。 チャネル A (PBS 中にブリリアント ブルー FCF を含む注入口に最も近い) の強度を 100% に設定し、PBS を含む注入口 (チャネル D) を 0% に設定しました。 実験的に生成された濃度希釈は、予測された理論的濃度希釈と同様であり (図 1B)、R2 値は 0.99 であり、2 つの灌流液の完全な混合が 1 μL/min で達成されたことをさらに示しています。

グラデーションの生成。 (A) 生成された濃度勾配が測定されたチャネル A ～ D を示す概略図。 (B) 流速 1 μL/min での測定濃度。チャネル A には初期濃度の 100% のブリリアント ブルー FCF が含まれ、チャネル D には 0% のブリリアント ブルー FCF が含まれます。 (C) 1 μL/分の流速での各チャネルの濃度勾配の代表的な画像。

マイクロウェルへのヒドロゲルの充填の再現性、およびデバイス内のすべてのウェルにわたる充填の類似性が特徴付けられました。 装填チャネルのフロースルー設計により、セルの一貫した装填が容易になります。 セルの数密度とその位置は確率的である必要があり、ショット ノイズが負荷変動の主な原因となり、系統的なバイアスが発生することはありません。 ローディングチャネルのフロースルー設計では、細胞の蓄積や枯渇がなければ、細胞の濃度は元の均一に混合された溶液と同じになるはずです。 ローディングの再現性を測定するために、カプセル化された DiOC 染色細胞を含む PEGDA ハイドロゲルをインスリン針を使用してマイクロウェルにローディングし、ゲル化のために UV 光に曝露しました。 カラム内の 4 つのマイクロウェルすべてに同時にロードしたため (図 5A)、カラムのウェル内の細胞の平均密度を比較しました (図 5B)。 私たちの結果は、各カラムの細胞密度の中央値に有意な差がないため、ローディングの再現性が 4 つのカラム間で同様であることを示しています (図 5C)。

セルローディングの再現性。 (A) ローディング ポートとチャネル、および細胞培養マイクロウェルのデバイスの概略図。細胞培養チャンバーの各列は、列 1 から青色で色分けされています。 (B) DiOC で染色した、捕捉された U87 細胞を含むヒドロゲルを充填した細胞培養チャンバーの蛍光画像。 スケールバー = 200 μm。 (C) 各カラムの細胞培養マイクロウェル内の細胞の密度。 (D) 細胞培養マイクロウェルにロードされたときのヒドロゲルの底部、3 分の 1、3 分の 2、および上部の画像。 ヒドロゲルは、FITC 修飾リガンドの 4 アーム PEG-Ac へのテザリングによって緑色蛍光で標識されます。 スケールバー = 500 μm。

別の実験では、赤色蛍光ビーズをロードした蛍光PEG（緑色）を使用して、ヒドロゲルがウェル全体を均一に占めるかどうか、およびビーズがヒドロゲルの深さ全体に均一に分布しているかどうかを判断しました。 ウェルの深さ全体にわたって撮影された画像は、ヒドロゲルがマイクロウェルを満たし、蛍光ビーズがヒドロゲル全体に十分に分布したままであることを示した（図５Ｄ）。 ただし、緑色のゲルは、重合中に酸素にさらされる領域である PDMS 壁および膜の近くでは重合していないように見えます。 酸素は UV 重合を阻害し 35、PDMS では濃度が上昇することが知られています 36。 また、ここで使用される光開始剤などの小さな疎水性分子は、PDMS 内に容易に拡散し、ゲル前駆体溶液中の分子の濃度が低下する可能性があり、これも PDMS 壁の近くに見られる「ハロー」の原因となる可能性があります。 この形状のヒドロゲル構造は、溶質交換が起こる表面積を増加させますが、交換できる溶質の総量は変更しません。これは、灌流層を通る体積流量によって決まります。 正確な用途に応じて、このヒドロゲルの形状は有益にも有害にもなり得ます。 今後の研究では、非細胞毒性法を使用して重合前に PDMS 内の酸素濃度を下げる方法を研究する予定です。 我々は、PDMS マイクロチャネル内でヒドロゲルプラグを完全に重合させる方法を開発しました 37 が、このプロトコルの細胞毒性はテストしていません。 マイケル型添加によって重合する4アームPEG-Acゲルを細胞培養ウェルにロードすると、PDMS壁のすぐ近くを含めて完全に重合したことに注意してください（補足図S5）。マイケル型付加は酸素の影響を受けず、低分子開始剤にも依存しません。 このデータは、さまざまなヒドロゲル マトリックスが現在のデバイスに対応できることも示しています。

一般に、マイクロ流体デバイスに細胞をロードする際の課題の 1 つは、ロード中にマイクロウェル内に閉じ込められる可能性のある気泡を除去することです。 気泡を避けるために、最初にシステムに水を入れてから脱気する人もいます38。 ゲル前駆体溶液が水で希釈されないように、デバイスを乾燥状態（水で事前に満たされていない状態）でロードすることを選択しました。 気泡はマイクロ流体デバイスでは日常的に発生します 39,40。 私たちのシステムでは、気泡が細胞の生存率に悪影響を及ぼさないことを示していますが（補足図S7を参照）、複製細胞培養チャンバー間に差異が生じる可能性があります。 将来的に検討される可能性のある改善は、装置内のマイクロチャネルの形状を変更して、ローディングチャネルとリザーバーの間の鋭い角を取り除くことです39。 充填層と灌流層の両方に存在する現在の鋭い角は、角の角度が充填液体の接触角よりも小さいため、空気を閉じ込める可能性があり、湿潤性が低下する状況が生じます。

まず、灌流中の小分子（化学療法剤など）がヒドロゲル内に拡散し、灌流チャネルと同じ濃度に達するまでにかかる時間を決定しました。 この拡散を測定するために、蛍光団 Atto 655 (887 g/mol) を使用して、TMZ (194 g/mol) や BCNU (214 g/mol) などの小分子薬剤の拡散率をモデル化しました。これにより、拡散の測定が可能になりました。 FCSを使用して現場およびリアルタイムで係数を計算します（補足図S6）。 培地およびPEGDAヒドロゲルにおける蛍光色素Atto 655の拡散係数は、それぞれ4.25×10-6および2.55×10-6 cm2/sと測定されました。 予想どおり、媒体内の拡散係数はヒドロゲル内の拡散係数よりも大幅に高かったが、これは、我々が以前に示したように、物理的な障害によって説明できる可能性がある41。 次に、測定された拡散係数を使用して、フィックの拡散の法則を使用して、TMZ または BCNU がヒドロゲルに浸透できるかどうか、および薬物がゲル内で目的の濃度に達するまでにどれくらい時間がかかるかを判断しました。 ヒドロゲルの深さ 250 μm (マイクロウェル内のゲルの厚さ) で、TMZ 濃度 (初期濃度 2 mM) と BCNU 濃度 (初期濃度 10 μM) を時間の関数として (最大 48 時間) モデル化しました。 薬物濃度は、TMZ 添加時は 1 時間以内に > 1.9 mM、4 時間以内に > 1.95 mM、BCNU 添加時は 1 時間以内に > 9.5 μM であることが判明しました。これは、48 時間の曝露の間、すべての細胞が両方の薬物に等しく曝露されるべきであることを示しています。 。

次に、2 つの異なる PEG ハイドロゲルで 2 つの異なる薬物、つまり TMZ と BCNU に対する U87 細胞の感受性をテストしました。 TMZ は現在の標準治療であり、BCNU はアジュバントとして、または TMZ と組み合わせて使用​​されます。 どちらの薬剤も膠芽腫の治療薬として承認されており、細胞周期停止とアポトーシスを誘導することが知られているアルキル化剤です42。 2 つのゲルは、PEGDA と酵素分解可能な RGD 修飾 4 アーム PEG-Ac ゲルでした。 UV光重合によって形成されたPEGDAゲルは非分解性で不活性であるため、細胞はそれと相互作用するとは予想されませんでした。 それは足場としてのみ機能し、その中にカプセル化された細胞は最大4日間高い生存率（> 90％）を保持しましたが（補足図S7A）、丸いままでした（補足図S7B）。 4アームPEG-Acゲルは分解性で細胞接着性があり、細胞はヒドロゲルと相互作用し、4日目の細胞拡散と細胞生存率> 95％で証明されるように、時間の経過とともにヒドロゲルを再構築することができました（補足図S7）。

0、0.5、1、および 2 mM TMZ で処理すると、PEGDA カプセル化 U87 細胞の生存率はそれぞれ 86.4 ± 1.9%、75.0 ± 1.2%、34.0 ± 7.7%、および 15.8 ± 5.7% であることがわかりました (図 1)。 6A、B）。 EC50 (細胞の 50% を死滅させるのに必要な有効濃度) は、シグモイド曲線フィット (R2 = 0.983) によって計算すると、約 0.61 mM TMZ であると推定されました。 分解性で接着性のある4アームPEG-Acヒドロゲルにカプセル化された場合、細胞はTMZの影響を受けにくくなりました（図6C、D）。 細胞生存率は、0、0.5、1、および 2 mM TMZ でそれぞれ 95.6 ± 1.2%、83.9 ± 12.9%、59.1 ± 6.1%、および 44.0 ± 8.2% であり、EC50 は約 1.8 mM (R2 = 0.901) でした。 インテグリン結合は神経膠芽腫細胞の薬剤耐性に以前から関与しており 43、44、45、我々は神経膠芽腫スフェロイドについても同様の結果を以前に示しているため、この結果は驚くべきことではありません 46。 PEGDA ヒドロゲルにカプセル化され、BCNU で処理された U87 細胞の EC50 は、約 8.2 μM (R2 = 0.952) でした (図 6E、F)。 すべての条件で予想されたように、推定 EC50 は 2D 単層培養と比較して高かったが、ヒドロゲルでカプセル化された GBM 細胞について他の人が報告したものと同様でした 2。 すべての条件で 48 時間の曝露後、死んだ細胞がゲル全体に見られ、ゲル内の微小環境が均一であることが示唆されました (図 6A、C、E)。

薬物反応性。 (A) TMZ 処理時の代表的な U87 細胞の生死画像、(B) 非分解性、非接着性 PEGDA ゲルに播種した細胞の TMZ 濃度の関数としての細胞生存率 (n = 3)。 (C) TMZ 処理時の代表的な U87 細胞の生/死画像、および (D) 分解性接着性 4 アーム PEG-Ac ゲルに播種した細胞の TMZ 濃度の関数としての細胞生存率 (n = 3)。 (E) BCNU 処理時の代表的な U87 細胞の生/死画像、および (F) 非分解性、非接着性 PEGDA ゲルに播種した細胞の BCNU 濃度の関数としての細胞生存率 (n = 3)。 すべての細胞は DiOC (緑色) で染色され、死細胞は PI (赤色) で染色されました。 スケールバーは200μmです。

我々の結果は、このデバイスが、化学療法薬などの可溶性因子に対する細胞の応答性に対する細胞-マトリックスの相互作用の影響をテストするために使用でき、治療薬が細胞を播種したヒドロゲルに容易かつ均一に浸透できることを示唆しています。 ここでは詳しく説明しませんが、このデバイスはさまざまな細胞や細胞の共培養での使用に適合し、さまざまな可溶性分子に対するそれらの応答をスクリーニングすることができます。 この設計にはヒドロゲルでカプセル化された細胞が含まれているため、灌流を含み、濃度の形成を可能にする生理学的に関連した環境における治療薬など、可溶性因子に対する細胞の応答性に対する細胞-マトリックスおよび細胞-細胞相互作用の影響を研究するために使用できる可能性があります。希釈。

この研究では、ヒドロゲルでカプセル化された細胞で満たされたマイクロウェルを組み込んだ薬物スクリーニングマイクロ流体デバイスを設計しました。 このデバイスは、シームレスなヒドロゲルの装填を可能にするリリーフチャネルと、汚染および灌流チャネルの閉塞を防ぐ膜キャップ付きウェルを特徴としていました。 プレーン PBS とブリリアント ブルー FCF を使用してデバイスの混合効率を特性評価し、完全な混合を達成するには生理学的 1 μL/min が最適な流量であると判断しました。 ストークの方程式とフィックの拡散第 2 法則を使用して、一般的に使用される化学療法剤が混合チャネル幅全体に拡散するのに必要な時間を決定しました。 最適な流量では、デバイス内で生成される濃度希釈は、予想される濃度希釈に匹敵しました。 さらに、各ウェル列のヒドロゲルカプセル化細胞の密度中央値が 4 つのウェルすべてで同様であり、細胞がヒドロゲル全体に十分に分布したままであるため、ローディング手順の再現性が高いことがわかりました。 我々は、UV 架橋可能な PEGDA とマイケル型付加架橋可能な 4 アーム PEG-Ac の 2 つのヒドロゲル タイプをテストし、さまざまなゲル化メカニズムがデバイスに対応できることを示しました。 標準治療化学療法剤であるテモゾロミドとカルムスチンで処理した U87 神経膠芽腫細胞の用量反応曲線を作成することで、薬物スクリーニング アッセイが強調されました。 現在のデバイスの制限は、細胞培養ウェルの 4 × 4 アレイが含まれていることですが、今後は 8 × 8 アレイを使用して複数の条件を同時にテストし、7 つの希釈液（薬剤なし/可溶性溶液を含む）を取得できる可能性があります。分子制御）を使用して、堅牢な用量反応曲線を構築します。 ここで開発されたマイクロ流体デバイスは、細胞、マトリックス、および灌流を組み込んでおり、ネイティブの細胞環境をよく模倣しており、多重薬物スクリーニングを可能にするシンプルで安価な技術となります。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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セントルイス大学生物医工学部、セントルイス、ミズーリ州、63103-2010、米国

アリソン・クランシー、ジョセフ・ブランズ、ジャナビ・ナデラ、サミュエル・スティーリー、シルヴィア・P・ズスティアク

米国ペンシルバニア州フィラデルフィア、ペンシルバニア大学生物工学部、生化学および生物物理学科

デイイー・チェン、ヤンジア・チャン、アーロン・ティンパーマン

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AT と SZ はアイデアを考案し、プロジェクトを設計し、研究を監督し、資金を提供しました。 ACとSZは原稿の初稿を書きました。 マイクロ流体デバイスは、ATJB の指導の下で DC によって製造され、AC によって作成されました。 1、5、および補足図S5。 DC、AC、YZは図2と補足図を用意しました。 S1～S4。 AC、JN、SS が図を作成しました。 3 および 4。SS を準備しました。図 S6。 JB が図 S7 を用意しました。 すべての著者が主要な原稿テキストに貢献し、査読しました。

アーロン・ティンパーマンまたはシルヴィヤ・P・ズスティアクとの通信。

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転載と許可

Clancy, A.、Chen, D.、Bruns, J. 他多重化された 3D in vitro 細胞培養を備えたヒドロゲルベースのマイクロ流体デバイス。 Sci Rep 12、17781 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-22439-y

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受信日: 2022 年 6 月 1 日

受理日: 2022 年 10 月 14 日

公開日: 2022 年 10 月 22 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22439-y

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