フェレドキシンと複合体を形成したシアノバクテリア光化学系 I の構造 (解像度 1.97 Å)

Oct 15, 2023

Communications Biology volume 5、記事番号: 951 (2022) この記事を引用

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23 オルトメトリック

メトリクスの詳細

光化学系 I (PSI) は、シトクロム c6 (Cyt c6) からフェレドキシン (Fd) に電子を輸送する光駆動電子ポンプです。この電子伝達プロセスの理解は、PSI:Fd 界面および Cyt c6 の結合部位の可能性に関する構造の詳細が不足しているために妨げられています。ここでは、Fd およびゆるく結合した Cyt c6 と複合体を形成した Thermosynechococcus elongatus BP-1 PSI の高分解能クライオ EM 構造について説明します。架橋水分子を含む PSI:Fd 界面での側鎖相互作用が詳細に視覚化されます。この構造は、Fd 結合の反応速度に影響を与える PsaE および PsaC の変異体の特性を説明し、還元時の Fd 解離の分子スイッチを示唆しています。熱量測定に基づく熱力学分析により、Fd の単一結合部位が確認され、PSI:Fd 複合体形成が純粋にエントロピーによって駆動されることが実証されました。 PSI を介した Cyt c6 から Fd への電子の効率的な移動のための可能な反応サイクルが提案されています。

酸素発生型光合成は明反応と暗反応で構成され、前者は光子の吸収から始まり、水に由来する光合成電子伝達系を最終的な電子伝達タンパク質であるフェレドキシン1 (Fd) まで駆動します。 4 つの大きな膜タンパク質複合体、光化学系 II2、シトクロム (Cyt) b6f3、光化学系 I4 (PSI)、および NADH 様複合体 I5 (NDH-1) は、チラコイド膜内の電子伝達鎖で機能します。プラストキノン、プラストシアニン (Pc)、Cyt c6、およびフェレドキシン (Fd) は、これらの膜複合体間で電子を往復させる移動電子伝達体として機能します。これらの電子伝達体は、酸化還元パートナーと一時的な複合体を形成します。電子伝達イベントは連続的であり、高度な特異性と速度論的に効率的な方法で発生する必要があります。つまり、完全な電気化学反応のパフォーマンスを最大限に高めるには、電子移動速度が鍵となります。親油性有機分子、プラストキノンまたはキノン類似体の光化学系 II と Cyt b6f 間の分子間相互作用は、反応速度論 6 および X 線結晶構造解析 7 によってよく特徴付けられています。しかし、水溶性電子伝達体 Pc および Fd と Cyt b6f、PSI、および NDH-1 とのタンパク質間相互作用は、酸化還元依存構造の分子サイズが大きいため研究が困難です。

PSI は、チラコイド膜を通過する電子の移動のために光駆動の高速電荷分離を実行します8。量子効率が 100% に近い PSI は、自然界に存在する最も効率的なエネルギー変換器です9。 PSI 反応中心の周囲のアンテナ色素によって励起エネルギーが集められることにより、P7004 と呼ばれるクロロフィル a/クロロフィル a' 分子のペアで電荷分離が起こります。その後、活性化された電子は電子伝達連鎖 (ETC) を介して伝達され、[4Fe-4S] クラスター FA および FB を介して、間質側にある下流の水溶性電子受容体 Fd に中継されます10。強力な還元剤 Fd は、NADPH の生成、窒素と硫黄の同化、脂肪酸の不飽和化など、さまざまな下流反応に電子を提供します 11。酸化された P700 はその後、管腔電子供与体タンパク質である Cyt c6 または Pc によって還元され、次の電子伝達ラウンドが開始されます 12。シアノバクテリア PSI は主にホモ三量体ですが、単量体 13 または四量体 14 の形態も存在します。各 PSI プロトマーは、100 を超える補欠分子族をホストする最大 12 個のサブユニットで構成され、複合体の総質量の 3 分の 1 を占めます 15。 Thermosynechococcus elongatus (旧名 Synechococcus elongatus) 由来の三量体シアノバクテリア PSI の X 線構造は、2001 年に 2.5 Å の解像度で決定され (PDB ID: 1JB04)、2018 年には Synechocystis sp. 由来の X 線構造が決定されました。 PCC 6803 も解像度 2.5 Å (PDB ID: 5OY016)。その後、光を集めるクロロフィルタンパク質 I (LHCI) と複合体を形成した緑色植物型 PSI を含む他のいくつかの PSI 構造が、X 線結晶構造解析および極低温電子顕微鏡 (cryo-EM) によって高解像度で明らかになりました。すなわち、2.4 Å のエンドウ豆由来の PSI-LHCI (PDB ID: 7DKZ17)、緑藻由来の PSI-LHCI-LHCII (PDB ID: 7D0J18)、および 2.38 Å および 2.4 Å 分解能の珪藻由来の 2 つの PSI-LHCI 複合体 (PDB ID) ：6LY519、6L4U20）。クライオ EM における解像度革命 21 の後、わずかに解像度が高いシアノバクテリア PSI のさらに 2 つのクライオ EM 構造が公開されました。すなわち、2.35 Å の Halomicronema hongdecilis C2206 からの三量体 PSI (PDB ID: 6KMW22)、およびヘテロシスト形成アナベナ sp. からの四量体 PSI。 PCC7120 2.37 Å (PDB ID: 6K6114)。

PSI 関連の膜貫通電子伝達機構をより深く理解するために、共結晶化や化学架橋などのさまざまな方法が電子伝達パートナーと PSI に適用されました。 Fd:PSI は、非共有結合性電子伝達錯体であるにもかかわらず、2002 年に結晶化されました 23。 2018 年に私たちのグループは、解像度 4.2 Å で Fd:PSI 複合体の最初の X 線構造を報告しました24。この構造により、PSI の間質側にある Fd 結合部位が確認されました。これは、部位特異的突然変異誘発 25 および動態解析 26 によって以前に示唆されていました。この Fd:PSI X 線構造では、タンパク質構造がネイティブ Fd27 と同一であるガリウム置換フェレドキシン (Ga-Fd) を使用して、光が照射された場合でも結合 Fd の酸化還元状態を酸化型に固定しました。。最近、クライオ EM によって決定された PSI の非共有電子伝達複合体構造がいくつか報告されています。たとえば、PSI:Fd (PDB ID: 7S3D28)、フラボドキシンが結合した PSI-IsiA 複合体 (PDB ID: 6KIF29)、およびトリプルPc:PSI-LHCI:Fd の複合体 (PDB ID: 6YEZ30)。しかし、結合移動キャリアタンパク質の局所分解能が低いため、内腔電子供与体 Pc の結合モードについては、2.74 Å の Pc:PSI-LHCI 超複合体 (PDB ID: 6ZOO31) を除いて、残基レベルでの詳細な分析ができませんでした。 PSI:Cyt c6 の電子伝達複合体を可視化する多大な努力にもかかわらず 32、これまでのところ、PSI:Cyt c6 複合体の X 線構造もクライオ EM 構造も報告されていません。

電子リレーシステムに関与するタンパク質間相互作用をより深く理解するには、制御された酸化還元状態下での PSI のより高解像度の構造とその電子供与体および受容体の構造が必要です。ここでは、PSI への Fd 結合の熱力学測定とともに、全体解像度 1.97 の単粒子クライオ EM によって分析した、電子伝達パートナーである Fd および Cyt c6 と結合した Thermosynechococcus elongatus BP-1 由来のシアノバクテリア PSI の構造について説明します。 Å.

精製されたPSI三量体サンプルは、GDN33への界面活性剤交換とGraDeR34による過剰な遊離界面活性剤の除去によって単一粒子クライオEM用に最適化され、高濃度で非常に均質な調製物が得られました（補足図1a、b）。最初のステップでは、PSI 三量体のみの高解像度イメージング用にクライオグリッド準備のパラメーターが最適化されました。最適な氷の厚さと粒子分布は、PSI 三量体タンパク質濃度 30 mg/ml で観察されましたが、この濃度を下回るか上回る値ではクライオグリッドの品質が低下しました。第 2 ステップでは、Ga-Fd を、結晶成長のためにあらかじめ最適化された 8.0 の弱塩基性 pH および 1.0:1.1 (PSI:Fd) のモル比で添加しました 27 が、Cyt c6 の精製には収率が不十分であったため、そのモル比は制限されました。最終的なクライオグリッド調製に使用される三重混合物のモル比は 1.0:1.1:0.4 (PSI:Fd:Cyt c6) になります。すべてのクライオグリッドスクリーニングは、200 kV クライオ TEM (Talos Arctica、TFS) を使用して実行されました。次に、粒子密度が高く、適切なガラス質氷の厚さの広い領域を示すクライオグリッド（補足図2b）を、コールドFEG、カラム内Ωエネルギーフィルター、およびK3直接電子検出器を備えた300 kVクライオTEMに移しました。 (CRYO ARM 300、日本電子、Gatan)。 Relion 3.135での画像処理（補足図2）により、全体解像度1.97Åで207,142個の粒子から計算された最終的な3D密度マップが得られました。これは、PSI：Fd結合界面の側鎖密度と水分子を視覚化するのに十分な品質でした。補足表 1 は、クライオ EM データの収集、改良、および検証の統計を示しています。 C3 および C1 対称性を持つ後処理されたマップは両方とも、電子顕微鏡データバンク (EMDB36、アクセッション番号: EMD-31605) に寄託されました。生の画像は、電子顕微鏡パブリック画像アーカイブ (EMPIAR37、アクセッション番号: EMPIAR-10928) にアップロードされました。

膜面に沿って見ると、Fd結合PSI三量体はクローバーの葉の形に似ており、直径は約200Å、総質量は1110kDaです（図1）。解像度 2.07 Å の非対称 (C1) 密度マップと解像度 1.97 Å の対称 (C3) マップの間に有意な差は確認されなかったため、原子モデルの構築には後者のマップが使用されました。 T. elongates からの 2.5 Å の分解能で解析された PSI の結晶構造 (PDB ID 1JB04) と 1.5 Å の分解能で解析された Fd の結晶構造 (PDB ID 5AUI27) を参照モデルとして使用しました。 PSI：Fd複合体のモデル（PDB ID：7FIX）は、厳密な3回対称（C3）で1.97Åで決定された最終密度マップに対して洗練されました（補足図3）。私たちのモデルでは、各 T. elongatus PSI プロトマー (PsaA、PsaB、PsaC、PsaD、PsaE、PsaF、PsaI、PsaJ、PsaK、PsaL、PsaM、および PsaX) の 12 サブユニットすべてが、同じように結合した 3 つの Fd に加えて含まれていました。 PSI三量体の間質側からPsaA、PsaC、PsaEまで。拡大図（図1a）は、PSI結合Fdの原子モデルを示しており、対応する密度マップとよく一致しています。球と棒のスタイルで描かれた PsaC サブユニットの Fd の [2Ga-2S] クラスターと FB の [4Fe-4S] クラスターは、端から端までの距離 8.9 Å に配置されました。

C3 対称の Fd 結合 PSI 三量体複合体モデル。3 つのプロトマーのそれぞれが灰色の表面、またはサブユニット鎖によって着色された表面 (PsaA-青、PsaB-赤、PsaC-紫、PsaD-水色、PsaE) で示されています。 -緑、PsaF-黄色、PsaI-暗紫、PsaJ-暗緑、PsaK-ピンクがかった赤、PsaL-白、PsaM-オレンジ、PsaX-ピンク、Fd-シアン）、または漫画スタイルで色付けされています。リガンドは球と棒のスタイルで別々に表示され、元素に応じて色分けされています。フェレドキシン (Fd) 結合界面の拡大図と Fd の対応する密度マップ。 b PSI プロトマー間のモデル化された脂質アシル鎖とそれらの対応する密度マップ。

補足の図4aは、上面図と側面図の両方で密度マップの局所解像度を示しています。ＰｓａＢの膜に面する側のＰＳＩ三量体の管腔側およびＰｓａＦのＮ末端領域の近傍の各ＰＳＩプロトマーについて、球状密度が、ＰＳＩ周囲デタージェントベルトのマップ閾値と同様のマップ閾値で観察された。 3つの密度すべての位置と特徴は同一であり、最初のde novoモデルにすでに存在しており（補足図2e）、おそらく緩く結合したCyt c6に由来します。これら 3 つの密度は、マスクされた 3D 分類と精製を行った場合、局所的な解像度や鮮明度が向上しませんでした。 Phenix38を使用したシアノバクテリアのCyt c6構造の剛体モデリングは、密度がCyt c6にとって十分なサイズであることを示しました（補足図4b、c）。それにもかかわらず、その配向が曖昧であるため、図 1 に示す最終的な原子座標 (7FIX) で Fd:PSI:Cyt c6 の三元複合体をモデル化することはしませんでした。

完全なモデルには、合計 39 個のポリペプチド鎖、285 個のクロロフィル a、3 個のクロロフィル a'、72 個の β-カロテン、6 個のフィロキノン、9 個の [4Fe-4S] 鉄硫黄クラスター、3 個の Ca2+ イオン、9 個のホスファチジルグリセロール、3 個のジガラクトシルジアシルグリセロール、348 が含まれています。 PSI の場合は水分子と 51 個の脂質、Fd の場合は 3 つのポリペプチドと 3 つの [2Ga-2S] クラスターがヘッドグループなしで構築されます。私たちの参照モデルとの顕著な違いには、以前にモノガラクトシルジアシルグリセロールでモデル化されたリピド II がジガラクトシルジアシルグリセロールとして同定されたこと、リピッド IV アシル鎖の延長、および PsaL 残基 143 がロイシンからセリンに変更され、現在は PsaL の一次配列データバンクのエントリと一致していることが含まれます。 (UniProtKB - Q8DGB4)。私たちのマップにより、末端領域を 39 アミノ酸残基、つまり Lys11 ～ Val12、PsaA の Gly263 ～ Ile265、PsaB の Gly740、Thr5 ～ Val19、Ala33、Pro44 ～ Phe54、PsaK の Gln78 ～ Leu83、および PsaL の Glu3 まで拡張することができました。。 PsaM (1JB0 の CLA 1601) に結合したクロロフィルの密度は観察されませんでしたが、これはモデルには含まれていませんでした。さらに、PsaK および PsaA の 2 つの密度は、新たに同定された PsaK の β-カロテン BCR102 および PsaA の BCR855 として部分的にモデル化されました。しかし、どちらの密度も明確なポリエン鎖メチルバンプを示さないため、これらの密度が脂質などの他の同様の分子種に由来する可能性を排除できません。さらに、新しいクロロフィルが PsaJ で同定され、PsaJ CLA1307 としてモデルに組み込まれました。最後に、各モノマー-モノマー界面の合計 17 個の新しい脂質アシル鎖をモデルに組み込むことができました (図 1b)。すべての追加と変更は、代表的なマップとモデルとともに補足図 5 に示されています (補足図 6)。

Fdの[2Ga-2S]を含むETCのすべての成分と、Cyt c6のヘムを除くそれらの密度マップを、中心間距離（P700からフィロキノン）または分子間距離として計算して図2に示します。エッジツーエッジ (フィロキノンから Fd [2Ga-2S])。 ETC の分岐 A と分岐 B は両方とも、[4Fe-4S] クラスター FX から等距離 (8.9 Å) に位置し、PsaA と PsaB の両方によって配位される、密に積み重ねられた 2 つのクロロフィル a 分子と 1 つのフィロキノン分子で構成されています。 PsaC は、ETC の最後の 2 つの構成要素である [4Fe-4S] クラスター FA および FB をホストします。このうち FB は最後の電子受容体であり、ドッキングされた可溶性電子受容体である Fd またはフラボドキシン (Fld) への電子移動のポイントです。 PSI:Fd 密度マップの高い局所解像度により、かなりの信頼性を持って ETC の余因子距離を測定することができました。観察されたフィロキノンと 3 つの [4Fe-4S] クラスター間の端から端までの距離は、2.5 Å X 線結晶構造で以前に決定されたものとよく一致しています (PDB ID: 1JB0)。 FB と Fd の [2Ga-2S] 間の距離 8.9 Å は、効率的な電子トンネリングにとって十分に短く、PSI-IsiA-Fld 超複合体で見つかった距離と一致します 29。さらに、この距離は、以前の PSI:Fd X 線結晶構造で観察された 3 つの異なる距離の平均にも相当します24。

補因子間の距離は、隣接するクロロフィルのマグネシウム原子から、A 分岐および B 分岐 (破線) のフィロキノンカルボニル環の中心までの「中心から中心まで」、またはフィロキノン間の「端から端まで」で測定されました。鉄と硫黄のクラスター（実線）。

私たちの構造では、3 つの Fd 分子が PSI 三量体の間質側にしっかりと結合しています。ノイズに近い密度レベルで等高線化されたマップでも、PSI の他の間質部位に結合した追加の Fd 分子を示すさらなる密度は識別できません。各 Fd 分子は同一の様式で 1 つの PSI プロトマーに結合し、サブユニット PsaA、PsaC、および PsaE と密接に接触しますが、PsaD または PsaF との直接の相互作用は見つかりませんでした。約 2.5 Å の局所分解能と PSI:Fd 界面の明確に定義されたマップ特徴により、アミノ酸側鎖といくつかの水分子を自信を持ってモデル化することができました。 PSI:Fd 界面での直接相互作用に関与するアミノ酸残基と水分子は、LigPlot+39、40 スイートの DIMPLOT プログラムを使用して定義されました。 DIMPLOT 分析に基づくと、PSI サブユニット内の合計 18 残基 (PsaA の Arg36、Arg40、Thr60、PsaC の Ile11、Gly12、Gln15、Arg18、Lys34、Ala35、Ala56、Pro58、Arg3、Ile37、Arg39、Ser53、Asn56) 、PsaEのThr57、Asn59）およびFd内の20残基（PsaAのSer60、Asp61、Asp67、Ile70、PsaCのPhe38、Ser39、Cys40、Ala44、Cys45、Thr47、Phe64、Tyr97、Glu23、Tyr24、Asp27、Glu31、Cys40）、Arg41、Ala42、PsaEのSer63）は、結合相互作用に関与していることが確認されました（図3および補足図7）。 Fd の 4 残基 (Glu23、Asp27、Phe38、Thr47) が結合相互作用に関与していることが新たに同定されましたが、PSI と相互作用すると以前に割り当てられていた Fd の 4 残基 (Gln62、Asp66、Glu71、Tyr81) 24 は結合相互作用に関与していることがわかりませんでした。この研究ではそうします。合計 6 つの架橋水分子 (HOH202 から Fd:PsaA、HOH203、HOH204、HOH205 から Fd:PsaC、HOH101、HOH201 から Fd:PsaE) が結合表面近くで同定され、PSI と Fd 間の潜在的な水素結合結合が示されました。 X線結晶構造解析、NMR転写交差飽和、および結合時にFdのどの残基がPSIと相互作用するかという問題に関するこの研究の結果の比較を図4に示します。

製本に関係する各インターフェイスは、開いたブックスタイルで個別に表示されます。直接相互作用するアミノ酸残基と水分子が標識されます。 a、bはFd:PsaAの場合、c、dはFd:PsaCの場合、e、fはFd:PsaEの場合です。相互作用に関与する新たに同定された残基は赤色でラベル付けされます。すべてのタンパク質表面は、静電位に応じて色付けされます (青はプラス、赤はマイナス)。

相互作用残基は、共結晶化 PSI:Fd X 線回折 (PDB ID: 5ZF024)、b クライオ EM (この研究)、および c NMR 転写交差飽和によって決定されました。各方法によって決定された固有の残基は、対応するラベルによって強調表示されます (背側の残基は省略されました)。

2つの重要なPSI：Fd結合界面を図5に示します。FdのPhe38とPsaCのLys34およびFdのArg41の間の1対のカチオン-π相互作用が同定されました（図5a）。 PsaE の Arg39 は、疎水性相互作用を通じて Fd の Arg41 と相互作用し、Fd の Asp27 および Tyr24 と追加の相互作用を行います。 PsaCの残基Gln15は、PSIとFdの間で最も多くの分子間相互作用を形成しており、電子供与性クラスターと電子受容性クラスターの近傍に戦略的に位置している可能性があります（図5b）。 PsaC の Gln15 は、Fd の Cys45 および Phe64 と疎水性相互作用を行っており、Ala44 とも水素結合を形成します。さらに、HOH205 への水素結合を介して、PsaC の Gln15 は Fd の C 末端 Tyr97 に接続されます。次に、Tyr97 は PsaC の Arg18 に対してカチオン - π 相互作用を行います。 FdのTyr97は明確な密度を示しますが、これはC末端の既知の柔軟性を考えると驚くべきことであり（補足図8）、Fd Tyr97とPsaCの間の強い相互作用を示しています。

PSIとFdの結合親和性に寄与する相互作用の関係。重要な PSI 残基、PsaC の Lys34 および PsaE の Arg39、およびそれぞれの Fd 結合パートナーが強調表示されています。紫色のリボンの PsaC、緑色のリボンの PsaE、シアン色のリボンの Fd、およびそれらの相互作用する残基側鎖原子をボールとスティックで示し、シルエットでは対応する密度を示します。 b PsaCのGln15周囲およびFdのCys45、Phe64、およびTyr97との相互作用のハブ。これらの残基は、Fd 還元時に構造変化を受けます。紫色のリボンの PsaC、シアン色のリボンの Fd、およびボール内の相互作用残基側鎖原子と、シルエット内の対応する密度を示します。界面水２０５は赤いボールとして示されている。 PSI の鉄硫黄クラスター FB と Fd のガリウム硫黄クラスターは、ボールとスティックの形式で示されています。

PSIとFd間の複合体形成時の動的な構造変化を視覚化するために、PyMOL分子グラフィックスシステム（バージョン2.3.2、Schrödinger,LLC）上で実行されるPythonスクリプト「modevectors」を使用しました。図6では、Fd結合前（PDB ID：1JB0）とFd結合後（現在の研究、PDB ID：7FIX）のPSIの原子モデルが、安定なPsaA/PsaBヘテロ二量体のα炭素の位置に基づいて重ねられています。 1 つのプロトマーについて、複合体形成前後の 0.7 Å を超えるα炭素の置換が矢印で強調表示されています。個々の側鎖がPSIまたはFdのX線構造の結晶パッキングに関与している可能性があるため、比較のために意図的に主鎖構造のα-炭素の位置を使用し、側鎖のないCα-バトンモデルを図6に示しました。この分析は、Fd 結合と Cyt c6 の存在によって引き起こされる摂動が間質側に限定されず、内腔側にも伝播することを示しています。 α炭素における>0.7Åの変位を表示することによって、複雑な構造のFdの原子モデル（PDB ID：7FIX）を遊離Fdの原子モデル（PDB ID：5AUI27）と比較すると（図6c）、次のことがわかりました。クラスターの近位領域は乱されないままであるが、3 つの遠位領域 (点線の円内) は PSI への結合後に構造変化を受けたことがわかります。

a、b、d Fd 結合は、3 つの異なる観点から 1 つの PSI プロトマーの構造変位を引き起こしました。 Fd フリー PSI の原子モデル (PDB ID: 1JB04) を、PsaA/PsaB ヘテロ二量体の Cα バックボーン座標に基づいて PSI:Fd のモデル (PDB ID: 7FIX) と重ね合わせました。赤い矢印は 0.7 Å を超える変位を表します。 c 遊離状態およびPSI結合状態でのFdsの構造変位。非結合 Fd の原子モデル (PDB ID: 5AUI27、オレンジ色) と PSI 結合 Fd (シアン色) を重ね合わせました。赤い矢印は、0.7 Åを超える主鎖変位を強調表示します。

等温滴定熱量測定 (ITC) 測定を実行して、Ga-Fd と PSI 三量体の間の相互作用の熱力学パラメーターを取得しました。遊離界面活性剤ミセルによる ITC 測定への潜在的な干渉を避けるため 41、PSI 三量体サンプルは、単粒子クライオ EM の場合と同様に、GraDeR34 アプローチを使用して調製されました。 ITC サーモグラム、Ga-Fd と PSI 三量体の相互作用の結合等温線、および熱力学的パラメーターの代表的な結果を図 7 および表 1 に示します。ITC 分析は、結合化学量論値が ~3 (2.9 ± 0.2) であることを示しています。、Fd が各 PSI プロトマーに 1:1 の比率で結合していることを示します。これは、当社のクライオ EM 密度マップと一致しています。 Kd 値はサブマイクロモルのオーダー (758.0 ± 123.5 nM) であり、Ga-Fd と PSI の間のタンパク質間親和性が強いことを示唆しています。 Ga-FdからPSI三量体への一連の滴定により、正のITCピークが生成され、その後徐々に飽和が生じました（図7a）。これは、Ga-FdとPSIの間の吸熱分子間相互作用を示しています。全体として、Fd-PSI 相互作用は、熱力学的に不利な正の ΔH (1.1 ± 0.1 kcal/mol) 値と、より強力で有利な正の TΔS (9.5 ± 0.1 kcal/mol) 値を示し、複合体形成がエントロピー駆動であることを示しています。

a ITC サーモグラムの代表的な結果、b 1 セットの部位を使用してフィッティングした結合等温線。

PSI:Fd 複合体のクライオ EM 構造は、全体の解像度 1.97 Å で厳密な 3 回回転対称の密度マップに基づいています。分離能の向上は、次の 4 つの要因の結果である可能性があります: (i) 高濃度での PSI 調製物の卓越した純度と均一性、(ii) 一時的な PSI:Fd 電子伝達複合体の厳密に制御された酸化還元状態、および Cyt c6 の存在 ( iii) GraDeR 法を使用した最適化された膜タンパク質複合体の調製、および (iv) 冷磁場放出銃、カラム内 Ω エネルギーフィルター、および K3 直接検出カメラを備えた高度なクライオ電子顕微鏡 CRYO ARM 300 の使用 (チョル、ガタン)。高解像度クライオEMマップからの注目すべき発見の1つは、各PSIプロトマー間のいくつかの棒状の密度の視覚化であり（図1bおよび補足図5）、脂質テールの安定かつ特異的なパッキングを示しています。チラコイド膜には PG、MGDG、DGDG、SQDG42 などのさまざまな脂質が含まれていますが、元の 2.5 Å X 線構造 4 には、主要サブユニット PsaA および PsaB に内部結合している 3 つのリン脂質と 1 つのガラクト脂質のみが記載されていました。クロロフィルフィトール鎖と明確に区別できなかったり、短すぎたり、膜面に垂直でなかったりする曖昧な密度を除外したにもかかわらず、合計17個の新たに同定された脂肪酸尾部が我々の構造内で発見された。これらの新たに発見されたプロトマー間脂質は、その可動性を示すヘッドグループ密度が欠落しているため、特定のタイプに割り当てられませんでした。目に見える脂肪酸尾部は疎水性アミノ酸残基およびアンテナリガンド (クロロフィルおよびカロテノイド) にしっかりと結合しており、PSI の三量体化の安定化におけるそれらの潜在的な機能を示唆しています。これらの発見は、構造分析と生化学分析によって決定された関連脂質の数間の不一致を説明します 43。実際、我々の発見は、オリゴマーPSIの安定した形成を可能にし、特にプロトマー間領域で突出するアンテナリガンドを収容するために、プロトマー界面を構造的に引き締める脂質のさらなる機能を示唆している。現在まで、これらの側面は PSII2, 44 の構造についてのみ詳細に検討されてきました。

ここでは、酸化 Fd および還元 Cyt c6 の存在下でのシアノバクテリア PSI の高解像度クライオ EM 構造について説明します。構造決定用のサンプルは、架橋結合を行わずに 3 つのタンパク質を混合し、クライオグリッド調製前に暗所で短時間インキュベートするだけで調製されました。さらに、野生型酸化型 Fd と構造的に同一であるが還元できないガリウム置換 Fd (Ga-Fd) を使用しました 27, 45。 PSI のアクセプター側で均一な酸化還元状態が得られるため、予期せぬ酸化還元反応の可能性が排除されます。光吸収によって引き起こされる Fd と PSI の間。したがって、錯体の酸化還元状態は、PSI から Fd に電子が移動する直前の PSI の酸化還元状態でした。この研究では、弱いが、3 つの PSI プロトマーすべてについて、Cyt c6 に割り当てられた PsaF の N 末端領域の近くに同じ位置にある余分な密度を視覚化できました（補足図 4b、c）。クライオEM構造のde novo 3D初期モデル（補足図2e）。局所分解能が非常に低いのは、クライオグリッドの調製に使用される混合物中の化学量論が 1.0:0.4 (PSI:Cyt c6) であるためである可能性があります。しかし、還元緩衝液条件下および架橋剤の存在下で、はるかに高い PSI:Cyt c6 化学量論比 1:10 で T. elongatus PSI 三量体に結合した Cyt c6 を可視化しようとして失敗したが、これは、Cyt c6 の化学量論および酸化還元状態が、サンプルバッファーだけでは、ここで検出された超過光束密度の唯一のノイズに近いレベルを説明するには十分ではない可能性があります。

驚くべきことに、Cyt c6はPSIにおけるP700の一次電子受容体の近く（P700からCyt c6までの中心間距離約55Å）の近くではなく、生産的な電子移動を妨げるのに十分な距離にあることが発見された。局所的な解像度の欠如によりCyt c6の方向を決定することはできなかったが、この部位自体は、最近報告されたPSI:Pc構造で可視化されたプラストシアニンの結合部位とは明らかに異なる、Cyt c6の生理学的に関連する二次結合部位であると我々は考えている(PDB) ID:6ZOO31）。 PSI:Pc の構造では、Pc は PsaA および PsaB サブユニットによって作られた疎水性表面に結合することが判明し、液胞植物に特異的な PsaF の N 末端伸長により、生産的な電子伝達に十分近い P700 付近に Pc が配置されました。シアノバクテリアには生産的な Pc/Cyt c6 結合のための PsaF サブユニットの N 末端伸長部分が含まれていないため 46、シアノバクテリアの Cyt c6 が高等植物と同様の位置に結合する可能性は低いと考えられます。 Cyt c6 が結合した PSI を架橋結合によって可視化するという以前の試みは失敗しており 32、我々の知る限りでは、我々の研究における Cyt c6 のクライオ EM 密度は、この末梢の非生産部位で PSI に結合した Cyt c6 を実験的に可視化した最初の例である。

この新しく発見された Cyt c6 結合部位の生理学的機能は何でしょうか? Cyt c6 結合部位は、生産的な Pc/Cyt c6 結合部位とは明らかに異なります。緑藻および高等植物からの電子伝達速度論分析の結果は、二相性の特徴を示しました 46, 47。遅い段階は、内腔空間内の PSI 反応中心への Pc/Cyt c6 の拡散時間に関与します。この二相反応速度の構造的基礎は、緑藻の PsaF の Lys に富んだ N 末端伸長に割り当てられました 46。最近、Chlamydomonas reinhardtii 由来の PSI の低温 EM 構造は、複合体の内腔側に余分な密度を示し、これは Pc48 の非生産的な結合を示唆しています。この追加領域は電子供与体タンパク質に静電相互作用部位を提供し、電子供与体タンパク質を P700 反応中心に導く上で重要な役割を果たします。不均一な架橋結合の結果と速度論的特徴は、生産的結合部位と非生産的結合部位の両方の存在を示しました 49。クラミドモナス・ラインハルティで実施された架橋試験50でも同様の結果が得られました。具体的には、Cyt c6 の 33% のみが P700 への高速電子移動を実行しましたが、残りの 67% の不活性な架橋は潜在的な追加の結合部位の存在を示していました。このような非生産的な結合部位は、電子移動するには P700 から遠すぎる可能性がありますが、それでも、電子供与体の継続的な高速供給が保証されます。ここで視覚化された Cyt c6 結合部位の考えられる機能は、維管束植物で見られるものと類似した、非生産的な結合部位である可能性があります。

シアノバクテリアの PsaF には緑藻や高等植物の PsaF に見られる N 末端伸長が含まれていないため、シアノバクテリアにおける二相反応の存在については議論がありました 12。しかし、最近、Synechocystis sp.からのPSIに関するin vivo P700還元動態研究が行われた。 PCC6803 は、緑藻や高等植物と同様の運動学的特徴を示しました 51。この二相反応は、シアノバクテリア PSI の内腔側における電子供与体 (Pc および Cyt c6) の非生産的な結合の結果である可能性があります。シアノバクテリアの PsaF には伸長がないため、Cyt c6 結合は特異的だが柔軟になっている可能性があり、これにより、密度マップにおける Cyt c6 の解像度の限界についてさらなる説明が得られる可能性があります。この提案は、クラミドモナス PSI48 の非生産部位における結合 Pc の局所分解能が低いことと一致しています。また、これは、T. elongatus PSI に関する Kölsch らによる以前のクライオ EM 研究 32 において、マスクされた 3D 精密化と組み合わせた PSI と Cyt c6 の架橋が関連領域で潜在的な Cyt c6 様密度を特定できなかった理由を合理化する可能性があります。 Cyt c6対PSIのはるかに高い化学量論(10:1)が使用されているにもかかわらず、PSI管腔側で。したがって、Kölsch et al.32 による研究と私たちの研究との明らかな違いの 1 つは、Ga-Fd の追加であると推測されます。これは、PSI の間質側の電子受容体 (我々の場合は Fd) の結合状態が、内腔側の電子供与体タンパク質 (我々の場合は Cyt c6) の結合にとって重要であり、その結果として重要である可能性があることを示唆しています。それを視覚化する能力。したがって、PSI の間質側の電子伝達状態は、構造変化に基づく膜貫通シグナル伝達を介して内腔側の電子供与体の結合モードに影響を与える可能性があります。高占有率での Cyt c6 の特異的結合の最適化に特に焦点を当てた今後の研究により、シアノバクテリアの PSI 媒介電子伝達のこれらの側面が解明されることが期待されます。

Fd の PSI への結合は、間質サブユニットの突然変異誘発によって詳細に研究されています。これらの研究により、高速なタンパク質間の電子伝達を可能にする相互作用に関与する重要な残基が特定されました（補足表2にまとめられています）。私たちの原子モデルは、これらの重要なアミノ酸残基が果たす重要な役割の構造的基礎を提供し、それらの突然変異の影響を説明することができます。 PsaE上のFd結合界面では、グルタミンへの変異によりFd結合が完全に破壊されるArg3952の以前に確立された重要な相互作用が、現在ではAsp27との静電相互作用およびFdのTyr24およびArg41との疎水性相互作用によって合理化されている（図5aおよび図5a）。補足図7c)。 PsaCとの界面では、Lys34はFdのPhe38と疎水性相互作用に関与しており、これはPsaC K34D変異体25、53が重要なカチオン-π相互作用を形成できず、高速電子伝達を完全に妨害することができないことを説明している（図5a）。さらに、鉄硫黄クラスターFB近くのPsaCのFd結合界面では、Gln15はAla44、Cy45、Phe64と広範な直接相互作用を示し、また水分子HOH205を介して間接的にTyr97とも相互作用します（図5b）。 Fd54の効率的な結合のための2つの重要な相互作用パッチのうちの1つとして同定されました（図5）。

PSIを介した電子伝達における重要な疑問は、結合したFdが電子を受け取った後、どのようにしてPSI結合部位から迅速に解離するのかということである。酸化および還元状態のアナベナ Fd の高分解能 X 線結晶構造 55 は、還元時の主な構造変化が Cys45 と Ser46 (T. elongatus の番号付け) の間のペプチド結合の反転、側鎖のシフトを伴うことを示唆しました。 Phe64 の動きと C 末端 Tyr97 の側鎖の動き。 PsaCのGln15を中心とする我々の構造で視覚化されたPSIとFdの間の相互作用の関係は、これらの還元誘発性の立体構造変化によって破壊されます（図5b）。ペプチド面の反転自体が Fd-Cys45 と PsaC-Gln15 の間の相互作用を破壊し、その結果生じる Phe64 のシフトも Gln15 との相互作用を妨害する可能性があります。最後に、C 末端 Tyr97 の移動により、Gln15 に関連する水を介した水素結合が外される可能性があります。 Gln15 によって形成される相互作用のハブを失うことによるエンタルピーエネルギーのコストは、エネルギーバランスを解離方向にシフトさせるのに十分である可能性があります。したがって、タンパク質間の電子移動に関与する鉄硫黄クラスターのすぐ近くにあるPSI:Fd界面の我々の構造は、PSIからのFdの電子移動誘起解離のメカニズムを説明する説得力のあるシナリオを提供する。

この研究では、モデリングと改良のための開始基準として、野生型 PSI (PDB ID: 1JB04) と T. elongatus BP-1 由来の野生型 Fd (PDB ID: 5AUI27) の結晶構造を使用しました。解像度 4.2 Å の X 線結晶構造解析および NMR (PDB ID: 5FZ0、BMRB:11596、図 1) による以前の分析 24 と比較して、解像度の大幅な向上に起因するいくつかの違いが見つかりましたが、相互作用する残基の観察された違いはFd と PSI の間はわずかであり、以前の解釈と一致します。ここで、Fd と PSI の相互作用の割り当てに側鎖情報を初めて組み込むことができました。 PSI:Fd複合体の以前のX線構造では、PsaDはFdと相互作用しないと結論付けましたが、この観察はSynechocystis PSI56における部位特異的突然変異誘発の結果と矛盾しました。しかし、我々の更新された高解像度クライオ EM 構造は、PsaD と強結合 Fd の間に相互作用がないことを強く裏付けています。 PSI:Fd複合体のX線結晶構造に基づいて、我々は以前、シアノバクテリアのPsaFがFd結合によって活性化される膜貫通シグナルトランスデューサーとして機能できることを提案しました24。観察された構造変化はほんのわずかですが、この研究では結晶学的隣接物との格子接触が存在しないため、間質側と内腔側の両方でFd結合時およびCyt c6の存在下でのPSIの構造変化も視覚化されました（図6）。、小さな膜貫通構造の変化がFdの管腔側への結合を示す可能性があるという以前のX線結晶構造に基づく提案を支持しています。ここで検出された構造変化の生理学的関連性は確認できませんが、PSI を介した電子伝達の調整のための膜貫通リレーシステムのアイデアは依然として魅力的です。

驚くべきことに、FdとPSIの間の水素結合を媒介する6つの水分子が構造内で視覚化できます（図3および補足図7）。複合体形成の前に、Fd と PSI の間質サブユニットの両方が溶媒によって完全に水和されている必要があります。 FdとPSIの間に特異的な電子伝達複合体を形成した後、残りの6つの水分子を除く水和殻からの水分子を界面から排除する必要があります。水和水分子を含む PSI と Fd の複合体形成に関する熱力学的洞察を得るために、ITC 測定が実行されました。熱力学パラメーターの分析に基づくと、Fd:PSI 複合体の形成は Fd:FNR57 および Fd:GmHO58 タイプ (ΔH > 0 および ΔS > 0) の形成と類似していますが、Fd:SiR タイプの形成とは類似していません 59 (ΔH < 0 および ΔS > 0)。 Fd とそのパートナータンパク質 (この場合は PSI) の結合は、完全にエントロピーによって駆動されているようです。魅力的な静電相互作用、極性相互作用、およびファンデルワールス力による相互作用は、負の ΔH (ΔH < 0) に寄与する可能性がありますが、Fd と PSI の複合体形成のために界面に結合している水分子の剥離は、正の値を与えるために熱力学的にコストがかかります。 Fd:FNR 複合体形成でも観察されるように、正味の ΔH (ΔH > 0) については 57, 60。それにもかかわらず、界面からの水分子の移動に伴う立体構造の乱れは、それに伴うエントロピーの増加により、複合体形成をエネルギー的に有利にする可能性があります。 ITC 分析では、Ga-Fd と PSI 間の強力なタンパク質間親和性が約 0.8 μM の Kd 値で示されており、これはフラッシュ吸収分光法で測定したネイティブ Fd の PSI に対する親和性と密接に一致しています 24。最後に、ITC 測定結果に基づいて計算された結合化学量論 (n 値) は約 3 でした。これは、溶液中で 1 つの Ga-Fd が 1 つの PSI プロトマーに結合することを意味します。これは、クライオ EM 構造の結果と一致しています。

反応速度論的解析と最新の構造研究に基づいて、我々は以下の 5 つのステップを含む電子伝達錯体形成のメカニズムを提案します (図 8 の漫画も参照)。 (i) Fd と Cyt c6 は、電子移動前は最初は結合していない自由状態にあります (図 8a)。 (ii) PSI 内で光による電荷分離現象が起こると、酸化された Fd が PSI に近づき、基質側で結合して励起された電子を受け取ります。 Fdの結合によって引き起こされるPSI内の微細な構造変化は、Cyt c6を非生産的結合部位にリクルートするために管腔側に伝達される（図8b）。 Cyt c6 に対する非生産的結合部位の親和性を高めると、FA および FB が還元状態にあるときに PSI 反応中心が過剰な還元から保護される可能性があります。 (iii) PSI は Fd を減少させます (注、我々の構造では Ga-Fd は還元できないため、Fd は PSI に結合したままとなり、Cyt c6 は非生産部位で結合したままになります (図 8c))。（iv）Fdが励起電子によって還元され、PSIから離れると、Cyt c6はその後の電子移動のためにP700近位の生産結合部位に移動します（図8d）。 (v) 最後に、酸化された Cyt c6 が PSI から分離し、別のラウンドの電子移動反応が始まります。

a 還元された Cyt c6 と酸化された Fd は、結合していない遊離状態にあります。 b 膜を横切る光誘起電荷分離により、酸化された Fd が間質側に結合し、内腔側に Cyt c6 の非生産的なドッキングサイトが開きます。ピンクのハート型の記号は活性化された結合部位を表し、「閉鎖」交通標識は閉鎖された反応中心を表します。 c Cyt c6は内腔の非生産性ドッキング部位に結合しているが、永久酸化Ga-Fdは間質側で結合したままであり、破線枠はこの研究で決定された構造を示している。 d 励起された電子は可溶性キャリア Fd とともに PSI を離れ、還元された Cyt c6 は電子移動とその後の PSI からの分離のために生産的な P700* 近位結合部位に移動しました。

要約すると、PSI は反応中心への 2 種類の Pc または Cyt c6 結合機構に関与していると考えられます。 1つのメカニズムには、Chlamydomonas reinhardtiiで観察されるように、PsaFのN末端伸長部へのPcの「事前結合」が含まれる。別のメカニズムには、シアノバクテリアにおける効率的な電子伝達を促進するために、Fd 結合によって誘導される「非生産的」結合が含まれます。これらのリクルート機構はさらに進化して、緑藻や維管束植物の P700 への効率的かつ堅牢な電子伝達の基礎を提供した可能性があります。

PsaF サブユニット上の N 末端 His10 タグと選択マーカーとしてのクロラムフェニコール耐性遺伝子で遺伝子改変された Thermosynechococcus elongatus BP-1 変異株の好熱性シアノバクテリアを照明下で培養し、両方の PSI 三量体を精製しました。そしてCyt c6。培養は、以前に記載されているように、BG11培地中で50℃、30μM光子m-2s-1の連続照明下で実施されました61。 OD730 nm 吸光度が値 1 に達したときに、合計 16 L の培養物を収集しました。 His タグ付き PSI 三量体は、Kubota et al.43 によって記載されている方法論を使用し、下記のように若干の変更を加えてチラコイド膜から精製されました。

採取した細胞を遠心分離 (8000 × g、4 °C で 2 分間、JLA 9.1000 ローター、Avanti™ HP-26XP) によって濃縮し、50 mM MES (pH 6.5)、25% グリセロール、20 mM CaCl2 および 20 mM CaCl2 を含む緩衝液 A に再懸濁しました。 20 mM MgCl2。その後、-80 °C で凍結保存するか、前述のように細胞破壊にすぐに使用します62。細胞を新たに調製した予冷したバッファー B (バッファー A と同じ成分に 1 mM ベンズアミジン、1 mM 6-アミノヘキサン酸、エタノールに可溶化した 1 mM PMSF、および 1 mM DNase I を加えたもの) 中で破壊し、チラコイド膜を破砕しました。超遠心分離 (40,000 × g、4 °C で 30 分間、P50AT2 ローター、HITACHI himac CP80WX) により可溶性細胞内容物から分離しました。

チラコイド膜をクロロフィル濃度 1 mg/mL で緩衝液 A に再懸濁し、続いて 10% β-DDM ストック溶液を β-DDM の濃度が 1% に達するまで滴下添加しました。次いで、混合物を暗所で４℃で穏やかに撹拌しながら４５分間インキュベートした。膜可溶化後、不溶性内容物を超遠心分離（50,000 × g、4 °C で 30 分間、P50AT2 ローター、HITACHI hismac CP80WX）によって除去し、上清を Ni-NTA Sepharose（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を備えたオープンカラムにアプライしました。。２０ｍＭＭＥＳ（ｐＨ６．５）、２０ｍＭＣａＣｌ２、２０ｍＭＭｇＣｌ２、０．０５％ β－ＤＤＭ、および１００ｍＭイミダゾールを含む緩衝液Ｃを使用して、ＰＳＩ三量体をカラムから溶出した。溶出した PSI 三量体を、3000 × g、4°C での限外濾過 (Amicon15 限外濾過チューブ、100 kDa MWCO; Amicon、マイアミ、フロリダ州、米国) によって最終クロロフィル濃度約 10 mg/mL まで濃縮しました。

GraDeR34 アプローチは、界面活性剤 β-DDM をグリコジオスゲニン (GDN) に交換し、過剰な遊離界面活性剤を除去するために適用されました。これを達成するために、下から上にショ糖濃度 1.7 M、1.3 M、0.9 M、0.5 M、0.1 M、GDN 0.1%、0.05%、0.03%、0.01%、および 0.1% でショ糖ステップ勾配を調製しました。下から上まで 0.005%。ショ糖密度勾配遠心分離（25,000×g、4℃で20時間、P28Sローター、HITACHI hismac CP80WX、結果は補足図1aを参照）後、対応するバンドからPSI三量体を収集し、脱塩カラム（PD-10、 GE Healthcare（米国イリノイ州シカゴ））をスクロースの除去と緩衝液交換に使用しました。最終的な PSI 三量体をバッファー D (10 mM トリシン、pH 8.0、10 mM MgCl2、および 0.005% GDN) 中でクロロフィル濃度 10 mg/mL まで濃縮し、記載されているようにネガティブ染色電子顕微鏡を使用して純度、安定性、および単分散性を検査しました。下に。最終的な PSI 三量体サンプルは、疎光性 EP チューブを使用して 10 μL ずつ液体窒素中で急速冷凍し、さらに使用するまで -80 °C で保存しました。 PSI三量体のタンパク質濃度は、CPro/CChl=3.92のクロロフィル含有比に基づいて決定した。

PSI タンパク質サンプルの品質は、ネガティブ染色によって評価されました。最終サンプルのアリコート 3.5 μL を 1/100 に希釈し、グロー放電 (5 mA、10 秒、エイコー) 連続炭素膜コーティング銅グリッド (日新 EM、東京、日本) に適用しました。染色は、3.5μLの2%酢酸ウラニル溶液を適用することによって実施した。 30秒間のインキュベーション後、濾紙(Whatman #1; Whatman、Little Chalfont、UK)を使用して染色溶液を吸い取り、室温で乾燥させた。 EM グリッドは、1× 1K Tietz FastScan-F114 CCD カメラを備えた H-7650 HITACHI 透過型電子顕微鏡を 80 kV の加速電圧で使用して検査しました。三量体PSI粒子の典型的なネガティブ染色顕微鏡写真を補足図1bに示します。

上記のように T. elongatus BP-1 細胞を破砕し、超遠心分離して得た上清を、いくつかの修正を加えた以前の精製方法 63 に基づいて Cyt c6 の単離に利用しました。飽和が 45% に達するまで、固体の硫酸アンモニウム (AS) を 25 °C で上清に徐々に添加しました。 25℃で45分間撹拌した後、沈殿を遠心分離(9500×g、25℃で30分、JLA 9.1000ローター、Avanti™ HP-26XP)により除去した。得られた上清を、高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステム (FPLC、ÄKTA エクスプローラー) を使用して、10 mM トリシン (pH 7.5) および 45% AS を含む緩衝液であらかじめ平衡化した疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム (HiTrap® Phenyl HP) にロードしました。 Cyt c6 を含む画分は、AS 濃度を約 20% に下げることによって溶出されました。カラム媒介脱塩 (PD-10、GE Healthcare) 後、画分を 10 mM トリシン (pH 7.5) および 10 mM NaCl を含む緩衝液に交換し、あらかじめ平衡化した陰イオン交換カラム (HiTrap® Q HP) にロードしました。同じバッファです。 NaCl濃度を約100mMまで増加させることによって結合タンパク質を溶出し、ピンク色の画分をプールした。次に、プールしたサンプルを、30 mM トリシン (pH 8.0) および 10 mM MgCl2 を含むランニングバッファーを使用する最終ゲル濾過クロマトグラフィー工程 (Superose® 75 16/60) に供しました。サンプルの品質と酸化還元状態は、以前に公開されたプロトコル 64 に基づいて OD553nm/OD273nm 吸光度比を測定することによって評価され、吸光度特性は UV-Vis 吸光度分光法によって特性評価されました。濃いピンク色と 553 nm での特徴的な吸収ピークは、還元された Cyt c6 の以前の分光分析結果 65 と比較した場合、精製された Cyt c6 の還元状態を証明しました。精製されたCyt c6のSDS-PAGE分析を補足図1cに示します。

天然の T. elongatus BP-1 フェレドキシン (Fd) をコードする DNA 断片を、NcoI-BamHI 制限部位を使用して pET28a ベクター (Novagen, Madison, WI, USA) にクローニングし、Luria で培養した大腸菌株 BL21(DE3) を使用して発現させました。・ベルターニ(LB)ミディアム。 Fd の精製とその後のその天然 [2Fe-2S] クラスターの酸化還元不活性 [2Ga-2S] クラスターによる置換は、前述のように実行されました 27。簡単に説明すると、細胞を遠心分離によって回収し、50 mM Tris (pH 7.5) および 10% グリセロールを含む緩衝液に再懸濁しました。超音波処理による細胞破壊後、得られたライセートを 45,000 rpm、4 °C で 30 分間遠心分離し (P45AT ローター、Hitachi CP80WX)、得られた上清を陰イオン交換セルロースカラム (DE52、Whatman) にロードしました。 Fdを含む赤色画分を、50 mM Tris (pH 7.5)および500 mM NaClを含む緩衝液を使用して溶出し、50 mM Tris (pH 7.5)および50 mM NaClを含む緩衝液3 Lに対して4℃で一晩透析した。次に透析液を、50 mM Tris (pH 7.5) を含む緩衝液中の HiTrap Q HP カラム (GE Healthcare) に適用し、NaCl 直線勾配 (0 ～ 1 M NaCl) を使用して溶出しました。続いて硫安沈殿のため、プールした画分に100%飽和AS緩衝液（50mM Tris（pH7.5）を1：1で加えた。沈殿物は遠心分離（8000×g、TOMY）して廃棄した。最終的にサンプルを供試した。バッファー A (50 mM トリス pH 7.5、40% 飽和硫酸アンモニウム) で平衡化したフェニルセファロースカラム (GE Healthcare) を使用した疎水性相互作用クロマトグラフィーに、0 ～ 100% バッファー B (50 mM トリス pH) の直線勾配を使用して溶出を実行しました。 7.5) と赤色の画分を収集しました。

ガリウム置換の場合、6 M の濃度の塩化水素 (HCl) を最終濃度 1 M HCl まで添加することにより、45 mg の Fd を変性させました。濁った溶液をペレット化し（10分間、RTで10,000×g、TOMYの遠心分離機）、白色沈殿を直ちにMilli-Q水ですすぎ、続いて100 mM Trisを含む緩衝液（pH 8.0）に再懸濁した。 Fd からすべての鉄原子を確実に除去するために、上記の手順を 2 回繰り返しました。最終的なタンパク質沈殿物を、嫌気性環境下で、100 mM Tris (pH 8.0)、6 M 塩酸グアニジン、および 10 mM ジチオスレイトールを含む緩衝液に再懸濁しました。

変性 Fd をリフォールディングバッファー (2 mM GaCl3、2 mM Na2S、2 mM DTT、および 20 mM Tris、pH 8.0) で希釈することにより 4 °C でリフォールディングし、嫌気条件下 4 °C で一晩インキュベートしました。リフォールディングされたＧａ－Ｆｄを、２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中の０～１ＭＮａＣｌの溶出勾配を使用するＨｉＴｒａｐ－Ｑカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質の溶出プロファイルは、280 nm での吸光度によってモニタリングされました。 Ga-Fd を含む溶出画分を収集し、スイングアウトローター (2000 × g、4 °C) で遠心分離した 10 kDa カットオフの Amicon Ultra-15 ユニットを使用した限外濾過によって濃縮しました。次いで、濃縮サンプルを、１００ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）中で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５１６／６０カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、同じ緩衝液中０．５ｍｌ／分の流速でロードした。 Ga-Fd を含む画分を 280 nm の吸光度で検出し、最終的なサイズ排除クロマトグラフィーのステップに供しました。天然の Fd および Ga-Fd の濃度は、それぞれ ε422 = 9.68 mM/cm および ε280 = 170.2 mM/cm のモル吸光係数から計算されました 27。 Ga-Fd の純度は、補足図 1d に示すように、SDS-PAGE 分析によって評価されました。

すべての ITC 測定は、MicroCal PEAQ-ITC 装置 (Malvern Panalytical、英国) を使用して 25 °C で実行されました。シリンジ内のGa-Fdおよびセル内のPSI三量体の濃度は、それぞれ600μMおよび11μMであった。 PD-10 カラム (GE Healthcare Life Sciences) を使用して、すべてのタンパク質溶液を 10 mM MgCl2、50 mM NaCl、0.005% GDN を含む 30 mM Tricine-NaOH 緩衝液 (pH 8.0) に緩衝液交換し、気泡を除去しました。 ITC の前に 10,000 × g で 5 分間遠心分離します。次の ITC パラメーターが使用されました:滴定、19 回の注入。初期遅延、60 秒。間隔時間、180秒。基準電力、10 μcal/秒。撹拌速度は７５０ｒｐｍ。注入量は、最初の注入では 0.4 μL、残りの注入では 2 μL でした。希釈熱は、シリンジ内の 600 μM Ga 置換 Fd を緩衝液のみで満たされたサンプルセルに滴定することによって測定されました。熱流および結合等温線は、希釈熱を差し引くことによって計算されました。データは、MicroCal PEAQ-ITC 分析ソフトウェアに組み込まれた 1 セットの部位結合モデルに適合されました。熱力学パラメータは、3 つの独立した ITC 実験から得られた平均値 ± SEM として示されています。

タンパク質濃度 37 μM (40 mg/mL) の精製 PSI トリマー合計 10 μL、濃度 400 μM (4.4 mg/mL) の精製 Ga-Fd 1 μL、および精製 Cyt c6 2 μL濃度７５μＭ（０．７５ｍｇ／ｍＬ）のＰＳＩ三量体を氷温で最終濃度３０ｍｇ／ｍＬのＰＳＩ三量体まで混合した。暗所の氷上で 2 時間インキュベートした後、2.6 μL のアリコートをグロー放電 (JEC-3000 FC、30 秒、カーボン支持フィルムを上に向けた) Quantifoil クライオ EM グリッド (R 1.2/1.3 Cu 300) に適用しました。メッシュ) を使用し、Whatman #1 濾紙を装着した Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して、ブロッティング用に 4 °C、湿度 100%、ブロット力 0 で 3.5 秒間、液体エタン中で急速凍結させます。グリッドは保管のために液体窒素に移されました。スクリーニングは、200 kV で動作する Talos Arctica (Thermo Fisher Scientific) 透過型クライオ電子顕微鏡を使用して実行されました。適切な粒子分布と氷の厚さを示すクライオグリッドが Talos Arctica から取り出され、さらに高解像度データ収集に使用されました。

オートグリッドアダプターカートリッジ (JEOL、東京、日本) を使用して、オートグリッド (Thermo Fisher Scientific) としてクリップされた単一の事前にスクリーニングされたクライオグリッドを、操作可能な CRYO ARM 300 (JEOL) 透過型クライオ電子顕微鏡に移しました。 300 kV で、冷陰極電界放射ガンとカラム内 Ω フィルターが装備されています。画像取得は、明視野イメージングモードでフラッドビーム平行照明を使用して実行されました。動画は、イメージシフト (ステージ位置ごとに 5 × 5 穴) と K3 直接検出カメラ (Gatan、AMETEK、プレザントン、カリフォルニア州、米国) を CDS モードで使用し、カメラレベルで公称倍率 × 60,000 で SerialEM によって自動的に記録されました。これは、3 秒の露光時間で 48 フレームのピクセルサイズ 0.806 Å に相当し、総線量は 48 e-/Å2 になります。合計 3018 個のムービーが、-0.5 μm ～ -1.5 μm のデフォーカス範囲内で連続して収集されました。タンパク質複合体の典型的な顕微鏡写真と角度分布を補足図に示します。それぞれ2bと3b。

すべての画像処理は、2 つの GPU を搭載したローカル GPU ワークステーション上で RELION 3.1 と UCSF CHIMERA66 を使用して実行されました (ワークフローについては補足図 2a を参照)。合計 3018 本のムービーが 6 つのグループに分割され、Relion に実装された MotionCor267 アルゴリズムによって線量加重モーション補正が実行されました。動きを補正した各ムービーについて、CTFFIND468 を使用してコントラスト伝達関数 (CTF) を推定しました。 CTF推定後、推定解像度が5Åより高く、良好なトーンリング（補足図2c）を持つ1959本の映画がさらなる処理のために保存されました。初期モデルのデノボ構築では、ガウスのラプラシアン法を使用して、500 のムービーグループの 1 つから 40,483 個の粒子が自動的に選択されました。選択された粒子は、リファレンスフリーの 2D 分類を 1 回実行され、最良の 2D クラスの 30,580 個の粒子を使用して初期モデルが計算されました。補足の図 2e は、4 つの異なるしきい値での初期モデルの等値面の視覚化を示しています。 6 つのグループすべてのムービーの自動選択は、初期モデルを 3D リファレンスとして使用して実行されました。すべての映画から合計 511,737 個の粒子が抽出され、映画の各グループごとに抽出された粒子に対して 2D 分類が実行されました。合計 366,174 個の粒子を含む良好な 2D クラス (補足図 2d) が選択され、プールされ、3D 分類に使用されました。すべての粒子の56.6%（207,142粒子）を表す補足図2fの赤いキャプションで示される最高の3Dクラスの粒子が、標準の自動リファインメントを使用して3D再構築のために選択されました。その後、マップ全体の解像度がそれ以上向上しなくなるまで、CTF 改良とベイジアン研磨が数回実行されました。標準的な後処理手順に従って、マスクされた最終マップの推定解像度は、対称性を適用しない場合 (C1) で 2.06 Å、対称性を適用する場合 (C3) で 1.97 Å となりました。構造的特徴に関して、C1 マップと C3 マップの間に明らかな違いは観察されませんでした。 C3 対称マップは、より優れたオイラー角分布を示し、ノイズのレベルが低下したため、モデルの構築に使用されました。 C3対称マップの局所解像度分布（補足図4a）は、RELIONを使用して計算されました。

Coot69、Phenix、MolProbity70、および UCSF Chimera66 は、モデルの構築と実空間の改良に使用されました。 2.5 Å の解像度で決定された Synechococcus elongatus PSI 三量体の X 線結晶構造 (PDB ID: 1JB04) と 1.5 Å の解像度で決定された T. elongatus BP-1 フェレドキシンの X 線結晶構造 (PDB ID: 5AUI27) は、 UCSF Chimera 1.13.1 で手動フィッティングした後、Phenix 1.19.2 で実空間リファインメントの開始モデルとして使用されます。 Coot 0.9.5 は、実空間リファインされたモデルにおける回転異性体、幾何学、およびラマチャンドラン外れ値の手動補正と最小化に使用されました。正確な非金属リガンド拘束ファイルは Grade Server (http://grade.globalphasing.org) からダウンロードされ、精製中に利用されました。塩素環面の両側に観察されたマグネシウムの存在を説明するために、クロロフィル (CLA および CL0) の拘束におけるマグネシウム結合面のキラリティー制限を削除して、密度マップ内で合理的にフィッティングできるようにしました。さらに、菱形形状を使用した新しい鉄硫黄クラスター拘束 71 が、鉄硫黄クラスター (SF4) の精製に適用されました。新しく変更された拘束ファイルは、モデルとともに wwPDB 寄託サイトにアップロードされました。すべての図のマップとモデルの視覚化は、PyMOL 2.3.2、UCSF Chimera 1.13.1、および ChimeraX72 1.2.5 を使用して実行されました。図 2 に示す Cyt c6 の位置決めでは、対応する局所密度マップとT. elongatus BP-1 Cyt c6 X 線結晶構造は 1.7 Å の分解能で決定されました (PDB ID: 6TR165)。

タンパク質サンプルのサイズや形状を前提とする統計的手法は適用されず、実験はランダム化されませんでした。研究者は、実験および結果の評価中に割り当てについて知らされていませんでした。 PSI三量体、フェレドキシン、シトクロムc6の精製実験を3回繰り返しましたが、サンプルの特徴はほぼ同じでした。 ITC 測定は 3 回繰り返され、同様の結果が得られました (補足データ 1 は、論文に記載されている ITC 測定のソースデータを示しています)。クライオ EM データは、単一のクライオグリッドから収集されました。推定解像度が 5 Å 未満で、トーンリングがぼやけていて、氷の厚さが不十分である個々の画像は、手動でデータセットから除外されました。データ収集、処理、および精製統計の詳細な統計は、補足表 1 にまとめられています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

3018 個の生のクライオ EM ムービーはすべて、受託番号 EMPIAR-10928 で電子顕微鏡パブリック画像アーカイブ (EMPIAR) に寄託されました。最終的なクライオ EM 密度マップは、受託番号 EMD-31605 で電子顕微鏡データバンク (EMDB) に寄託されています。洗練された PSI:Fd モデルの原子座標は、アクセッション番号 7FIX でタンパク質データバンク (PDB) に寄託されています。すべての関連データは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

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リファレンスをダウンロードする

このプロジェクトに対する技術的支援と貴重な科学的貢献に感謝します。久保田川井久子氏、三角裕子氏、田中英明氏、広瀬美香氏、Norbert Krauß氏、Orkun Çoruh氏、加藤隆之氏に感謝します。本研究は、JST-CREST（助成番号JPMJCR20E1（GK））および科学研究費補助金（助成番号21H02417（GK））の文部科学省科研費「創薬・ライフサイエンス研究支援プラットフォーム事業」の助成を受けて行われました。 AMED の助成金番号 JP20am0101117 (KN) および JP16K07266 (CG)、山本正樹 CG および GK への JP22ama121001j0001、および AMED から KN および GK および韓国国立研究財団への Cyclic Innovation for Clinical Empowerment (CiCLE) の助成金番号 JP17pc0101020 ( NRF) 助成金は韓国政府から助成金番号 2019R1A2C1004954 で助成され、国立科学技術評議会 (NST) 助成金は韓国政府から助成金番号 CCL22061-100 で助成金、KBSI 助成金は助成金番号 C220000、C230130、C280320、および C270100 で助成金されています。 Y.-HL、および研究訓練グループ234「MiCon」（MMN）の枠組み内のドイツ教育機関（DFG）に。この研究は、大阪大学でのJLの研究に対する中国奨学会（CSC）からの奨学金（CSC番号201706220064）によっても支援されています。

大阪大学タンパク質研究所タンパク質結晶解析研究室（〒565-0871 大阪府吹田市）

Jiannan Li, Noriyuki Hamaoka, Akihiro Kawamoto, Christoph Gerle & Genji Kurisu

大阪大学大学院理学研究科生物科学専攻（〒560-0043 大阪府豊中市）

ジャンナン・リー & 栗栖源治

大阪大学大学院理学研究科高分子科学専攻（〒560-0043 大阪府豊中市）

Noriyuki Hamaoka & Genji Kurisu

大阪大学大学院生命機能研究科（〒565-0871 大阪府吹田市）

Fumiaki Makino & Keiichi Namba

日本電子株式会社、東京昭島市

Fumiaki Makino

韓国基礎科学研究所バイオコンバージェンス分析研究センター、オチャン、忠清北道、28119、韓国

ユーシー・リン & ヨンホー・リー

植物生化学、生物学およびバイオテクノロジー学部、ルール大学ボーフム、44780、ボーフム、ドイツ

マティアス・ログナー & マーク・M・ノヴァチク

生物分析科学、科学技術大学、大田、34113、韓国

イ・ヨンホ

忠南大学校分析科学技術大学院、大田、34134、韓国

イ・ヨンホ

理化学研究所生命機能科学研究センターおよびSPring-8センター（大阪府吹田市）

けいいちナンバー

日本電子横口リサーチアライアンス研究所、大阪大学、吹田市、日本

けいいちナンバー

RIKEN SPring-8 Center, Kouto, Sayo-gun, Hyogo, 679-5198, Japan

クリストフ・ゲルレ

大阪大学オープン・トランスディシプリンナリー・リサーチ・イニシアティブ（OTRI）、〒565-0871 大阪府吹田市

Genji Kurisu

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GK、MR、MMN が研究を開始しました。 GK と CG が研究を設計しました。 JL、NH、FM、AK、YL が実験を行いました。 JL、NH、YL、Y.-HL、CG がデータを分析しました。 KN が研究を監督し、JL、CG、GK が全著者からの意見やコメントを盛り込んで原稿を執筆しました。

クリストフ・ゲルレまたは栗栖源治との往復書簡。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に対する Mei Li の貢献に感謝します。主な取り扱い編集者: Manuel Breuer。査読者レポートが利用可能です。

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転載と許可

Li, J.、Hamaoka, N.、Makino, F. 他 1.97 Åの分解能でフェレドキシンと複合体を形成したシアノバクテリア光化学系 I の構造。 Commun Biol 5、951 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-03926-4

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受信日: 2022 年 7 月 13 日

受理日: 2022 年 8 月 30 日

公開日: 2022 年 9 月 12 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03926-4

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自然 (2023)

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