タンパク質からの微多孔性機能性生体材料のバイオプリンティング

Oct 11, 2023

Nature Communications volume 14、記事番号: 322 (2023) この記事を引用

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生体材料は、材料科学と生物学を結び付けて、新しい機能を備えた生体システムのエンジニアリングと強化を可能にします。 バイオプリンティングは、柔らかい材料への細胞のプログラム可能な堆積を通じて、このような複雑な材料の形成を正確に制御できると期待されていますが、現在のアプローチでは、堅牢な巨視的形態を生成しながら細胞の微小環境を微調整するという点での成功は限られていました。 ここでは、さらなる処理のために構造シェルから細胞の微小環境を分離するコアシェルマイクロゲルインクの使用を通じて、この課題に取り組みます。 細胞は、微生物集団と哺乳動物の細胞スフェロイドの両方の形成を促進できる粘性コアにマイクロ流体的に固定され、その後粒子間アニーリングにより、微小多孔性が制御された共有結合で安定化された機能的足場が得られます。 結果は、コアシェル戦略が細胞培養に好ましい環境を提供しながら細胞漏出を軽減することを示しています。 さらに、さまざまな微生物コンソーシアムをさまざまな用途の足場に印刷できることを実証します。 微生物コンソーシアムを別々のミクロゲルに区画化することにより、足場の集合的なバイオプロセシング能力が大幅に強化され、生物プロセシング能力を備えた生体材料を増強する戦略に光が当てられます。

生体材料は、生体細胞を非生体コンポーネントに組み込んだ複雑な材料です1、2。 構成細胞との相互作用の性質に応じて、そのような材料は、足場機能を提供する生体不活性媒体 3,4,5,6,7 から、細胞の挙動を指示できる細胞指示生体材料 8,9,10 まで多岐にわたります。バイオフィルムの自然な形成を模倣する細胞によって生成される遺伝的にプログラム可能なマトリックス11、12、13、14、15。 このような複合材料の機能は、主に埋め込まれた細胞に由来します。 したがって、材料は常に細胞の成長と適切な機能に対応する必要があります。 ただし、最終構造が取り扱い、配送、保存、再利用でき、細胞を保護できる物理的形状を提供するための機能要件により、巨視的な材料特性には通常、強い制約があります。 材料と生物学の相乗効果は、細胞プロセスに関する私たちの理解を劇的に変えただけでなく 16、再生医療のための細胞の治療的送達 17,18,19 からオンデマンドでの細胞送達まで、無数の応用に向けて生体システムを設計する能力を私たちにもたらしました。微生物によるバイオプロセスによる高価値化学物質の生産6,7。

細胞の空間分布の操作は、生体材料の分野で最も求められている機能の 1 つです。 バイオプリンティングは、その多用途性と多くの細胞に優しい柔らかい材料との互換性により、おそらく最も注目を集めています 20,21。 例えば、バイオプリンティングにより、生物活性ヒドロゲル内に哺乳類細胞をプログラム可能に堆積させて、天然組織の複雑さと不均一性をよりよく再現する 3D 生物学的構築物を作成できます 22,23,24,25。これは、生物医学において多大な翻訳的価値を持っています。 バイオプリンティング微生物も、動的な細菌群集 26 の理解を深め、バイオプロセシング強化のための洞察を与えるため、近年応用が増加しています 3,4,5,6。 しかし、現在のバイオプリンティングルーチンは、バイオインクの固有の機械的およびレオロジー特性を細胞の微小環境から適切に切り離すことができないため、材料の製造性の向上のために細胞への適合性を犠牲にすることがよくあります27,28。 さらに、異なる細胞コミュニティ間の強力な相互作用を確立するために、明確に定義された細胞ニッチを備えた任意の巨視的材料形態を構築することは依然として課題です20、21、29。

ここでは、この課題に対処する方法を提案します。 この研究では、バイオプリンティングと機能性生体材料の界面における細胞を含んだコアシェルミクロゲルの適用可能性を調査します。 ゼラチン/ゼラチンメタクリロイル (gelMA) とカルボキシメチルセルロース (CMC)30 の間の水性二相系に基づいて、粘性コア相に細胞がカプセル化されたコアシェルミクロゲルが製造され、ハイドロゲルシェルは二重ネットワーク戦略を可能にします。互いに共有結合して微多孔性 PAM (タンパク質ベースのアニーリング マイクロゲル) 足場を形成します。 さらに、バイオプロセシングに向けて、押出バイオプリンティング 29,31 を介して、微小流体で調整可能なビルディング ブロックと巨視的生体材料の機能を橋渡しします。 我々は、コアシェルミクロゲルが微生物集団と哺乳動物の細胞スフェロイドの両方の成長をサポートすることを示します。 さらに重要なことは、非コアシェル型マイクロゲルと比較して、コアシェル型ミクロゲルは培地への細胞漏出を減少させると同時に、そのような材料のバイオプロセシング能力を増強できることである。 最後に、我々は、局所的に異なる特性、すなわち、個別のミクロゲル内に不均一に分布し空間的に分離された細胞集団を有する足場を作製することにより、生物活性の大幅な増強が2つの典型的な微生物コンソーシアムモデルで観察されることを実証する。 私たちは、私たちの方法が次世代の生体材料を構築するための一般化可能な戦略を提供し、微生物バイオプロセスだけでなく高度なバイオファブリケーションにおいても有望であると信じています。

私たちは、生体材料を構築するために、動物由来であり、広く入手可能であるため 32、さまざまな生物学的用途で長い間使用されてきたコラーゲン由来の材料であるゼラチンから開始しました (図 1)。 デュアルネットワークを実現するために、まずゼラチンをその光架橋性誘導体である gelMA とブレンドし、0.5% の青色光光開始剤であるフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム (LAP) を添加した均質な 15% ヒドロゲル前駆体溶液を生成しました。 GelMA は、確立されたプロトコル 33 に従って合成され、NMR による推定官能化度は 50% でした (補足図 1)。 分散相はマイクロ流体フローフォーカシングデバイスで乳化され、10 U/ml トランスグルタミナーゼをスパイクした 1% カルボキシメチルセルロース (CMC) の溶液がデバイス接合部でヒドロゲル形成溶液に隣接し、分散相は一緒にキャリアオイル（0.1％ピコサーフ界面活性剤を含むNovec 7500）を使用して液滴を生成します（補足図2）。 ヒドロゲル前駆体、CMC、オイルの流量はそれぞれ 8、2、40 µL/min で、直径 ~165 µm (分散係数、CV = 2.2%) および CMC コア ~90 の単分散性の高いコアシェル液滴が得られました。 μm (CV = 7.4%)。 マイクロ流体工学により、シェルの厚さを制御できました（図1b）。 液滴を室温で一晩硬化させて、CMCコアからシェル相へのトランスグルタミナーゼの拡散を可能にし、その後、グルタミンとリジンの間のイソペプチド結合、ひいては最初の共有ネットワークの形成を触媒した。 マイクロゲルを解乳化した後、0.5% LAP を含むリン酸緩衝液 (PBS) と 4:1 の体積比で直接混合して、満足のいく印刷適性をもたらしました。 押し出し 3D プリンターを使用すると、詰まったミクロゲルを巨視的な足場にパターン化できます。 最後に、405 nmの青色光によりミクロゲル間の2回目の架橋が開始され、ピンセットで容易に扱えるほど機械的に硬い共有結合的に安定化されたPAM足場が生成され（図1c）、PBS中で3日間インキュベートした後でも構造的完全性を維持できます（補足ビデオ 1)。 注目すべきことに、二重共有結合戦略は可逆的である。つまり、液滴は最初に青色光照射によって硬化され、次に酵素によってアニーリングされることができる。

PAM足場の形成の概略図。 まず、LAP 含有ゼラチン/gelMA ポリマーブレンドは、トランスグルタミナーゼをスパイクした細胞含有 CMC 溶液とともに、フローフォーカシングマイクロ流体デバイス内でキャリアオイルによって液滴に乳化されます。 次に、液滴は酵素反応によってミクロゲルに変換され、その後押し出されて足場にパターン化されます。 最後に、青色光は、詰まったミクロゲル間で 2 回目の共有結合架橋を開始し、PAM 足場を形成します。 b マイクロ流体工学により、コアシェル比を制御できます。 ヒドロゲル前駆体溶液 (シェル相) とキャリアオイルの流量はそれぞれ 8 および 40 μL/min に制御され、CMC (コア相) の流量は 1、2、および 3 μL/min です。コアサイズはそれぞれ、中、大、n = 50 ミクロゲルを 1 回の実験で分析しました。 c 印刷された PAM 足場と顕微鏡写真は、交差した 2 つのフィラメントの局所的な拡大を示しています。 データは平均値 ± 標準偏差として表示され、ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

SEM（走査型電子顕微鏡）画像は、ビルディングブロックのコアシェル形態（補足図3b）と、二重ネットワーク化されたPAM足場がマルチスケールの多孔性を有することを示しています（補足図3a-c）。 ミクロゲルの表面には、高含水材料としてのヒドロゲルの特徴であるナノ細孔がありました（補足図3a）。 凍結乾燥したPAM足場の伸長メッシュ形態によって証明されるように、ミクロゲルのパッキングにより微小孔が生じました34（補足図3c）。 ミクロゲルのサイズがマクロスケールで足場の物理的特性にどのように影響するかをさらに調査するために、トリプシン溶液を構造に浸透させることによって異なるサイズのミクロゲルから組み立てられたPAM足場の分解速度論を研究しました（補足図4a）。二重架橋バルクヒドロゲルとアニールされていないミクロゲル。 速度論プロファイル（補足図4b）は、ミクロゲルのサイズに関係なく、すべてのPAM足場の分解が、足場へのトリプシン溶液の浸透を促進する微小孔の存在により、バルクヒドロゲルよりも高い速度を示したことを示しています。 さらに、ミクロゲルのサイズが小さいほど分解は遅くなる傾向がありました。これはおそらく細孔サイズの減少が原因であり 19、したがってパーコレーションが遅くなったためです（補足図4b）。

マイクロゲルは、押出印刷によって 3D 構造を製造するためのインクの一種として最近登場しました 29、31、34、35、36、37。 詰まった状態では、摩擦などの物理的相互作用を通じて弾性固体として動作する静止構造を形成できます。 せん断すると粒子間の摩擦が消散し、インクが流れるようになります。 そのため、ミクロゲルに成形できる材料は、理論的には、ポリマー化学に関係なく、押出成形によって印刷可能です 29,31。 このコアシェル マイクロゲル インクの印刷適性を定量的に評価するために、最初にレオロジー特性評価を実行しました。 詰まったミクロゲルは剪断減粘挙動を示し（図２ａ）、除去すると歪みから迅速に回復することができた（図２ｂ）。 まとめると、この特定のレオロジー挙動は、インクが剪断されたときに流れる液体からノズルを出るときに弾性のある固体に急速に変形する能力に変換できます。 ひずみスイープ実験は、ミクロゲルインクが約 30% のひずみで降伏したことを示しています (補足図 5a)。 粒子間アニーリング後、貯蔵弾性率と損失弾性率の両方が大幅に増加し（図2c）、降伏応力は約6倍の増加を示し（補足図5b）、機械的強度が向上したPAM足場が得られました。 さらに、逆デュアルネットワーク戦略を備えたインクは、同様のレオロジー特性のセットを共有しました（補足図5c〜f）。

a – c マイクロゲルインクのレオロジー特性評価。 マイクロゲルは酵素によって硬化されます。 せん断速度スイープ実験。 せん断速度は 0 ～ 10 1/s。 ひずみ1%。 b ステップひずみスイープ。低ひずみ (1%) と高ひずみ (90%) が 100 秒ごとに繰り返されます。 周波数1Hz。 c 光開始アニーリング前後の貯蔵弾性率と損失弾性率、n = 3 の独立したレオロジー特性評価。 ***p = 0.00022、** p = 0.0031、対応のない両側スチューデントの t 検定。 d 異なるサイズのノズルから印刷された押し出されたフィラメントの蛍光画像。 挿入図は、フィラメントの湾曲したコーナーを示しています。 e フィラメント直径の分析。 色付きのバーは印刷ノズルの内径を表し、空白のバーは印刷されたフィラメントの測定された直径です。1 回の実験で n = 3 個の独立して印刷されたフィラメントです。 f 足場、すなわち、(i) 緑色および (ii) 赤色の均一な足場、(iii) 巨視的に不均一な足場、および (iv) 顕微鏡的に不均一な足場の蛍光画像。 d、f 蛍光ミクロゲルは、ゼラチンと蛍光標識されたgelMAの混合物から生成されます。 データは平均値 ± 標準偏差として表示され、ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

次に、印刷の忠実性をテストしました。 異なる内径のノズルを使用して足場をパターン化すると、フィラメントはすべて均一な厚さを示し、顕著な平坦化は見られませんでした（図2d）。さもなければ固体表面と接触する際の表面張力の影響を受けます。 その結果、フィラメントの直径は印刷ノズルに忠実であり、20 G、21 G、および22 Gのノズルを使用すると、エッジのギザギザが増加したためわずかに小さくなりました（図2e）。 次に、市販の押出成形 3D プリンターとミクロゲル インクの互換性をテストしました (補足図 6a および補足ビデオ 2)。 印刷適性が最適化されたマイクロゲル インクが、3 軸機械ロボット アームと結合された分散カートリッジに充填されました。 ミクロゲルインクの押し出しと書き込み速度は、それぞれ空気圧とロボットアームによって制御されました。 フィラメントの厚さが押し出しとフィラメントの融合による書き込み速度の両方によって制御できる連続材料ベースの押し出し印刷とは異なり、印刷されたミクロゲルインクの厚さは速度にはほとんど依存せず、ノズルのサイズには依存しないことがわかりました。より弾力的な動作が可能になります。 したがって、速度が一致しないと、フィラメントの切断（押し出し<書き込み）または望ましくないフィラメントの蓄積（押し出し>書き込み、補足図6b）のいずれかが発生します。 その結果、インクの押し出しと書き込みの速度を一致させることで、ミクロゲルインクをさまざまな事前定義された形状（補足図6a）および多層構造にパターン化することができました。 均質な構造（図２ｆｉおよびｉｉ）に加えて、異なる特性を有するミクロゲルの集団を単に混合することによって、不均質な構造（図２ｆ、ｉｉｉ、およびｉｖ）を作製することもできる。

押出バイオプリンティングにおける主要な課題の 1 つは、材料固有の機械的特徴、つまりレオロジー プロファイルと最終的な特性として、材料の機械的特性、材料の製造性、および細胞培養への適合性のバランスをどのように取るかということです 21,27,28。材料の剛性は印刷性能を決定するだけでなく 20,39 だけでなく、さらに重要なことに、細胞の挙動に悪影響を与える可能性もあります 40,41。 この課題に対処するために、我々はコアシェル戦略を利用して、相分離を通じて材料処理 (シェル相) を細胞培養 (コア相) から分離します 30。 コア材料である CMC は、細胞培養や組織工学の足場として使用されています 42、43。 コア材料のレオロジー特性評価は、CMC溶液が粘度に傾いていることを示しています（補足図5g、i）。 次に、コアシェル以外の構成要素とは対照的に、このような粘性環境における微生物の増殖を調査しました（図3）。 大腸菌を硬化したミクロゲル中で 24 時間増殖させました。 コアシェルミクロゲルでは、細胞増殖はかなりの程度まで物理的に制限されており、その結果、コア内に細菌集団が集中していました（図3a）。 まったく対照的に、非コアシェルミクロゲル内の細菌は局所的に増殖し、最近報告されたものと同様の丸い散発的なマイクロコロニーを形成しました（図 3b）。 さらに、このような空間的閉じ込めにより、細菌が環境に逃げるのをより効果的に抑制できることも視覚的に発見しました（補足図7a）。 さらに、希釈プレーティング実験（補足図7b）によって結果を確認しました。これは、非コアシェルミクロゲルの上清のコロニー形成単位（CFU）がコアシェルのものよりも2桁高いことを示しています。 24時間にわたるミクロゲル（補足図7c）。 細胞の漏出は、バイオプロセシング用の生体材料の分野で未解決の課題となっているため6,7,45、特に遺伝子組み換え微生物が関与しており、漏洩する危険性がない場合には、コアシェルミクロゲルの使用は、この問題を解決する戦略を提供する可能性がある46。 さらに、微生物は、隣接するミクロゲル間の顕著な相互汚染なしに、同様の方法で PAM 足場内で増殖する可能性があります（補足図 8）。

左パネル：コアシェルおよび非コアシェルミクロゲル中のGFP大腸菌（大腸菌）。 右パネル: コアシェルミクロゲルにおける HEK 293 T 細胞スフェロイドの形成と特性評価。 a GFP 大腸菌の増殖。 コアシェルミクロゲルの中にあります。 細胞の増殖は粘性のあるミクロゲルのコア内に閉じ込められます。 b 大腸菌の増殖。 非コアシェルミクロゲルの場合。 大腸菌は局所的に増殖して目に見える微小コロニーを形成します。 青と白の破線は、それぞれミクロゲルと CMC コアの輪郭を示します。 c 多細胞スフェロイドの形成の概略図。 空間的閉じ込めにより、細胞は 3 次元すべてで相互作用して、階層構造を特徴とする多細胞スフェロイドを形成します。 d 3日目から6日目までのHEK 293 Tスフェロイドの増殖。スフェロイドの円形度と面積によって定量化されます。 データは最小値/最大値を含む平均値として表され、同じ実験における n = 107 スフェロイド (3 日目)、n = 248 スフェロイド (6 日目) です。 **p = 0.0019、****p < 1E-15、対応のない両側スチューデント t 検定。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 e 0 日目、3 日目、6 日目の細胞を含むミク​​ロゲルの生/死染色。生細胞 (緑) と死細胞 (赤) は、カルセイン アセトキシメチル (カルセイン AM) とエチジウム ホモダイマー-1 (EthD-1) で染色されます。 ）、 それぞれ。 f HEK 293 T スフェロイドの細胞骨格構造。 (i) HEK 293 T スフェロイドの明視野画像、および (ii) その共焦点顕微鏡画像。 (iii) 単層培養からの HEK 293 T の細胞骨格構造。 F-アクチンと核は、それぞれファロイジンと 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) で染色されます。 共焦点蛍光顕微鏡写真は、異なる垂直位置での断面画像からレンダリングされます（補足図10）。

哺乳動物細胞培養へのコアシェルミクロゲルの適用性も特徴付けられました（図3c〜f）。 ミクロゲルへの細胞の送達はポアソン分布に従いました（補足図9）。 同様に、細胞は空間的に閉じ込められ、ミクロゲルコア内であらゆる次元で増殖および相互作用して、自己集合して高細胞密度の回転楕円体を形成しました（図3c）。 ヒト胎児腎臓（HEK）293 T細胞は、コアシェルミクロゲル中で3日後に細胞スフェロイドに発達し（図3e）、そのほとんどは高い円形度（0.8より高い、図3d）を示しました。 生死染色で証明されたように、3 日目から 6 日目まで、スフェロイドのサイズは 80% 増加し (図 3d)、高い生存率を維持しました (図 3e)。 さらに、HEK 293 T スフェロイドの細胞骨格は、皮質アクチンの網目構造に囲まれた高密度に詰まった核で構成されており（図 3f、ii、および補足図 10）、単層ベースとは対照的に、細胞間相互作用の優位性を典型的に示しています。細胞培養では、アクチンが細胞質繊維に組織化されました47（図3f、iii）。 結論として、HEK 293 T は、高い細胞生存率を備えたコアシェル ミクロゲル内によ​​く構造化された細胞スフェロイドを形成することができ、高密度細胞密度構造をバイオファブリケーションするための構成要素として将来の応用の可能性を示しています。

プリンティング微生物はバイオプリンティング48の新たなフロンティアであり、センシング49、バイオマニュファクチャリング6、バイオレメディエーション3,7などの幅広い用途が見出されている、明確に定義された形状と特性を備えた機能的な生体材料を作成するための多用途ツールを提供します。 次に、コアシェルミクロゲルをバイオインクとして使用して、バイオプロセシング用の機能的な生きた足場を印刷しました（図4a）。 私たちは、嫌気的にグルコースをエタノールに変換するための天然サッカロミセス・セレビシエ発酵システムから始めました3,4,5。 酵母を含むコアシェルミクロゲルをアニーリングしたPAM足場にプリントし（図4b）、発酵のために無酸素環境で酵母抽出ペプトンデキストロース（YPD）培地に浸しました。 この研究で使用したすべての酵母を含むコアシェルミクロゲル足場では、エタノール生産はYPD培地に浸した2時間後に始まり始め、12時間で指数関数的に増加しました（図4e）。 まず、ビルディングブロックの物理的特性が印刷された足場のバイオプロセッシング能力にどのような影響を与えるかを調査しました。 コア相の流量のみを調整することにより、同じ全体サイズ (コアシェル A および B: それぞれ 156 ± 3.2 μm および 154 ± 2.0 μm) のコアシェル ミクロゲルが、さまざまなコア サイズ (84 ± 8.2 μm) で生成されました。それぞれμmと56±2.1μm（図4c、d）、したがってセルの負荷に不一致があります。 培地中のエタノール生成の動態を調べたところ（図4e）、コアが大きいほど（コアシェルA）、細胞負荷が高いため、エタノールの生成がより迅速になることがわかりました。 次に、コアシェルミクロゲルのサイズが発酵に違いを引き起こすかどうかを調べました。 バイオプロセシングのパフォーマンスから細胞負荷の要因を分離するために、コアシェルミクロゲル B の製造に使用される分散相 (コアとシェルの両方) の流動プロファイルは一定に保たれましたが、より小さい流量でキャリアオイルの流量を増加させました。液滴マイクロ流体デバイス（補足図11a）、コアとシェル材料の間の体積比が変更されていない、より小さなコアシェルマイクロゲル（コアシェルC、全体95±3.2μm、コア34±1.7μm）が生成されます（図11a）。 .4d）。 したがって、同じ重さの足場を印刷することにより、ビルディング ブロックのサイズに関係なく、初期の細胞負荷が近くなります。 足場に固定化された同量の酵母細胞では、コアシェルミクロゲルのサイズは発酵プロセスに大きな影響を及ぼさないことがわかりました（図4e）。これは足場内の微細孔の存在によるものと考えられます。拡散長が比較的短く 34 、細胞への/細胞からの小分子の送達を著しく妨げませんでした。 最後に、比較のために非コアシェルミクロゲル（150±3.0μm）も生成され、そこからプリントされた足場によるエタノールのかなり遅れた生産が観察されました（図4e）。これはおそらく、環境内での酵母の増殖の抑制が原因であると考えられます。高度に化学的に架橋されたヒドロゲルネットワークが細胞増殖を遅らせた44。 ただし、コアシェル PAM 足場からのエンドポイントのエタノール生産（20 時間）がわずかに低いこともわかりました（補足図 11b）。これは、非コアシェル PAM 足場のより顕著な細胞漏出に起因すると考えられます。 （補足図11c）これにより、エタノール生産が増加しました。

機能的な生体足場の作製の概略図。 微生物を含んだコアシェルミクロゲルは、液滴マイクロフルイディクスによって生成され、バイオプロセスに使用されるアニールされた足場にプリントされます。微生物は、培地中の基質を生成物に変換する全細胞生体触媒として機能します。 b さまざまなサイズのコアシェル ミクロゲルと非コアシェル ミクロゲルの顕微鏡写真。 c bのコアシェルミクロゲルと非コアシェルミクロゲルのサイズ分布、1回の実験におけるn = 20のミクロゲル。 d コアシェルミクロゲルのコア相とシェル相の体積比。 コアシェル ミクロゲル A は全体のサイズは B と同様ですが、より大きなコアを持っています。 コアシェル マイクロゲル B と C は全体のサイズが異なりますが、バイオプリンティングで同等の細胞負荷を維持するために同じコア/シェル比を持っています。1 回の実験で n = 20 マイクロゲル、****p < 1E-10、ns (有意ではない) = 0.74、対応のない両側スチューデントの t 検定。 e 無酸素環境での 12 時間にわたる酵母からのエタノールの生産。これは足場の重量によって正規化されています。n = 3 の独立した生物学的実験。 データは平均値 ± 標準偏差として表示され、ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

次に、我々はその応用を微生物コンソーシアムに基づくバイオプロセシングに拡張しました6。 相互接続されたコアシェルマイクロゲルを通じて、PAM足場は制御可能な多孔性だけでなく、複数の種のコミュニティを別々のミクロゲルに分離する機能も備えています（図5a）。これにより、足場と環境の間で栄養素と代謝物のより効率的な移動が行われます。競争的な成長を妨げながら、種を相互作用させることもできます。 次に、この方法がコンソーシアムの直接混合と比較して、空間的な分業を通じて固定化された微生物コンソーシアムの生物活性を強化できるかどうかを調べました（図5b）。 まず、光独立栄養性のクロレラ・ブルガリスと好気性の枯草菌からなる微細藻類-細菌系（図5c）について、メチルオレンジ3,50およびアモキシシリン51をバイオレメディエートする能力を研究しました。 この微生物コンソーシアムでは、微細藻類は細菌が呼吸するための光合成を通じて酸素を生成しながら、細菌から放出された二酸化炭素を炭素源に固定し（図5c）、そのため両方の微生物の成長に相互に利益をもたらすことでバイオレメディエーション能力を向上させます52,53。 まず、バイオレメディエーションプロセスを実証するために、コンソーシアムを別々のミクロゲルに固定化する不均一なPAM足場を作製し、メチルオレンジまたはアモキシシリンを含む合成廃水に浸漬しました（補足図12a）。 アモキシシリン (300 mg/L) の 90% 以上が 24 時間で除去され、メチル オレンジ (100 mg/L) の場合は約 15% が除去されました。 このような空間分離戦略がバイオレメディエーションを増強するかどうかを調べるために、コンソーシアムが同じミクロゲル内にカプセル化された均一な足場と、それぞれ微細藻類と細菌の単一培養物を固定化した足場をテストしました。 結果（図5d）は、固定化された両方の単一微生物集団が24時間にわたって同様の有効性でメチルオレンジを除去できたことを示していますが、両方の微生物の細胞負荷が半分であるにもかかわらず、均質な足場はバイオレメディエーションにおいてより効率的であり、相乗効果を示唆しています。コンソーシアム。 さらに重要なことに、不均一な足場はメチルオレンジを大幅に多く修復し（図5d）、バイオプロセシング能力の向上を示しています。 ただし、48時間後には、不均一な足場がすべて分解され、液化したことも観察しました（補足図13a）。これは、濃度が48時間で時間の経過とともに増加した微生物プロテアーゼによる足場の加水分解によって引き起こされました（補足図13a）。 12b)。 私たちは、この現象をコンソーシアムの微生物の生物活性の追加の定性的尺度として利用しようとしました（図5e）。 以前とまったく同じ配置の 4 つの PAM 足場を作製し、BG11 培地に浸漬しました（図 5e および補足図 13b）。 私たちは再び同様のパターンを観察しました。微細藻類を固定している足場は 24 時間後に分解し始めましたが、栄養欠乏培地は枯草菌の増殖には不利であるため、細菌が存在する足場は 72 時間にわたってその構造をほとんど保持していました。 24時間以内に、不均質な足場はより小さな断片に崩壊し始めましたが、均質な足場は3日目まで構造的完全性を維持しました（補足図13c）。

PAM足場は、微視的空間で微生物群集を固定化して分離し、種間での代謝産物のより効率的な物質移動を可能にしながら、競合的な増殖を防ぎます。 円と三角形は微生物によって分泌される代謝産物を表します。 b 細胞を含んだコアシェルミクロゲルが足場に詰まり、プリントされます。 不均一および均一な足場は、それぞれ 2 つの異なる微生物種を含むミク​​ロゲルの混合集団、および 2 つの微生物の混合物を含むミク​​ロゲルの均一な集団として定義されます。 c–e 微生物コンソーシアムの相利共生モデル。 c クロレラ・ブルガリスと枯草菌の関係を示す模式図。 d 不均一足場、均質足場、微細藻類と細菌の単一培養物を固定化する足場によるメチルオレンジのバイオレメディエーション、それぞれn = 3の独立した生物学的実験。 e 72時間での足場崩壊の特性評価。 閉じたシンボルは壊れていない足場を示しますが、開いたシンボルは足場が著しく崩壊していることを示します。 すべての実験において、足場は周期的に 12:12 時間の明暗条件にさらされ、25 °C でインキュベートされます。 f–h 微生物コンソーシアムの競争的増殖モデル。 f グルコースから 2-PE を生成するための、遺伝子操作された大腸菌およびメイエロズマ・ギリエモンディの合成微生物コンソーシアム60。 過剰発現した遺伝子は赤色でマークされます。 交差遺伝子 tyrA がノックアウトされます。 g 6 日間にわたる不均一な足場からの 2-PE の生産。これはそれぞれの足場重量によって正規化されています。n = 3 の独立した生物学的実験。 h 3 日間にわたる正規化 2-PE 生産に関するバイオプロセシングの比較、n = 3 の独立した生物学的実験。 *p = 0.021、ns = 0.069、対応のない両側スチューデントの t 検定。 どちらの足場でも、生産量は対応する足場の重量によって正規化されます。 液体培養の場合、CMC を含むコンソーシアムは培地に直接接種され、その細胞負荷は足場と同じであり、2-PE 生産は不均一および均質を組み合わせた平均足場重量に正規化されます。 データは平均値 ± 標準偏差として表示され、ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

最後に、グルコースを発酵させて2-フェニルエタノール（2-PE）にする合成真菌-細菌コンソーシアムをテストしました（図5f）。 この酵素カスケード（図5fおよび補足図14）では、炭素源は最初に大腸菌によって中間体のl-フェニルアラニンに変換され、その後、酵母の一種であるメイエロズマ・ギリエルモンディによってさらに代謝されて2-PEになります。高濃度の 2-PE5460 を生成し、許容します。 どちらの微生物も炭素源としてグルコースを利用するため、競合関係を形成します。 2 つの微生物が単純に混合される液体培養では、最初の接種率に関係なく、M. guilliermondii が 96 時間にわたって常に優勢種になります (補足図 15)。 コンソーシアムを含む足場からの 2-PE のバイオ製造プロセスを特徴付けるために、我々は最初に合成培地中の不均一足場を使用した 2-PE 生産の動態を測定しました。 大腸菌またはM.ギリエモンディをそれぞれカプセル化したミクロゲルの混合集団を足場に作製し、培地中でインキュベートしてグルコースを2-PEに発酵させました（補足図16）。 結果は (図 5g)、発酵 2 日目あたりにピークに達し、発酵 3 日後には徐々に横ばいになる S 字動態を示しています。 次に、2 つの異なる足場セット間で 2-PE の収量を比較しました (図 5h)。 注目すべきことに、不均一な足場を含む発酵ブロスからは、3 日間で均質な対応物よりも 6 倍を超える高い 2-PE 濃度が検出されました。 また、液体培養と比較して均質な足場からの2-PEがより多く存在することもわかりました（図5h）。これはおそらく、ミクロゲル内での増殖の閉じ込めによってもたらされた2つの微生物のより緊密な物理的接触に起因すると考えられます。 最後に、2-PE バッチ生産のための足場の再利用性を調べました (補足図 16)。 足場は最初のバッチ (3 日間) の間、完全性を維持できました。 その後徐々に構造が崩壊したにもかかわらず、連続 4 回のバッチ処理 (合計 12 日間) の後でも足場は完全には損傷しませんでした。 ただし、2-PEの生産は大幅に減少し（補足図16g）、特に不均一足場の場合、第2バッチでは70％減少したが、均質足場では20％減少した。 両方の足場の 2-PE 生産はバッチごとに悪化し、3 番目のバッチ後にはほぼ完全に停止しました。 それにもかかわらず、不均一な足場は依然としてより多くの2-PEを生成しました（補足図16g）。 足場の性能の低下は、バッチ間の新鮮な培地で細胞を完全に洗い流すことができなかったため、2 つの微生物種の成長バランスを崩す細胞の脱出と足場の内面への再付着によって引き起こされる可能性があります。

まとめると、ここで紹介する研究は、一般的な押出バイオプリンティング ルーチンを介して生きた材料を構築するためのアプローチを説明しています。 ミクロゲルデュアルネットワーク法により、共有結合的に安定化された巨視的機能性生体材料を印刷し、バイオレメディエーションやバイオマニュファクチャリングに容易に展開できます。 我々はコアシェルマイクロゲルを構成要素として使用し、細胞漏出は避けられないにもかかわらず6,7、そのような戦略は非コアシェルマイクロゲルと比較してこの問題を軽減できることを発見しました。 さらに、酵母単培養モデルを使用すると、非コアシェル ミクロゲル足場では著しく抑制されたエタノール生産が観察され、これは細胞培養に対するコアシェル ミクロゲルのより適切な適合性を示唆しています。 さらに、微生物を含んだミクロゲルを使用して細胞コミュニティを空間的に組織化し、そこから細胞の不均一な分布を確立して、押出プリンティングによるプログラム可能な形態の生成の中で微生物コンソーシアムの種間コミュニケーションを促進することができます。 我々の結果は、2 つの異なる微生物コンソーシアムによる生物活性が著しく向上していることを示しています。 タンパク質ベースの材料は、プロテアーゼ加水分解を受けやすいため、微生物の用途には最適な選択ではないかもしれませんが、そのような用途には、より機械的に堅牢な材料を使用する将来の取り組みを想定しています。 また、コアシェルミクロゲルが哺乳動物の細胞スフェロイドを培養できることも示しています 61。 液滴マイクロ流体工学およびミクロゲルのデュアルネットワーク戦略と組み合わせることで、これらは高細胞密度構造を構築するための構成要素として利用されることが期待されています。 結論として、我々は、我々が提案した方法は、微生物バイオプロセスのための機能的生体材料を構築するための貴重なパラダイムを表しており、高度なバイオファブリケーションの可能性も秘めていると信じています55。

ゼラチンメタクリロイル (gelMA) は、公開されているプロトコルに従って合成されました 33。 ブタ皮膚由来のゼラチン (Shanghai Aladdin Biochemical Technology) を 50 °C で脱イオン水に最終濃度 10% になるまで溶解しました (w/v、濃度はすべて w/v で示されるか、別の方法で表記されます)。 ゼラチン１ｇ当たり０．６ｇのメタクリル酸無水物（上海マックリン生化学）を均一なゼラチン溶液に滴下した。 反応を50℃で1時間行い、2倍量の予熱した脱イオン水を加えて反応を停止させ、その後混合物を3500×gで3分間遠心分離した。 上清をデカントし、分子量カットオフ 12 kDa の透析チューブを使用して 30 °C で脱イオン水に対して 7 日間透析しました。 透析後、gelMA の酸性溶液を pH = 7.4 に調整し、液体窒素で瞬間凍結し、完全に水和して多孔質の白い泡になるまで凍結乾燥しました。 ゼラチンの修飾は 1 H 核磁気共鳴 (NMR) によって確認されました。 ゼラチンとgelMAを酸化重水素に溶解し、単軸勾配逆プローブを備えたBruker Avance III HD分光計を使用して周波数400 MHzでスペクトル（補足図1）を収集しました。 官能化度（DoF）を推定するために、統合されたリジンメチレンプロトンシグナルはスペクトル内のそれぞれの芳香族プロトンシグナルによって正規化され（補足図1）、gelMAのDoFは次のように計算されました。

マイクロ流体デバイスは、標準的なソフト リソグラフィー プロトコル 56 によって製造されました。 簡単に説明すると、SU-8 ネガ フォトレジスト (カヤク アドバンスト マテリアルズ) をシリコン ウェーハ上にスピン コーティングし、ホットプレート上で 95 °C でソフトベークしました。 次に、定義されたデバイスの形状を備えたフォトマスクをウェハの上に置き、平行紫外光 (URE-2000/35 L、中国科学院光学電子研究所) で露光して、描画されたチャネル領域を硬化し、ポストベークを行いました。 95℃でSU-8現像（SU-8現像液、カヤク先端材料）。 ポリジメチルシロキサン (PDMS) ベースのマイクロ流体デバイスは、ソフト リソグラフィーによって作製されました。 PDMS エラストマー (DOWSILTM Sylgard 184 キット) を硬化剤と 10:1 (w/w) の比率で混合した後、ペトリ皿内の現像されたマスター上に注ぎました。 次に、未硬化の PDMS を脱気し、65 °C でインキュベートして固化させました。 その後、デバイスチャネルを備えた PDMS を切り出し、そこから入口と出口に 0.75 mm の穴を開けました。 次に、デバイスとスライドガラスを 1 分間プラズマ処理し (PDC-002-HP、Harrick Plasma)、相互に接着し、65 °C で 10 分間ベークしました。 チャネルの疎水性修飾では、デバイスのチャネルを 1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチルトリエトキシシラン (Sigma-Aldrich) で 2 分間処理しました。

この作業では 2 つのサンプル前処理方法が使用されました。 ミクロゲルの表面形態をイメージングするには、臨界点乾燥 (CPD) を使用しました。まず、キャリアオイルを除去し、光硬化サンプルを 50% エタノールに直接再懸濁しました。 マイクロゲルは、CPD の前に合計 2 日間、75% および 100% エタノールで連続的に徐々に脱水されました。 ミクロゲルを微多孔性標本カプセル (78 μm、Agar Scientific) に移し、100% エタノールで満たされた標本ボートに配置しました。 試験片ボートを臨界点乾燥機 (E3100、Quorum Technologies) に挿入し、液体 CO2 で少なくとも 4 回フラッシュしました。 フラッシングに続いて、サンプルを 80 bar の圧力で 37 °C に加熱して乾燥させました。 PAM 足場の表面形態を画像化するために、サンプルを凍結乾燥しました。簡単に言うと、PAM 足場を液体窒素中で瞬間凍結し、凍結乾燥機で一晩直接脱水しました。 SEM イメージングの場合、サンプルは導電性カーボン粘着パッドを使用してアルミニウム SEM スタブに取り付けられ、K575X スパッタ コータ (Quorum Technologies) を使用して 15 nm イリジウムでコーティングされました。 FEI Verios 460 走査電子顕微鏡を画像化に利用しました。

詰まったマイクロゲルインクと PAM 足場のレオロジー特性評価は、ひずみ制御レオメーター (Thermo Scientific HAAKE MARS 40/60 レオメーター) に取り付けられた平行プレート形状 (直径 20 mm、ギャップ 1 mm) を使用して実行されました。 ジャムされたミクロゲルも同様の方法で調製され、プレートと同一の形状に成形されました。 PAM 足場は 300 秒の青色光照射によって形成されました。 逆架橋戦略では、酵素で再懸濁した詰まったミクロゲルを、測定前に密閉したペトルディッシュ内で 30 分間アニーリングさせました。 せん断減粘曲線は、1%のひずみおよび0.01から10 s-1のせん断速度でのひずみ速度制御測定で得られました。 インクの回復挙動は、低歪み (1%) と高歪み (90%) を 1 Hz の周波数で 100 秒ごとに繰り返すステップ歪みスイープによって実行されました。 ひずみスイープ テストは、周波数 1 Hz、ひずみ 0 ～ 1000% で実施されました。 弾性率は、ひずみスイープ図の線形粘弾性領域から計算されました。 アニーリング前後のひずみスイープ テストはペアになっていませんでした。 1% CMC ポリマー溶液のレオロジー特性評価は、異なるプレート形状 (直径 35 mm、ギャップ 1 mm) を備えた同じ機械を使用して実行されました。 せん断減粘曲線は、1%のひずみおよび0.01から100 s-1のせん断速度でのひずみ速度制御測定で得られました。 周波数掃引は 1% のひずみと 0 ～ 10 Hz の周波数で実行されました。 すべての測定は室温で行われました。

ゼラチンとgelMAは、それぞれ最終濃度15%になるようにPBSに溶解し、熱によるゲル化を防ぐために37℃に保ちました。 10 U/ml トランスグルタミナーゼ (200 U/g、Shanghai Yuanye Biotechnology) をスパイクした 1% カルボキシメチルセルロース (CMC、Shanghai Aladdin Biochemical Technology) の原液を 4 °C に保ちました。 生物学的実験では、すべてのポリマーを対応する培地に溶解しました。 次に、ゼラチン溶液とgelMA溶液を1:2 (v/v)の比率で混合して、5%のゼラチンと10%のgelMAを含むポリマーブレンド(ヒドロゲル溶液と呼ばれます)を生成し、これに0.5% LAPを添加しました。光開始剤（Shanghai Bide Pharmatech）。 細胞の関与に関係なく、マイクロ流体実験の前に、すべてのポリマー溶液をシリンジフィルター (0.22 μm、Millex Syringe Filters) で濾過しました。 すべての溶液を 1 mL の滅菌プラスチック注射器に充填しました。 ヒドロゲル溶液を 37 °C、CMC を 4 °C に置きました。

コアシェル液滴は、チャネル高さ100μmおよび接合寸法150×150μmで特徴付けられた流れ集束マイクロ流体チップ内で生成された（補足図2a）。 ヒドロゲル溶液とCMCは、それぞれサイドチャネルと中央チャネルを介してシリンジポンプ（TYD01-02、鉛流体）によってデバイス内に移送されました。 デバイス接合部では、CMC はヒドロゲル溶液に飲み込まれ、連続相として機能する 0.1% (v/v) Pico-surf 界面活性剤 (Sphere Fluidics) を含む Novec 7500 フルオロカーボン (3 M) によって一緒に剪断されました。 流量は、オイル、ヒドロゲル溶液、および CMC についてそれぞれ 40、8、2 μL/分にシリンジ ポンプによって制御されました。 比較的高濃度のヒドロゲル溶液は熱誘起ゲル化を容易に引き起こすため、熱湯バッグをシリンジの上に置き、チューブを特注の加熱パッドで包みました。

最初の共有結合ネットワークの形成は、カルシウム非依存性トランスグルタミナーゼによって触媒され、リジンとグルタミンが新しいイソペプチド結合によって架橋されました。 液滴を完全に架橋するために、液滴を室温で一晩インキュベートしました。 硬化した液滴を、Novec 7500中の20％（v/v）1H、1H、2H、2H-ペルフルオロ-1-オクタノール（PFO、Shanghai Bide Pharmatech）をミクロゲル懸濁液に添加することによって解乳化した。 ミクロゲルは急速に凝集し、大部分の油相の除去が促進されました。その後、マイクロゲルを 2000 rpm (約 280 × g) で 10 分間遠心分離し、チューブの底に残った油を吸引しました。 次に、マイクロゲルを半浸漬させました。つまり、1 時間のマイクロ流体の実行で生成したマイクロゲル (600 μL 分散相) を、ボルテックスを介して遠心管内で 0.5% LAP を含む 150 μL PBS で直接再懸濁し、マイクロゲルを損失することなく満足のいく印刷適性をもたらしました。 顕微鏡的に不均一な足場を押出印刷するために、例えば、異なる蛍光団で官能化された、または異なる微生物を含む、さまざまな組成のミクロゲルを解乳化前に完全に混合しました。

市販の 3D プリンター (EFL-BP-6601、Yongqinquan Intelligent Equipment Co., Ltd.、蘇州、中国) を使用してミクロゲルを押出印刷するには、ミクロゲル凝集体を 5 mL の印刷カートリッジにロードし、手動で脱気しました。 詰まったマイクロゲル インクは、約 50 kPa の印刷圧力と 18 G 印刷ノズル (内径: 840 μm、テーパーなし、Nordson EFD) を使用して空気圧で堆積されました。 書き込み速度はロボット アームによって操作され、押し出し速度に合わせてアドホックに調整されました。 印刷形状は、3D プリンターのメーカーが提供するユーザー インターフェイスで事前に定義されています。 足場をきれいなガラススライド上に印刷し、波長 405 nm の青色光 (光強度 25 mW/cm2、Yongqinquan Intelligent Equipment Co., Ltd.、蘇州、中国) で 300 秒間照射すると、相互接続され共有結合で安定化されたミクロゲル足場が得られました。 。 逆架橋戦略を備えた足場の場合、液滴はまず青色光照射で 300 秒間硬化し、PFO で解乳化し、10 U/g トランスグルタミナーゼを添加した等量の PBS で再懸濁した後、足場に押し出してパターン化し、放置しました。密封されたペトリ皿内で 30 分間ミクロゲル間アニーリングを行います。 蛍光ミクロゲルは、ゼラチンと蛍光標識されたgelMA（緑：ELF-GM-GF-60、赤：ELF-GM-RF-60; Yongqinquan Intelligent Equipment Co., Ltd.、蘇州、中国）との混合物から生成されました。

異なるサイズの液滴が最初に生成されました（補足図4a）。分散相の全体の流量は10μL/分で一定に保たれ、連続相の流量は変化しました。 液滴を 30 分ごとにバッチで収集し、室温で一晩インキュベートした後、PFO で解乳化し、75 μL LAP 含有 PBS で再懸濁しました。 次に、ミクロゲルを 10,000 rpm (約 6900 × g) で 5 分間遠心分離し、チューブの底に均一に沈殿させました。 2 番目のネットワークは、300 秒間の青色光照射によって形成されました。 PAM 足場を消化するために、100 μL のトリプシン (Beyotime Biotechnology) を足場の上部に重ね、37 °C でインキュベートしました。 15 分ごとに、残りの足場を 10000 rpm (約 6900 × g) で 1 分間遠心分離し、上清を吸引し、続いて 100 μL の新鮮なトリプシンを加えてインキュベートしました。 バルクヒドロゲルの場合、0.5% LAP を含む 240 µL ヒドロゲル溶液と、10 U/mL トランスグルタミナーゼをスパイクした 1% CMC 60 µL を激しく混合し、室温で一晩インキュベートしました。 タンパク質分解前に、バルクヒドロゲルも 300 秒の青色光照射にさらされました。 アニーリングされていないミクロゲルの場合、中程度の大きさのミクロゲルが生成され、同じ方法でインキュベートされました。 解乳化の前に、ミクロゲル懸濁液に青色光を 300 秒間照射したため、ミクロゲルは相互に結合して足場を形成しませんでした。 ヒドロゲルの重量は、空のチューブの重量を差し引くことによって計算され、ヒドロゲルの開始重量によって正規化されました。

この研究で使用した大腸菌 DH5α は、N-(3-オキソデカノイル)-L-ホモセリンラクトン (3-オキソ-C12- HSL）および eGFP の発現を介したレポート。これは以前に私たちの別の研究で使用されていました 45。 Luria-Bertani (LB) 培地 (1 L): 10 g トリプトン、10 g NaCl、および 5 g 酵母エキス。 溶液のｐＨを７．０に調整し、使用前にオートクレーブ処理した。 カプセル化実験の前に、大腸菌をLB培地で継代培養した。

すべてのポリマーはLB培地によって溶解されました。 eGFPでトランスフェクトされた大腸菌細胞を、細胞培養のために最終細胞濃度がOD = 0.1になるまで1% CMC溶液に懸濁しました(図3)。 液滴が生成され、青色光を 300 秒間照射すると直ちに硬化されました。 次に、細胞を含むミク​​ロゲルを解乳化し、10-6 mol/L 3-Oxo-C12-HSL (Sigma-Aldrich) をスパイクした過剰量の LB 培地で再懸濁し、その後 37 °CE 大腸菌でインキュベートしました。 非コアシェルミクロゲルでの培養は、細胞含有相にCMCが存在しないことを除いて、まったく同じ方法で行われました。 50 μL のミクロゲル懸濁液を 0、12、および 24 時間の時点で等分し、倒立蛍光顕微鏡 (Olympus IX73) で画像化しました。

ミクロゲルから培地に漏れた細胞の量は、プレーティング実験によって測定されました。 細胞培養の 24 時間後、100 μL の培地を分注し、それぞれ 105、106、および 107 倍に希釈し、LB 寒天プレートにプレーティングしました。 CFUは、37℃で24時間培養した後、プレート上に形成されたコロニーを求愛することによって計算した。 実験は三重に実施した。

A549 と HEK 293 T はケンブリッジ大学の成田グループのもので、American Type Culture Collection から入手しました。 細胞は、10% (v/v) ウシ胎児血清 (FBS、GibcoTM A3160801)、2 mM l-グルタミン (GibcoTM 25030024)、1 mM ピルビン酸ナトリウム (GibcoTM 11360070) を添加したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM、GibcoTM 31053044) で培養しました。 ）、および0.5％（v/v）ペニシリン-ストレプトマイシン（GibcoTM 15070063）。

すべてのポリマーは細胞培養培地によって溶解されました。 HEK 293 T 細胞 (1,000 万/mL) をカプセル化する前に 1% CMC 溶液に懸濁しました。 ポアソン過程を検証するために（補足図9）、比較としてA549細胞もカプセル化されました。 液滴は前述のプロトコルによって生成されました。 細胞を含む液滴は、収集時に 300 秒の青色光照射によって硬化され、解乳化され、DMEM に再懸濁され、その後 37 °C および 5% CO2 でインキュベートされました。

細胞を含むマイクロゲルを等分し、細胞カプセル化後に画像化した。 各ミクロゲル内の細胞の数を手動で数え、頻度をプロットしました。 ポアソン確率モデルに適合させるために、ミクロゲル内の細胞の平均数が計算され、理論的なポアソン モデルをプロットできます。

ここで、k はコアシェル ミクロゲルに封入された細胞の観察数を表し、λ はミクロゲルに封入された細胞の平均数を表します。

HEK 293 T の細胞生存率は、Live/Dead 染色キット (Invitrogen) を使用して評価されました。 0、3、6 日目に、30 μL のミクロゲル懸濁液を等分し、4 μM カルセイン アセトキシメチル (カルセイン AM) および 2 μM エチジウム ホモダイマー-1 (EthD-1) を含む培地中で 37 °C で 30 分間インキュベートした後、画像化しました。ライカ DMI6000B 落射蛍光顕微鏡による。

スフェロイドの成長は、すべて FIJI ソフトウェアによって面積と円形度によって定量化されました。 具体的には、Live と Dead の 2 つのチャネルの蛍光画像をマージして 2 値画像に閾値処理した後、FIJI によって回転楕円体の面積 (A) と周長 (P) を直接測定できるようになりました。 回転楕円体の真円度は次のように計算されました。

500 μL のミクロゲル懸濁液を等分し、3500 rpm (約 850 xg) で 5 分間遠心分離し、上清を吸引しました。 次に、マイクロゲルを 100 μL の 4% パラホルムアルデヒドとともに室温で 30 分間インキュベートし、インキュベーション後に PBS で集中的に洗浄しました。 次に、ミクロゲルを 0.1% Triton X-100 (Fisher Bioreagents BP151-500、Thermo Fisher) を含む 100 μL PBS に再懸濁しました。 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI、Sigma-Aldrich) および Alexa FluorTM 647 ファロイジン (Invitrogen) ストック溶液を加え、それぞれ 1000 倍と 40 倍に希釈し、室温で 30 分間インキュベートしました。温度。 最後に、ミクロゲルを少なくとも 2 回洗浄し、PBS に再懸濁しました。 単層ベースの培養の視覚化は、同じプロトコルに従いました。 核および f-アクチンの空間構成は、Leica TCS SP8 共焦点顕微鏡を使用して画像化されました。 Z チャネルは、回転楕円体の 3D 構造を構築するために 10 μm ごとに収集されました。 単層細胞のイメージングは​​蛍光顕微鏡 (Olympus IX73) によって行われました。

酵母サッカロマイセス・セレビシエはFleischmann's Rapid Riseから購入し、細胞カプセル化実験の前にYPD培地中で12時間活性化した。 YPD培地（1L）：酵母エキス10g、ペプトン20g、ブドウ糖20g。 培養培地は使用前にオートクレーブ滅菌した。

すべてのポリマー溶液は YPD 媒体によって溶解されました。 細胞を含むコアシェル液滴を酵母OD = 0.8で生成し、室温で一晩インキュベートして硬化させました。 2 層の 3 × 3 格子足場 (寸法: およそ 20 × 20 × 2 mm) を生物学的安全キャビネット内で手で押し出し、エタノール発酵のために 1.5 mL の YPD 培地に浸す前に 300 秒間青色光を照射しました。 培地を窒素ガスで５分間バブリングして酸素を除去し、発酵中ガラスバイアルを密封した。 さまざまなサイズのマイクロゲルを生成するために、2 つのマイクロ流体デバイスと異なる流量が使用されました。 コアシェルミクロゲル A および B は、接合部寸法 150 × 150 μm、チャネル高さ 100 μm のフローフォーカシングデバイスを使用して生成されました。 コアシェルミクロゲル C は、同じ設計のデバイスを使用して生成されましたが、接合部の寸法が 100 × 100 μm、チャネルの高さが 75 μm でした。 シェル相とコア相の体積比は次のように計算されました。

ここで、R1 はコアシェル ミクロゲルの直径、R2 は FIJI ソフトウェアによって測定されたコアです。

50 μL の培地を 12 時間にわたって 2 時間ごとに等分し、10,000 rpm (約 6900 × g) で 5 分間遠心分離しました。 上清を濾過し (0.22 µm)、DB-1701 カラム (Agilent、30 m × 0.25 mm) を使用してガスクロマトグラフィー (GC、Agilent gc 6890n) によって分析しました。 エタノール濃度はエタノール標準曲線から導き出しました。

微細藻類 Chlorella vulgaris は、Shanghai Guangyu Biotechnology Co., Ltd. から購入し、直接継代培養しました。 細菌 Bacillus subtilis は、南京理工大学の Su Chen 教授の研究室から贈られたものです3。 カプセル化実験の前に、Bacillus subtilis を LB 培地で 37 °C で培養し、Chlorella vulgaris を BG11 培地 (Qingdao Haibo Biotechnology) で培養し、光強度約 10000 ルクスおよび明暗サイクルで 25 °C でインキュベートしました。 12 時間ごとの条件 (MQT-60G、Shanghai Minquan Instrument)。 バイオレメディエーションの培地レシピ: アモキシシリン バイオレメディエーション: BG11 培地中の 300 mg/L アモキシシリン (Shanghai Yuanye Biotechnology)。 メチル オレンジ バイオレメディエーション 3: 100 mg/L メチル オレンジ (Shanghai Aladdin Biochemical Technology)、22.16 mg/L NH4Cl、6.57 mg/L KNO3、1.08 mg/L NaNO2、5.09 mg/mL KH2PO4。 オートクレーブ処理後、アモキシシリン/メチル オレンジをそれぞれの培地の残りの部分に溶解し、マイクロ流体実験の前に完全な培地をシリンジろ過 (0.22 μm) しました。

すべてのポリマーは、アモキシシリン/メチル オレンジを含まない対応する媒体によってすべて溶解されました。 細胞を含んだコアシェル液滴を両方の微生物に対してそれぞれ OD = 0.4 で生成し、室温で一晩インキュベートして硬化させました。 3 層の 3 × 3 格子足場 (寸法: およそ 20 × 20 × 3 mm) を生物学的安全キャビネット内で手で押し出し、300 秒間青色光を照射した後、バイオレメディエーション用の 6 mL 培地 (アモキシシリン/メチル オレンジを含む) に浸しました。バイオレメディエーション用、足場生分解実験用BG11培地）。 不均一な足場をプリントするために、細菌または微細藻類の単一培養物をカプセル化したコアシェルミクロゲルを解乳化する前に均一に混合し、一緒に足場にプリントしました。 均一な足場の場合、マイクロ流体カプセル化の前に細胞懸濁液を 1:1 (v/v) で混合しました。 足場は、バイオレメディエーションのために、約 10,000 ルクスの光強度と 12 時間ごとの明暗条件のサイクルで 25 °C でインキュベートされました。 足場の崩壊を 24 時間ごとに監視しました。

インキュベーション後 6、12、18、および 24 時間後に 150 μL の培地を等分し、10,000 rpm (約 6900 × g) で 5 分間遠心分離しました。 分析前に上清をシリンジ濾過した。 メチルオレンジの濃度をUV-Vis分光光度計(UV-3600、島津製作所)で測定し、対応する媒体の標準曲線と比較しました。 アモキシシリンの濃度は、C18 カラム (Waters SunFire C18 カラム、5 μm、4.6 × 250 mm) を備えた高速液体クロマトグラフィー (HPLC、LC-20AD、島津製作所) によって測定し、対応する媒体中のアモキシシリンの標準曲線と比較しました。 不均一培地中のプロテアーゼの濃度は、市販のキット（D799673-0050、Sangon Biotech）を使用し、製造業者の指示に従って測定した。

すべての株は、南京理工大学の Wenming Zhang 教授から入手しました60。 菌株: 真菌 M. guilliermondii MG57: mgpdc-mgadh-scaro10-scgap-scaro80-mggdh。 過剰発現遺伝子 mgpdc、mgadh、mggdh は M. guilliermondii 由来で 57、scaro10、scgap、scaro80 は Saccharomyces cerevisiae 由来でした 58,59。 細菌大腸菌 YLC20: 遺伝子 aroF および pheA を過剰発現し、遺伝子 tyrA を CRISPR/Cas9 ノックアウトするためのプラスミドを含む大腸菌 W1485。

100×塩溶液 (1 L中): 100 g NaCl、50 g MgCl2・6H2O、20 g KH2PO4、30 g NH4Cl、30 g KCl、および 1.5 CaCl2・2H2O。 溶液は使用前にオートクレーブ滅菌した。 微量元素溶液（TES、1 L中）：2 g Al2(SO4)3・18H2O、0.75 g CoSO4・7H2O、2.5 g CuSO4・5H2O、0.5 g H3BO3、24 g MnSO4・7H2O、2.5 g NiSO4・6H2O、15 ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、および３ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ。 合成培地 (1 L中): 3 g MgSO4、3 g KH2PO4、1 g NaCl、5 g (NH4)2SO4、0.015 CaCl2・2H2O、0.1125 FeSO4・7H2O、1 g クエン酸三ナトリウム、10 g 酵母エキス、0.3 g l -チロシン、0.5 gの酵母窒素塩基、および2.3 gのN-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]-2-アミノエタンスルホン酸。 溶液をオートクレーブ処理し、次いで、別にオートクレーブ処理したグルコース４５ｇ、０．２２μｍシリンジ濾過したビタミンＢ１ ０．０７５ｇおよび硫酸カナマイシン０．０４ｇを加えた。 その後、オートクレーブ処理した１００×塩溶液を、オートクレーブ処理したＴＥＳ １．５ｍＬ／Ｌとともに、培地１Ｌ当たり１０ｍＬずつ混合物に添加し、混合物の体積を１Ｌに調整して、完全な合成物を得た。中くらい。

すべてのポリマーはすべて合成媒体に溶解しました。 細胞を含んだコアシェル液滴を両方の微生物に対してそれぞれ OD = 0.5 で生成し、室温で一晩インキュベートして硬化させました。 5 層の 3 × 3 格子足場 (寸法: ~0 × 20 × 5 mm) を生物学的安全キャビネット内で手で押し出し、2-PE 発酵用の 8 mL 培地に浸す前に青色光を 300 秒間照射しました。 液体培養ベースの 2-PE 発酵では、同等の細胞負荷を確保するために、両方の微生物を含む同量の 1% CMC (均一に混合する前にそれぞれ OD = 0.5) を等分し、液滴群と並べて室温で一晩インキュベートし、細胞に接種しました。足場を浸すと同時に8 mLの合成培地を加えた。 均一および不均一な足場は、以前と同じ方法で製造されました。 すべての足場は最初の 24 時間は 37 °C でインキュベートされ、2 日目以降は 30 °C に移動されました。 バッチ発酵後、例えば最初の 3 日間の足場を慎重に取り出し、新鮮な培地で 3 回洗浄した後、再利用のために新鮮な 8 mL 培地に浸漬し、これを 3 日ごとに繰り返し、合計 3 ラウンドの再利用を行いました。 2-PE 濃度を各バッチ後に測定しました。 異種足場と同種足場の両方を再利用しました。

不均一な足場の動態曲線は、24 時間間隔で 2-PE 濃度を 6 日間モニタリングして得られました。 不均一な足場、均一な足場、および液体培養の比較は、3 日目の終わりに行われました。150 μL の培地を等分し、10,000 rpm (約 6900 x g) で 5 分間遠心分離しました。 分析前に上清をシリンジフィルター (0.22 μm) で濾過しました。 2-PE の濃度は、DB-1701 カラム (Agilent、30 m × 0.25 mm) を備えた GC (Agilent gc 6890n) で測定し、標準曲線と比較しました。

すべてのデータ処理と統計分析は Microsoft Excel 2019 によって実行され、NumPy (v.1.22.1) および Matplotlib (v.3.5.1) ライブラリを使用する Python (v. 3.8.12) スクリプトを使用してプロットされました。 データは、少なくとも 3 つの生物学的複製からの平均 ± 標準偏差として表示されるか、原稿に別途記載されます。 すべての画像は FIJI-ImageJ (v 2.0.0-rc-69/1.52i) によって処理され、Adobe illustrator 2019 を使用してイラストのデザインと図の作成が行われました。

写真、すなわち図1c、補足図。 図６ａ、１６ａは、印刷された足場の代表的な画像である。 液滴とミクロゲルの顕微鏡写真、図。 図1b、3a、b、2e、4bおよび補足2b、3a、b、7a、9a、9cは、独立して繰り返された実験の1つでランダムに等分されたサンプルの代表的な画像です。 印刷された足場の顕微鏡写真。 1c、2d、fおよび補足図。 図3c、8a〜cは、同様の形態を有する足場の局所構造の代表的な画像です。 すべてのレオロジー特性評価は3回実行され、図2a、bおよび補足図5a〜e、g〜iは同様の結果からの代表的なプロットです。 細胞スフェロイドデータは、1つの実験でランダムに等分されたミクロゲルサンプルから生成されました。図3fと補足図10は、同様の細胞構造を有するスフェロイドの代表的な共焦点顕微鏡画像です。 すべての微生物バイオプロセシング実験は 3 回繰り返して実行されました。補足図 13 は、微細藻類 - 細菌コンソーシアムによる足場分解の実験からの代表的な画像セットの 1 つです。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この調査で生成されたすべてのデータは、ソース データ ファイルで提供されます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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中国国家重点研究開発プログラム (2021YFC2104300)、中国国家自然科学財団 (21901117、32111530117)、材料指向化学工学国家重点研究所 (KL20-02) を ZY ニューマン財団、ウェルカム トラストに、欧州連合の第7次枠組みプログラム（FP7/2007-2013）に基づく欧州研究評議会から、ERC Grant PhysProt（協定番号337969）を通じて、TPJK Cancer Research UK (CRUK) Cambridge Institute Core Grant (C9545/A29590) to MNへ。 CRUK 早期検出ポンププライミング賞 (C20/A20976) が TK および MN 中国奨学会 (YO および HZ) に授与されました。

郭成志

現在の住所：University College London、Torrington Place、London、WC1E 7JE、UK 化学工学部

材料指向化学工学国家重点実験室、化学工学部、南京理工大学、30 Puzhu South Road、Nanjing、211816、PR China

Yangteng Ou、Yang Zhang、Chengzhi Guo、Ziyi Yu

ユスフ・ハミード ケンブリッジ大学化学科、レンズフィールド・ロード、ケンブリッジ、CB2 1EW、英国

Yangteng Ou、Hongjia Zhu、Yanli Zhang、Tuomas PJ Knowles

ケンブリッジ大学南京技術革新センター、126 Dingshan Street、南京、210046、中国

楊騰王

材料指向化学工学の国家重点実験室、生物工学および薬学工学部、南京理工大学、30 Puzhu South Road、Nanjing、211816、PR China

Shixiang Cao、Wei Yan、Fengxue Xin、Weiliang Dong

Cancer Research UK Cambridge Institute、ケンブリッジ大学、ケンブリッジ、Li Ka Shing Centre、Robinson Way、ケンブリッジ、CB2 0RE、英国

Masashi Narita

ケンブリッジ大学キャベンディッシュ研究所、JJ Thomson Avenue、ケンブリッジ、CB3 0HE、英国

トゥオーマス PJ ノウルズ

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YO、TPJK、ZY が実験を考案し、設計しました。 YO は実験を行い、データを整理し、原稿を書きました。 SC、Yang Z.、HZ、CG は実験を行いました。 ワイオミング州とFXは、代謝的に操作された微生物を使った実験に関する情報と指示を提供した。 MN は哺乳動物細胞株と組織培養施設を提供しました。 WD と Yanli Z. が論文の改訂に協力してくれました。 TKとZYが監修し、原稿を改訂しました。 著者全員が論文を検討し、最終版に同意しました。

PJ ノウルズへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Jianhua Qin と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Ou, Y.、Cao, S.、Zhang, Y. 他タンパク質ベースのコアシェルマイクロゲルからの微多孔性機能性生体材料のバイオプリンティング。 Nat Commun 14、322 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-35140-5

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受信日: 2022 年 6 月 10 日

受理日: 2022 年 11 月 21 日

公開日: 2023 年 1 月 19 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35140-5

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