波

Oct 16, 2023

軍事医学研究第 9 巻、記事番号: 8 (2022) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

感染症の早期診断と分類は合併症を減らしながら治癒率を高めます。これは重度の感染症、特に戦争手術の場合に重要です。 しかし、従来の方法は、面倒な操作と大型の装置に依存しています。 一方で、ポイントオブケア (POC) 手法には堅牢性と精度が限られているという問題があります。 したがって、現場の軍事化された要件を満たすために、感染を迅速かつ正確に診断するための POC デバイスを開発することが緊急に求められています。

我々は、波形マイクロ流体チップ（WMC）支援多重検出プラットフォーム（WMC-MDP）を開発しました。 WMC-MDP は、サンプルの事前混合と試薬の反応を通じて検出時間を短縮し、再現性を向上させます。 さらに、検出プラットフォームをストレプトアビジン – ビオチン (SA-B) 増幅システムと組み合わせて、シグナル読み取りとして化学発光 (CL) 強度を使用しながら感度を向上させました。 検出プラットフォーム上で C 反応性タンパク質 (CRP)、プロカルシトニン (PCT)、インターロイキン 6 (IL-6) の同時検出を実現し、感度、直線範囲、選択性、再現性を評価しました。 最後に、ボランティアからの 15 サンプルの検出を完了し、結果を市販の ELISA キットと比較しました。

CRP、PCT、IL-6 の検出では、それぞれ 1.25 ～ 40 μg/ml、0.4 ～ 12.8 ng/ml、50 ～ 1600 pg/ml の範囲で CL 強度と濃度の間に良好な直線関係が示されました。 CRP、PCT、およびIL-6の検出限界は、それぞれ0.54μg/ml、0.11ng/ml、および16.25pg/mlであった。 WMC-MDP は適切な選択性と再現性を実現します。 検出手順全体にかかる時間はわずか 22 分で、POC デバイスの要件を満たします。 ボランティアからの 15 サンプルの結果は、市販の ELISA キットで検出された結果と一致しました。

WMC-MDP を使用すると、CRP、PCT、および IL-6 を同時に、迅速かつ高感度に検出でき、十分な選択性と再現性が得られ、必要な操作は最小限です。 ただし、WMC-MDP は、変動係数が 10% 未満であるマイクロ流体デバイスであることを利用して、WMC-MDP を一種のポイントオブケア検査 (POCT) として使用できます。 したがって、WMC-MDP は、複数のバイオマーカーの POCT に代わる有望な代替手段を提供します。 私たちは、軍事分野での WMC-MDP の実用化が兵士の感染症診断に革命をもたらすと信じています。

感染症は、治療せずに放置すると、特に外傷や戦争手術の分野で、軽度の皮膚炎から重度の臓器不全につながる可能性があります。 細菌感染症とウイルス感染症が主な感染症の種類です[1、2]。 重度の感染症は敗血症を引き起こす可能性があります。 敗血症治療が 1 時間遅れると、死亡リスクが 6 ～ 10% 増加します [3]。 したがって、感染症を迅速かつ正確に診断および分類するには、バイオマーカーを分析する必要があります[4、5、6]。 C 反応性タンパク質 (CRP) [7]、プロカルシトニン (PCT) [8]、インターロイキン 6 (IL-6) [9] の多重検出は、感染症と敗血症を正確に診断するための信頼できる方法です [10]。 正常なヒト血清では、CRP の含有量は一般に 8 μg/ml 未満です。 CRP の上昇は感染症の重症度と正の相関関係があります [11]。 高レベルの CRP は、細菌感染症や、ヘマグルチニン 1 ノイラミニダーゼ 1 (H1N1) や 2019 年コロナウイルス感染症 (COVID-19) などの一部のウイルス感染症に関連しています [12、13、14]。 冠状動脈性心疾患 [15、16]、癌 [17、18]、およびその他の同様の種類の疾患には、高濃度の CRP が含まれています。 このため、CRP の検出に基づく感染症の診断は正確ではありません。 通常、健康な成人の血液中の PCT レベルは 0.5 ng/ml 未満です。 PCT は細菌感染を検出するための特異的な指標です [19]。 ウイルス感染が起こっても濃度は正常のままです。 IL-6 は、感染症を診断するための高感度かつ特異的なバイオマーカーです。 正常なヒト血清中の IL-6 のレベルは 75 pg/ml 未満であり [20]、これは非常に低いです。 ウイルスや細菌の感染を特定するために IL-6 を検出することは困難です。 重度の感染症または敗血症を患う患者の血清では、IL-6 のレベルが 1000 pg/ml を超えます。 CRP、PCT、IL-6は異常の発生時期や特徴が異なります。 単一のバイオマーカーを検出するだけでは、感染症の誤診につながる可能性があります。 CRP、PCT、IL-6 を多重検出することで、感染期間全体をカバーできます。 感染症の分類と重症度を効果的に評価します[21]。 軍事化されたポイントオブケア検査（POCT）の分野では、感染性バイオマーカーの多重検出技術を開発することが不可欠である[22、23、24]。

医療検出のための新たなプラットフォーム [25、26、27] として、マイクロ流体チップは軍事化された POCT デバイスを開発する可能性を持っています [28、29]。 ムーら。 [30] は、エレクトロスピニングされたマイクロファイバーと金ナノ粒子を使用してシグナルを増幅することにより、CRP、PCT、および IL-6 の多重検出を達成しました。 しかし、検出手順には 1 時間以上の費用がかかりました。 さらに、操作に手間がかかり、不安定であるため、戦場のような複雑な環境に適用することが困難でした。 ラッセルら。 [31] は、電気化学発光 (ECL) イムノアッセイを使用して IL-6 を 2.5 分で検出しました。 しかし、単一のバイオマーカーという制限と感度の低さのため、分類診断を可能にすることはほとんどできません。 ズパンチッチら。 [32]は、全血中の複数の敗血症バイオマーカーを同時に検出するための低コストの電気化学センサープラットフォームについて説明しました。 彼らは、導電性を維持しながら生物付着を防ぐために、架橋されたウシ血清アルブミンで作られたナノ複合コーティングを組み込みました。 これは、3 つのバイオマーカーの検出を 1 つのセンサー システムに統合する潜在的なプラットフォームです。

ここでは、マイクロミキサー、化学発光 (CL)、およびストレプトアビジン – ビオチン (SA-B) と組み合わせて、CRP、PCT、および IL-6 用の波形マイクロ流体チップ (WMC) 支援多重検出プラットフォーム (WMC-MDP) を開発します。 ） システム。 WMC-MDPはサンドイッチ構造となっています。 WMC は、上部のチャネル層、下部のベース層、中央の検出層で構成されます。 抗原と検出抗体はマイクロミキサーで事前に混合されます。 プレミックスはインキュベーションと洗浄のステップを簡素化し、最適化と前処理により検出時間を短縮します。 SA-B システムは、IL-6 のシグナルを増幅して、バイオマーカー間の大きな含有量ギャップの問題を克服します。 CL画像解析システムからCL強度を読み取り、バイオマーカーの濃度を解析します。 さらに、WMC-MDP は、動的な戦場環境で CRP、PCT、および IL-6 を迅速かつ堅牢かつ正確に多重分析して、感染を確実に特定することができます。

CRP (CRP-Ab1)、PCT (PCT-Ab1)、IL-6 (IL-6-Ab1) の捕捉抗体粉末は、Abcam (UK) から入手しました。 CRP、PCT、およびIL-6はAbcam (UK)から購入しました。 西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）と結合したCRP（CRP-Ab2）、PCT（PCT-Ab2）の検出抗体粉末は、Abcam（英国）から購入しました。 ビオチンと結合した IL-6 (B-IL-6-Ab2) および SA と結合した HRP (SA-HRP) の検出抗体は、Thermo Fisher Scientific (USA) から入手しました。 ウシ血清アルブミン画分 V (BSA) 粉末は、Tianjin Kangyuan Biotechnology Co., Ltd. (天津、中国) から入手しました。 検出抗体は、0.05% BSA 溶液を使用して希釈します。 WMC チャネルの前処理には 5% BSA 溶液が必要です。 リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）錠剤およびＴｗｅｅｎ−２０をＡｍｒｅｓｃｏ（米国）から購入し、０．０１ｍｏｌ／ｌ ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）および０．５％リン酸緩衝生理食塩水Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）溶液を調製した。 捕捉抗体と抗原は PBS 溶液で希釈されます。 超高感度化学発光基質試薬キットは、Beijing Labgic Technology Co., Ltd. (北京、中国) から入手しました。 ポリジメチルシロキサン（PDMS）および硬化剤（Sylgard 184）をDow Corning Inc.（米国）から購入して、マイクロ流体チップを調製した。 捕捉抗体のコーティングに使用したシリコーン フィルム (100.0 mm × 100.0 mm × 0.1 mm) は、Shanghai Shentong Robot and Plastic Products Co., Ltd. (上海、中国) から購入しました。 SHINING 3D Technology Co., Ltd. (中国揚州市) の Lasty-R 樹脂を 3D プリンティングの材料として使用しました。

人間の参加者が関与する研究は、揚州大学医科大学の倫理委員会によって審査され、承認されました（YXYLL-2020-89）。 すべての被験者は書面によるインフォームドコンセントを提供した。 臨床サンプルの検査には、3 人の健康な個人と 12 人の患者からのサンプルが含まれていました。 血清サンプルは、検出前に -80 °C で保存されました。 すべての実験はガイドラインに従って実行されました。

金型の製造には、SHINING 3D Technology Co., Ltd. (揚州、中国) 製の Lite 600HD 3D プリンターを使用します。 DZF-6020A 真空乾燥オーブン、202-00 T 電気恒温乾燥機は、LICHEN-BX Co., Ltd. (上海) から入手しました。 、 中国）。 SANHOPTT Co., Ltd. (中国深セン市) は、PT-10 s プラズマクリーナーを提供しました。 ISPLab02 インテリジェント シリンジ ポンプは、DK INFUSETEK Co., Ltd. (上海、中国) から購入しました。 CL 画像解析システムは、BIO-OI Co., Ltd. (広州、中国) から購入しました。 マイクロチャネルの特性評価には、MEGA Instruments Co., Ltd. (蘇州、中国) の IMM 3000 金属組織顕微鏡を使用します。 INESA Analytical Instrument Co., Ltd. (中国、上海) の L5S UV/VIS 分光光度計を使用して透過率をテストしました。

WMC のサンドイッチ構造設計は 2 つの部分で構成されます。 二重の PDMS 層と検出層。 バルブと 2 つのホルダーを含む追加機能もあります。 SolidWorks® 2016 ソフトウェアを使用して、WMC の 3 次元モデルを設計しました。

チャネル層は、サンドイッチ構造の上部で長さ 68 mm、幅 37 mm、厚さ 4 mm です。 4つの貯水池が含まれています。 各リザーバーは 85 μl の試薬を収容できます。 試薬を導入して圧力を均一にするために、各リザーバーには 1 mm の通気孔が開けられています。 抗原、検出抗体、酵素は波形マイクロミキサーを使用して混合されます。 ミキサーは長径 5.0 mm、短径 3.0 mm の半楕円形ユニット 5 個で構成されています。 各ユニット接続にはエンドツーエンドのリンケージがあります。 マイクロミキサーとリザーバーの間には、両者を接続するための直径8.5mmのバルブ穴があります。 波形マイクロミキサーの先端には、3.0mmのギャップで平行に配置された3本の直線状流路の検出流路を設計しました。 半円チャネルは、1.0 mm の負圧ベントを備えた 3 つの直線チャネルを接続します。 試薬の注入と流体の駆動のために、すべての通気口をフレキシブル チューブに挿入しました。 したがって、流体駆動には正圧と負圧の両方が可能になります。 すべてのチャネルは幅と深さが 400 μm で、総液体保持容量は 20 μl です。 長さ 10.0 mm、幅 8.0 mm、厚さ 0.1 mm のシリコン フィルムは、二重 PDMS 層の間に捕捉抗体ストリップでコーティングされた検出層です。 WMC の下部ベース層は、前述のチャネル層と同じサイズとバルブ穴を持っています。 ベース層には廃試薬を受け入れる廃液リザーバーが設計されています。

外側のチップの設計には、チップを支えるためにピンで接続された厚さ 2.0 mm の 2 つのホルダー プレートがあります。 両方のホルダープレートには、TM バルブの揺れ現象を避けるために、平行移動タイプのメカニカル (TM) バルブに適合する穴があります。 上部ホルダープレートは、リザーバーに通気口を露出させるための別の穴で構成されています。 TM バルブは、異なる高さのチャネルを設定することで、必要なリザーバーを波形マイクロミキサーに接続します。 TM バルブの移動中、接続されたリザーバーは、TM バルブの対応するチャネルとの出口の位置合わせには依存しません。

二重 PDMS 層と補助部品の金型の製造には、3D プリンターを使用して製造しました [33、34] (追加ファイル 1: 図 S1a)。 金型はPDMSの硬化時の高温による金型の変形を防ぐため、耐熱性の高い樹脂材料で作られています。 補助部品は透明な材質を使用しており、流体の動きを容易に観察できます。 すべてのパーツを印刷した後、99.7% エタノールを使用した超音波洗浄機で 5 分間洗浄し、UV 硬化チャンバーで 15 分間硬化します。 金型を研削して表面粗さをRa=1.6μmにします。 寸法精度や透過率の向上に役立ちます。 チャンネルの形状を改善するために、表面モールドの表面にグロスオイルをスプレーします。 PDMS と硬化剤は 10:1 の重量比で均一に混合されます。 真空乾燥オーブンを使用して混合物の泡を取り除きます。 その後、型に流し込みます。 PDMS は、70 °C の電気恒温乾燥オーブンで 90 分間硬化されます。 PDMS を離型した後、チャネル層とベース層の完成です。 プラズマクリーナーは表面のシリコンと酸素の結合を破壊し、チャネル層とベース層を結合します。

検出層を 2 つの PDMS 層の間に挟み、二重 PDMS 層が検出チャネル領域全体を確実にカバーするように必要な予防措置を講じました。 検出層上の捕捉抗体ストリップは、検出チャネルに対して垂直でなければなりません。 二重 PDMS 層に適切な圧力を加えることで、確実な結合が確保されます。 接着された PDMS 層を収容するために、ピンを使用して 2 つの保持プレートが構築されます。 WMC でのサンプルの追加と流体の駆動を容易にするために、バルブ穴には TM バルブが使用されています。 ポンプに接続するすべての通気口には、適切な長さのフレキシブル チューブが使用されています。 最後に、WMC-MDPのアセンブリが完了します（追加ファイル1：図S1b）。

当社のマイクロ流体チップ設計の 3 つのチャネルはすべて、シリコン シートを捕捉抗体でコーティングできます。 チャネルは幅と深さが 400 μm で、同様に平行で 3 mm 間隔です。 シリコーンフィルムはデザインの寸法にカットされ、その長さに沿って配置されます（追加ファイル1：図S2a）。 CRP-Ab1、PCT-Ab1、IL-6-Ab1がそれぞれチャネルに注入され、その後20分間の静止期間が続きます（追加ファイル1：図S2b）。 その後、PBSTバッファーを各チャネルに3回注入して、コーティングされていない捕捉抗体を除去します（追加ファイル1：図S2c）。 最後に、チップが取り外され、検出層が捕捉された抗体でコーティングされます（追加ファイル 1：図 S2d）。

次に、完成した WMC-MDP 上の適切な高さまで TM バルブを押して、50 μl の 5% BSA 溶液を任意のリザーバーに加えました。 陽圧は試薬をリザーバーベントに強制的に通すために使用され、負圧は試薬を負圧ベントに通させるために使用されます。 すべてのチャネルを BSA 溶液で完全に満たした後、WMC-MDP を 30 分間不活性状態にして、非特異的タンパク質の吸着を最小限に抑えます。 さらに、BSA 溶液の添加は品質管理手段として機能します。 追加手順中に液体がこぼれると、チップの品質が損なわれます (追加ファイル 1: 図 S3)。

CRP、PCT、および IL-6 を検出する WMC-MDP の基本手順には、前処理、前混合、および信号の読み出しが含まれます。 前処理には、捕捉された抗体ストリップで検出層をコーティングし、チャネルの表面を修飾することが含まれます。 プレミックスの目的は、免疫反応を行う前に、検出のために抗原と抗体を混合することです。 マイクロミキサーで抗原と抗体を事前に混合すると、インキュベーションと洗浄の必要がなくなり、検出時間を半分に節約できます。 HRP とルミノール H2O2 の基質との反応により、H2O2 が酸素フリー ラジカルに分解され、HRP によって触媒されてルミノールが酸化されて CL シグナルが生成されます。 CRP および PCT の濃度は血清中で高く、HRP 結合抗体によって直接検出できます。 ただし、血清中のIL-6濃度が低いため、シグナル増幅システムを導入する必要があります。 SA-B システムを使用して、ビオチンと抗体、およびストレプトアビジンと HRP を結合させて IL-6 を検出しました。 2 つの複合体の調製は成熟した商業的なプロセスです。 自動システムが CL 信号を読み取り、CL 画像を分析します。

マイクロミキサーは、マイクロ流体チップと統合された信頼性の高い構造です [35,36,37]。 マイクロミキサーの効果は、サンプル中のタンパク質が均一に混合されるかどうかにかかっています。 WMC-MDP では、事前混合によって検出時間を短縮することが必須の前提条件です。 COMSOL Multiphysics 5.6 ソフトウェアを使用して、波形マイクロミキサーの 3 次元モデルで混合状態をシミュレーションし、波形マイクロミキサー内で試薬を混合する効果を調査しました。 判定は個々のタンパク質の動きの変化に依存しないため、生体力学的な側面を考慮する必要がありません。 WMC-MDP 内の流体はポンプによって駆動され、レイノルズ数 (Re) 0.4 (図 1a)、4 (図 1b)、および 40 (図 1c) で移動します。 2種類の液体が均一な液体に変化するかどうかを調べるために、濃度0 mol/lと1 mol/lの液体を波形マイクロミキサーで混合しました。 混合の影響を定量化するために、次の式を使用して混合効率を評価します。

COMSOL ソフトウェアを使用した、異なる Re における波形マイクロミキサーの混合効果のシミュレーション。 a Reが0.4のとき、出口での混合効率は0.99606でした。 b 再び Re が 4 の場合、出口での混合効率は 0.99874 でした。 c Re 40 の下で観察された出口での混合効率は 0.99999 でした。 再レイノルズ数

ここで、 \(c\) は液体の濃度、 \(\overline{c}\) は平均濃度、 \(\Gamma\) は出口面から測定した濃度、 \(A\) は出口面の領域。

Re が 0.4、4、40 の場合、混合効率はそれぞれ 0.99606、0.99874、0.99999 になります。 WMC-MDP は幅広い Re 範囲で効果的なプレミックスが可能で、マニュアル操作から機器によるオートメーションまでの要件を満たします。

正確なサイズは、マイクロミキサーの通常の動作、スムーズな流体の動き、および検出感度を確保するための基礎となります。 3D プリントされたモールドは、マイクロ流体チップの製造における新興技術です [38]。 3D プリンティング技術を使用する際の WMC モールドの製造の信頼性を検証するために、顕微鏡を使用して WMC のチャネルの寸法を測定しました。 チャネル層の直線チャネルと曲線チャネル (図 2a ～ c​​)、TM バルブのチャネル (図 2d) の寸法偏差は 2% 以内です。 3D プリンティングを使用して製造された WMC は製造精度が非常に高く、量産の要件を満たせることが証明されました。

WMC コンポーネントのチャネルの寸法。 WMC マイクロチャネルの長手方向部分は、設計幅 400 μm で調査および特性評価されており、実際の幅は 395.37 μm で、寸法偏差は 1.16% です。 b WMC の湾曲したチャネルも 400 μm の幅設計に従って測定されます。 しかし、実際の幅は 405.41 μm で、寸法偏差は 1.35% です。 c WMC のチャネルの深さは 400 μm の設計高さを持っています。 しかし実際には、高さは 407.25 μm で、寸法偏差は 1.81% です。 d TM バルブの流路幅の設計値 400 μm と比較すると、402.73 μm および 403.35 μm となります。 ここで、平均寸法偏差は 0.61% です。 WMC波形マイクロ流体チップ、TMバルブ並進型メカニカルバルブ

寸法精度に加えて、透過率もチップの製造を評価する基準になります。 チップ内の流体の動きを観察し、CL強度を検出するために、可視領域（380〜720 nm）でのWMCの透過率を調べました（追加ファイル1：図S4）。 結果は、可視領域における WMC の平均透過率が 85.97% であることを示しました。 CL 強度 (425 nm) [39] を検出するための最適条件では、WMC の透過率は 86.04% です。 PDMS の 95% 透過率と比較して、WMC の光透過率は大幅に低下せず、観察および検出の要件を満たします。

CRP、PCT、IL-6を検出層に捕捉するための抗体濃度を最適化するために、異なる濃度の抗体をコーティングしました。 10、20、40、60、80μg/mlのCRP-Ab1およびPCT-Ab1（追加ファイル1：図S5aおよびb）、20、40、60、80、120μgのIL-6-Ab1を調査しました。 /ml（コーティング用）（追加ファイル1：図S5c）。 CRP-Ab2、PCT-Ab2、およびB-IL-6-Ab2の濃度はすべて75μg/mlであった。 SA-HRPの濃度は4μg/mlであった。 他の実験条件は一貫しています。 最初は、CL 強度は捕捉抗体の濃度と正の相関があります。 捕捉抗体の濃度がある程度高くなると、CL強度の上昇は目立たなくなります。 捕捉抗体の濃度が高レベルになると、CL 強度はさらに低下します。 CRP-Ab1、PCT-Ab1、IL-6-Ab1 を捕捉するための最適条件は 40、60、および 80 μg/ml です。 コーティングに最適な濃度を使用しました。

6.25、12.5、25、50、および75μg/mlの濃度の検出抗体は、CRPを検出するための最適条件を調査するために使用されます（追加ファイル1：図S6a）。一方、12.5、25、75μg/mlの濃度の検出抗体は、CRPを検出するための最適条件を調査するために使用されます。 50、75、100 μg/ml は、PCT および B-IL-6 の検出に使用されます (追加ファイル 1: 図 S6b および c)。 CL の強度は、プラトーに達するまで検出抗体の濃度を増加させることによって強化されます。 したがって、最適濃度として 25 μg/ml の CRP-Ab2、50 μg/ml の PCT-Ab2、および B-IL-6-Ab2 を選択しました。

流体の駆動には負圧蠕動ポンプを使用しました。 まず、ポンプを負圧ベントに接続します。 次に、30μlのサンプル、40μlの混合溶液（検出抗体およびSA-HRP）、70μlのPBST、および35μlの基質をそれぞれ4つのリザーバーに添加します（図3a）。 検出手順には以下が含まれます: (1) TM バルブを適切な高さまで押して、SA-HRP 溶液を含むサンプルと検出抗体が波形マイクロミキサーに確実に入るようにする、(2) 混合溶液を反応チャネルにポンプで送り込む、(3) ) TM バルブを次の高さまで押して位置決めし、未反応の試薬を除去するために PBST 溶液を検出チャネルにポンプで送ります (図 3d)、(4) TM バルブを押し当てた後、CL 基質を検出チャネルにポンプで送り、HRP と反応させます。最後の高さ。 マイクロミキサーでは、試薬を均一に混合し、最初に反応させることができます (図 3b)。 第 2 のステップでは、溶液を 20 分間インキュベートして免疫反応を生成し、二重抗体サンドイッチ構造を形成します。 (図3c)。 最後に、捕捉抗体と検出チャネルのストリップが交差して 3 × 3 の検出スポットを形成します。 CL画像解析システムによりCL強度を取得し、その後の解析にはGEL-PRO Analyzerソフトウェアを使用しました（図3e）。 プロセス全体には 22 分かかります。

WMC-MDP を使用した CRP、PCT、および IL-6 の多重検出の概略図。 a 検出の前の前処理には、捕捉抗体ストリップのコーティング、チャネルの表面準備、および試薬の添加が含まれます。 b 波形マイクロミキサー内でサンプルを検出抗体と事前混合します。 c サンドイッチイムノアッセイは検出されたチャネルで発生し、Ab1-CRP-Ab2-HRP、Ab1-PCT-Ab2-HRP、および Ab1-IL-6-Ab2-B-SA-HRP の構造を形成します。 d チャネルを洗浄して未反応の試薬を除去します。 e CL 基質をチャネルに追加して CL 強度を生成します。 CRP c反応性タンパク質、PCT プロカルシトニン、IL-6 インターロイキン-6、WMC-MDP 波形マイクロ流体チップ支援多重検出プラットフォーム、PBST リン酸緩衝生理食塩水 tween-20、CL 化学発光、BSA ウシ血清アルブミン、CRP-Ab1 捕捉抗体c反応性タンパク質のPCT-Ab1プロカルシトニン捕捉抗体、IL-6-Ab1インターロイキン6の捕捉抗体、c反応性タンパク質のCRP-Ab2検出抗体、プロカルシトニンのPCT-Ab2検出抗体、B-IL-6 - ビオチン結合インターロイキン 6、HRP 西洋わさびペルオキシダーゼ、ストレプトアビジン結合 SA-HRP 西洋わさびペルオキシダーゼの Ab2 検出抗体

線形範囲、検出限界 (LOD)、および選択性により、WMC-MDP の検出性能を評価できます。 最適な条件下では、CRPは0.16〜80μg/mlの範囲で、PCTは0.1〜51.2ng/mlの範囲で、IL-6は12.5〜6400pg/mlの範囲で検出されました（図4a、 b）。 直線範囲は、CRP の場合は 1.25 ～ 40 μg/mL (\(Y = - 105726.34 + 18258.99X\); \(R^{2} = 0.99\))、PCT の場合は 0.4 ～ 12.8 ng/mL (\(Y = - 57834.93 + 24184.26X\); \(R^{2} = 0.99\))。 IL-6 の場合は 50 ～ 1600 pg/ml (\(Y = - 30857.38 + 19426.37X\); \(R^{2} = 0.97\)) (図 4c)。 線形範囲は 3 つのバイオマーカーのカットオフ値をカバーしています。 \(LOD = 3S/M\)、S はブランク サンプルの標準偏差、M は線形曲線の傾きです。 CRP、PCT、およびIL-6のLODは、それぞれ0.54μg/ml、0.11ng/ml、および16.25pg/mlである。 LOD はカットオフ値よりもはるかに低いため、3 つのバイオマーカーの感度は POCT のニーズを満たすことができます。

CL 強度は、WMC-MDP を使用した CRP、PCT、および IL-6 の多重検出から取得され、検出範囲、直線範囲、および選択性を構築します。 a さまざまな濃度での直線範囲内の CRP、PCT、および IL-6 の CL 写真。 スキャンでは、左上隅に CRP、中央に PCT、下隅に IL-6 が表示されます。 b CRP、PCT、IL-6の検出範囲。 c CRP、PCT、IL-6 のライナー範囲。 d さまざまな組み合わせでの CRP、PCT、および IL-6 の CL 画像。 CL化学発光、CRP C反応性タンパク質、PCTプロカルシトニン、IL-6インターロイキン-6、WMC-MDP波形マイクロ流体チップ支援多重検出プラットフォーム

3 つのバイオマーカーの多重検出を実現するには、交差反応がないことが前提となります。 CRP、PCT、およびIL-6のすべての組み合わせを検出して、それらが違いをもたらすかどうかを観察しました（図4d）。 検出プロセスは、リザーバー内のサンプルの組み合わせが異なることを除いて一貫しています。 CRP、PCT、IL-6の濃度は10μg/ml、0.8ng/ml、100pg/mlである。 結果は、対応する捕捉抗体がコーティングされている場合にのみ CL シグナルが現れることを示しています。 バイオマーカーのさまざまな組み合わせは、検出スポットの CL 強度に影響を与えません。 これは、交差反応が生成されなかったこと、および WMC-MDP が感染性バイオマーカーを多重検出できることを示しています。

再現性も WMC-MDP の検出能力を評価する重要な指標です。 同じサンプルを検出するために、同じバッチから製造された 10 個の WMC を使用しました。 サンプル中の CRP、PCT、および IL-6 の濃度は 10 μg/ml、0.8 ng/ml、および 100 pg/ml です。 結果は、CRP、PCT、IL-6 の変動係数 (CV) がそれぞれ 5.24% (追加ファイル 1: 図 S7a)、5.02%、6.12% (追加ファイル 1: 図 S7b および c) であることを示しています。 すべての CV は 10% 未満であり、WMC-MDP の再現性が POCT アプリケーションに適合していることを示しています。 WMC の正確な製造と実験条件の最適化により、最適な再現性が保証されます。

POCT および商品化の要求を満たすために、WMC-MDP は優れた保存安定性を備えている必要があります。 温度 4 °C、圧力 101 kPa で 1 ～ 7 日間保存した後の WMC-MDP の検出能力を調査しました。 検出されるCRP、PCT、およびIL-6の濃度は、それぞれ10μg/ml、0.8ng/ml、および100pg/mlである。 シグナルは、同じ濃度のサンプルを検出した場合の WMC-MDP の明確な減少を示しません。 CRP、PCT、IL-6 の CV はそれぞれ 6.33%、5.77%、6.64% で、15% 未満です (追加ファイル 1: 図 S8)。 これは、WMC-MDP が試薬を安定して保管できることを示しています。

臨床診断における WMC-MDP の能力を検証するために 15 の血清サンプルを検出し、その結果を市販の ELISA キットと比較しました。 この正当化は、実際のアプリケーションにおける WMC-MDP の可能性を強調しています。 WMC-MDP の結果は、市販の ELISA キット (CRP、\(R^{2} = 0.93\)、PCT、\(R^{2} = 0.94\)、IL-6、\(R^ {2} = 0.98\)) (図 5a ～ f)。 3 人の健康なボランティアと 12 人の病気のボランティアからのサンプルの結果は、すべて臨床診断結果と一致しています。

WMC-MDP と市販の ELISA キットの間で、臨床サンプル中の CRP、PCT、および IL-6 の検出データを比較および分析します。 a および b CRP 検出用の WMC-MDP キットと ELISA キットの比較。 c および d PCT 検出用の WMC キットと ELISA キットの比較。 e および f IL-6 検出用の WMC-MDP キットと ELISA キットの比較。 g WMC-MDP によって検出された臨床サンプル中の CRP、PCT、IL-6 の分析。0 での対数変換なし。 h 感染症患者 12 名における CRP、PCT、および IL-6 の箱ひげ図。 CRP C 反応性タンパク質、PCT プロカルシトニン、IL-6 インターロイキン 6、WMC 波形マイクロ流体チップ、WMC-MDP 波形マイクロ流体チップ支援多重検出プラットフォーム、対数変換なしの化学発光を使用した WMC-CL 波形マイクロ流体チップ0時

合理的なプリセットと均一なカットオフ値により、臨床サンプルの分析が容易になります。 CRP、PCT、IL-6にはそれぞれ8μg/ml、0.5ng/ml、75pg/mlのカットオフ値を使用しました。 バイオマーカーの変化を視覚化するために、カットオフ値と比較したバイオマーカーの増加倍数を使用して、バイオマーカーの内容を示しました（図5g）。 患者 No. 9 と No. 15 の観点から見ると、患者の血液中の IL-6 レベルのみがカットオフ値より高いことがわかります。 感染の初期段階が原因である可能性があります。 血中の CRP レベルは感染後 6 ～ 8 時間後に上昇し始め、24 ～ 48 時間後にピークに達します。 PCT のレベルは 2 ～ 4 時間以内に上昇し、12 ～ 48 時間以内にプラトーに達しますが、IL-6 のレベルは急速に上昇しますが、半減期はわずか 1 時間です。 これは、IL-6 の検出のために患者が感染した直後にサンプルを収集する必要があることを示しています。 細菌、ウイルス、その他の病原体は感染症を引き起こす可能性があります。 PCT は細菌感染に対してのみ感受性がありますが、CRP はこの病原体に対して感受性がありません。 患者 No. 3 では IL-6 レベルが高く、CRP レベルはわずかに上昇しており、PCT レベルは正常です。 細菌ではなく、他の病原体によって引き起こされる場合もあります。 薬剤の使用により PCT が急速に低下する可能性もあり、患者の病歴に応じたさらなる診断が必要です。 患者 No.8 は、血液中の CRP および PCT の高レベルと、IL-6 の正常なレベルについて私たちの興味を引き起こしました。 これは、患者の感染症が重度ではなかったことと、半減期が短いために IL-6 レベルが低下しているのに対し、PCT と CRP は低下していないためである可能性があります。 箱ひげ図は、感染患者のバイオマーカーレベルの増加倍数が 1 未満である可能性があることを示しています (図 5h)。 これは、たとえ人が感染していても、特定のバイオマーカーの濃度が正常範囲内にある可能性があることを意味します。 上記の事例分析によれば、個々のバイオマーカーによる感染を正確に診断することは困難である。 CRP、PCT、IL-6 を多重検出することで、単一バイオマーカー分析の盲点領域を埋め、感染症を正確に診断できます。

WMC-MDP の全体的なパフォーマンスは、既存の成熟したテクノロジーと比較すると満足のいくものです。 これは、処理チャネル、マイクロミキサー、反応層材料、試薬保管庫などのモジュールの高度な設計と精密な製造によるものです。

3D プリンティングとマイクロ流体技術を組み合わせることで、チップの大量生産の新たな道が開かれます。 WMC-MDP のチャネル幅は 400 μm であり、射出成形よりも優れた製造精度を示します。 ただし、チャネル幅が50μm未満になると製造誤差が大幅に増加します。 さらに、PDMS は、光硬化 3D プリンティング技術を使用して製造されたモールドでは硬化することが困難です。 物理的な隔離や表面の改質によって問題は解決できますが、製造プロセスが複雑になります。 新しい材料と技術の改善により、3D プリンティングに基づいてマイクロ流体チップを製造するための有望な代替手段が提供される可能性があります。 マイクロミキサーはマイクロ流体チップで広く使用されています。 より短いチャネル内で流体を混合するために、トポロジーベースのマイクロミキサーが開発されています。 しかし、構造が複雑なため製造が困難です。 また、広範囲の Re での流体混合の要求を満たすことは困難です。 WMC-MDP の合理的な設計により、波形マイクロミキサーの占有スペースは最小限に抑えられます。 これにより、WMC-MDP はポータブルでありながら、複雑な戦場環境に適応できます。

インキュベーション時間を短縮しても、反応層の吸着能力が優れているため、感度は影響を受けません。 反応層の材料として一般的に使用されているアルミニウム膜の代わりにシリコン膜を採用しました。 シリコン膜はアルミニウム膜に比べてタンパク質の吸着能力が大幅に向上します。 シリコン膜は強力な吸着力と優れた可塑性により、検出信号を増幅することができます。 マイクロ流体チップにとって、試薬の保管は最も困難な問題の 1 つです。 WMC-MDP は試薬を 4 °C で 7 日以上維持できますが、このメソッドを市場での使用に適したものにするまでにはまだ長い道のりです。新しい凍結乾燥技術を使用するか、リザーバーの構造を改善することで軽減される可能性があります。 。

WMC-MDP に基づく多重検出の能力、検出の動作、時間、コスト、LOD を従来の検出方法と比較しました (表 1)。 WMC-MDP は、ELISA キット、蛍光免疫測定法、ECL 免疫測定法と比較して、操作、時間、コストの点で優れたパフォーマンスを示します。 IL-6 の LOD は蛍光イムノアッセイや ECL イムノアッセイよりも高いですが、依然として感染症の診断要件を満たしています。 さらに、WMC-MDP は 3 つのバイオマーカーの多重検出を実現できます。 それは臨床応用において実際的な意味を持ちます。 臨床サンプル分析における WMC-MDP のパフォーマンスは、感染症の迅速な診断と分類におけるその応用価値も検証しました。 WMC-MDP は、迅速性、低コスト、最小限の手動介入、および多重検出機能により、軍事指向の POCT の強力な候補となっています。

結論として、軍事シナリオでの感染を調査するために、CRP、PCT、および IL-6 を多重検出するための WMC-MDP を開発します。 検出用に抗原と抗体をあらかじめ混合しておくことにより、反応ステップが簡略化され、検出時間が短縮されます。 信頼性の高い製造プロセスと反応条件の最適化により、コストを削減しながら感度と特異性が向上します。 前処理により作業プロセスが簡素化されます。 WMC-MDP は、迅速性、コスト効率、使いやすさの利点により、従来の方法に代わる競争力のある代替手段となります。 WMC-MDP は、他の病原体を検出するための実行可能な方法を提供します。 WMC-MDP は感染を迅速に特定するための有望なツールであり、軍事化された POCT デバイスに開発される可能性を示しています。

現在の研究で使用されているデータと資料はすべて、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

ビオチン結合IL-6検出抗体

ウシ血清アルブミン

化学発光

コロナウイルス 病気 2019年

C反応性タンパク質

CRPの捕捉抗体

CRPの検出抗体

変動係数

電気化学発光

ヘマグルチニン 1 ノイラミニダーゼ 1

ホースラディッシュペルオキシダーゼ

インターロイキン-6

IL-6の捕捉抗体

検出限界

リン酸緩衝生理食塩水

リン酸緩衝生理食塩水 tween-20

プロカルシトニン

PCTの捕捉抗体

PCTの検出抗体

ポリジメチルシロキサン

注意する点

ポイントオブケア検査

レイノルズ数

ストレプトアビジン – ビオチン

SAと結合したHRP

並進型メカニカルバルブ

波形マイクロ流体チップ

波形マイクロ流体チップ支援多重検出プラットフォーム

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著者らは、3D プリンティングに関する技術サポートを提供してくださった SHINING 3D Technology Co., Ltd. (中国、揚州および杭州) に感謝します。

この研究は、中国国家自然科学財団 (81902167、52075138) および江蘇省自然科学財団 (BK20190872) の支援を受けました。

揚州大学機械工学部、揚州、225127、江蘇省、中国

ビン・フェン・イン、シン・フア・ワン、チャン・チェン・チェン、ASM ムフタシム・フアド・ソーハン

中国医科学アカデミー（CAMS）および北京連合医科大学基礎医学研究所生化学部門、北京、100005、中国

ヤン・ミンジュー

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BFY は研究を設計し、実験を実施し、資金を提供しました。 XHW はシミュレーションを実行し、実験データを分析し、原稿を作成しました。 MZY はメソッドを校正し、資金を提供しました。 CCQ はグラフを編集し、実験データを校正しました。 ASMMFS は原稿を改訂しました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

ビン・フォン・インへの対応。

人間の参加者が関与する研究は、揚州大学医科大学の倫理委員会によって審査され、承認されました（YXYLL-2020-89）。 すべての被験者は書面によるインフォームドコンセントを提供した。

適用できない。

著者らは、競合する利害関係が存在しないことを宣言します。

実際の波形マイクロ流体チップ (WMC) 支援多重検出プラットフォーム (WMC-MDP)。 図S2。 捕捉抗体ストリップを検出層にコーティングするプロセス。 図S3。 赤色のインクが流路内を流れます。 液体漏れがないことは、チップが合格であることを示します。 図S4。 WMC の透過率は 380 ～ 720 nm の範囲にあります。 図S5。 WMC-MDP における捕捉抗体の最適化。 図S6。 WMC-MDP における検出抗体の最適化。 図S7。 CRP、PCT、IL-6の再現性。 図S8。 CRP、PCT、IL-6の保存安定性。

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転載と許可

イン、BF.、ワン、XH.、ヤン、MZ. 他。 波形のマイクロ流体チップは、感染症の正確かつ迅速な診断のためのポイントオブケア検査を支援します。 Military Med Res 9、8 (2022)。 https://doi.org/10.1186/s40779-022-00368-1

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受信日: 2021 年 8 月 19 日

受理日: 2022 年 1 月 26 日

公開日: 2022 年 2 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s40779-022-00368-1

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