クリーンルームの体系的な特性評価

Nov 09, 2023

Microsystems & Nanoengineering volume 8、記事番号: 54 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

統合されたバルブは、混合、ポンピング、および区画化の目的に適用できるため、マイクロ流体システムの自動制御を可能にします。 このような自動化は、オルガン・オン・チップ (OoC) システムのアプリケーションにとって非常に価値があります。 ただし、OoC システムのチャネル寸法は通常、数百マイクロメートルの範囲であり、これは一般的なマイクロ流体バルブよりも一桁大きいです。 統合型常開ポリジメチルシロキサン (PDMS) バルブの最もよく使用される製造プロセスでは、達成可能なチャネルの高さを制限するリフロー フォトレジストが必要です。 さらに、これらのバルブのストローク量が低いため、OoC システムで通常必要とされる 1 分あたりマイクロリットルの流量を達成することが困難になります。 ここでは、マイクロミリングされたダイレクトモールドを使用した多層ソフトリソグラフィーによって製造された機械的な「マクロバルブ」を紹介します。 これらのバルブが高さ 700 μm、幅 1000 μm までの丸いチャネルを閉鎖できることを実証します。 さらに、これらのマクロバルブを使用して、最大 48 μL/分のポンプ速度を持つペリスタルティック ポンプと、わずか 17 秒以内に 6.4 μL の量を完全に混合できる混合および計量デバイスを作成しました。 最初の細胞培養実験では、マクロバルブが組み込まれたデバイスは生体適合性があり、連続灌流と自動培地リフレッシュ下で数日間にわたる内皮細胞の細胞培養が可能であることが実証されました。

Organ-on-chips (OoC) は一般に、多孔質膜で分離された 2 つの独立してアドレス指定可能な平行チャネルを含むマイクロ流体細胞培養デバイスとして定義されます。 異なる種類の細胞を膜の両側で培養することができ、その結果、複雑な臓器固有の組織間界面が形成されます1、2。 OoC デバイスは、従来の in vitro および動物モデルの強力な代替手段であると考えられています3。 ただし、オンチップ細胞培養実験を実行することは簡単ではありません。 OoC は、マイクロ流体工学と細胞培養の両方の経験が必要なため、労働集約的で使用が困難な場合があります4,5。

OoC を概念実証デバイスから商用システム (薬物スクリーニングや個別化医療など) に変換するには、OoC システムのスループットが高いことが重要です。 多重化された OoC は、OoC 実験のスループットを向上させるための有望なアプローチです 5,6。 過去数年間にわたり、より高いレベルの並列化またはスループットを備えたいくつかのマイクロ流体システムが提供されてきましたが、それぞれに独自の欠点があります。 たとえば、Mimetas OrganoPlate® は、40 ～ 96 個の独立した培養ウェルまたは OoCs7 を備えたシステムです。 ただし、個々のチップを充填するには多くのピペッティング手順が必要であり、細胞培養領域は小さく、セットアップにはヒドロゲルの使用が必要です（半透性バリアおよび/または細胞基材として）。 ザハロワら。 は、より高いレベルのスループットを達成するために使用できる 1 つの共通の入口と 8 つの並列出力を備えた設計の例を示しましたが、依然として多くの手動処理が必要です8。

Vollertsen et al.9,10 によって示されているように、マイクロ流体バルブが統合されたシステムは、手動による液体処理の必要性を減らすためによく使用されます。 これらのシステムでは、一体化された常開バルブ 11 が使用されることがよくあります。これは、バルブが製造が容易であり、常閉バルブと比較してチャネル幅に対する設置面積が小さいためです 12、13。 2000 年に、Unger らは、 は、Quake スタイル バルブとしても知られる、現在よく使用されている常開 PDMS バルブを発表しました12。 これらのマイクロバルブは、幅広い用途で混合、ポンピング、および多重化の目的に適用できるため、マイクロ流体工学の自動制御に不可欠なツールです9、10、14、15。 これらのマイクロ流体大規模統合 (mLSI) システムは、より高いスループットを可能にしますが、OoC で関連する細胞培養を収容するために必要な大きなチャネル寸法には適合しません。

Quake スタイルのバルブの元の製造プロセスは、バルブを完全に密閉するための丸いチャネルを実現するためにリフロー フォトレジストに依存しており、その適用はチャネルの高さが数十マイクロメートルまでに制限されています12。 OoC には高さと幅が数百マイクロメートルのチャネルが含まれることが多いため、このバルブはほとんどの OoC アプリケーションには適していません 16、17、18、19、20。 さらに、PDMS チップ内の細胞スフェロイドなどの 3D 細胞培養システムでは、多くの場合、数百マイクロメートルのチャネル寸法が必要です 21。 さらに、リフローフォトレジストを使用して製造された蠕動ポンプは、通常、0.05 μL/min から最大 0.15 μL/min の流量しか達成できません 12、14、22、23、24。 ただし、OoC で通常使用される流量は 0.5 μL/min ～ 3.3 μL/min と一桁高く 16、17、18、19、20、25 であり、血管オンチップではさらに高くなる可能性があります。生理学的に適切なせん断応力を達成します。 mLSI チップ技術の利点を OoC 技術に移すには、常開 PDMS バルブの新しい製造方法が必要です。

PDMS の使用については議論が行われていますが 13、26、27、多くの研究グループにとって依然として PDMS が選択される材料です 28。 製造プロセス (鋳造、表面コーティング、PDMS またはガラスへの接着) での使用が容易で、ガス透過性があります。 （酸素が細胞に拡散することを可能にする）、低コストで、高い弾性を持っています（Quake スタイルのバルブの可能性を可能にします）13,26,29。 これまで、数百マイクロメートルの高さのチャネルを遮断できるバルブを作成するために、フォトリソグラフィーと 3D プリンティングを使用した新しい製造方法が研究されてきました。 Freitas ら 30 は、フォトリソグラフィーを使用して、最大高さおよび幅がそれぞれ約 250 μm および最大幅 400 μm の Quake 型バルブを製造する方法を示しました。 ただし、彼らの方法では、余分なソフト リソグラフィー手順と PDMS 硬化中にチャネルを加圧する必要があり 30、製造プロセスが複雑になります。 Lee et al.31 および Glick et al.32 が示すように、3D プリンティングは、Quake 型バルブの製造においてフォトリソグラフィーの代替手段も提供します。 ただし、これらのバルブは完全に 3D プリントされており、PDMS から作られていないため、バルブを PDMS OoC31 に直接統合することはできません。 グリックら。 およびコンペラら。 どちらも Quake スタイルのバルブを示しており、それぞれ高さ 500 μm と高さ 200 μm のチャネルを閉じており、3D プリントされたダイレクトモールドによって製造されています 32,33。 ただし、PDMS ソフト リソグラフィー用のモールドの 3D プリンティングには、材料の適合性、表面仕上げと蒸気研磨の不可能性、解像度の限界、再現性、使いやすさと製造速度34、および干渉する可能性がある光架橋剤の使用の点で課題が生じます。 PDMS の硬化を伴う 35,36。

マイクロミリングは、マイクロ流体モールドを製造するための急速に出現したラピッド プロトタイピング技術であり、3D プリンティングやフォトリソグラフィーに比べて独自の一連の利点を提供します。 マイクロミリングは、高速かつ多用途で、クリーンルームを必要としないため、低コストの製造方法であり、1 つの金型内で複雑な 3D 形状を可能にします37。 ポリメチルメタクリレート (PMMA) などのプラスチックで作られたマイクロミル加工されたモールドは、比較的大きなフォトレジスト構造が得られる場合に特に脆弱な、壊れやすいフォトレジスト マスターよりも強度があり、弾力性が高くなります。 さらに、モールドのマイクロミリングは、リフローフォトレジストを使用する従来のフォトリソグラフィープロセスによってモールドを製造するよりも労働集約的ではありませんが、再現可能な結果を​​達成するには経験も必要です。 PDMS マクロバルブ用のマイクロミル加工されたモールドはすでに報告されています 21,38 が、対応する製造方法には、ネガティブモールドと PDMS 上の PDMS の二重鋳造 21、またはポリエチレン テレフタレート (PET) 鋳造ステップ 38 が必要です。 さらに、これらの丸いチャネルの寸法は、円錐形のフライス工具の利用可能性によって制限されます21、38。

私たちの知る限りでは、マイクロミリングを使用して数百マイクロメートルの寸法を持つ Quake 型 PDMS マクロバルブ用のポジ型を直接製造する方法を初めて説明しました。 私たちが提案する方法では、使用可能なボールミルやコーンミルの形状やサイズに制限されることなく、任意の形状（円筒形や楕円形など）やサイズ（高さ、幅）の直立構造の金型を自由に作成できます。 このような直接ポジ型は、二重鋳造法と比較して、製造プロセスを容易にして簡素化し、PDMS 収縮によって引き起こされる潜在的な誤差を最小限に抑えます 21,38。 要約すると、Quake スタイルのバルブを製造するために提案されたマイクロミリング直接モールドにより、モールドの商品化と PDMS OoC の​​多重化のためのより簡単なアプローチが可能になります。

この記事では、マイクロミリングを使用してダイレクトポジモールドを製造することにより、Quake スタイルの PDMS「マクロバルブ」を完全にクリーンルームフリーで製造する方法を示します。 制御チャネルは、交差するブリッジと、丸い流れチャネルを閉じるバルブの両方を形成できます。 さらに、ブリッジとバルブチャネルの高さ、幅、作動圧力を系統的に特徴付けるバルブ設計ガイドも提供しています。 マクロバルブは、高さ 700 μm、幅 1000 μm までの丸いチャネルを閉じることができます。 1 つのマクロバルブ設計 (高さ 400 μm、幅 1000 μm の丸いチャネルを閉じるため) をさらなる実験に使用しました。 蠕動ポンプと混合および計量装置の両方を作成することにより、マクロバルブの有効性を実証しました。 ペリスタルティックポンプは最大 48 µL/min のポンピング速度を達成でき、混合および計量デバイスはわずか 17 秒以内に 6.4 µL の完全な混合を達成できます。 2 番目のバルブ設計 (高さ 200 μm、幅 1000 μm のチャネルを閉じるため) は、PDMS デバイス内の蠕動流下で数日間にわたる内皮細胞の培養を示す概念実証の細胞培養実験に使用され、その生体適合性を実証しました。 この実験はまた、マクロバルブが多重化された OoC に適用され、OoC での細胞培養の自動化を可能にする可能性を示しています。これは、より高いスループットの OoC 研究を実現し、同時に手動の液体処理の必要性を減らすのに非常に重要です。

統合されたマクロバルブを備えた作製されたデバイス（図1）はすべて、ガラススライド、柔軟なPDMS膜で覆われた制御チャネルを含む薄いPDMS層（制御層）、PDMS層の3つの層（図1g）で構成されていました。丸みを帯びた流路（流動層）を有する。 図 1a、b は、幅 1 mm、高さ 400 μm の丸いフロー チャネルを横切る制御チャネルを示しています。 流路には青色の食用色素が充填されていました。 流路を伴う制御チャネルの断面が十分に広い場合、制御チャネルの膜は流路内への加圧時に偏向して流路を閉じ（図1b、c）、それによってバルブが閉じられます。 (簡略化した) 製造プロセスを図 1d ～ g に示します。 直接マイクロミル加工されたモールドを使用して、フロー層用の PDMS を鋳造し、制御層用に PDMS をスピン コーティングしました。 両方の層を予備硬化した後、Unger et al.12 に基づいて位置合わせしてスライドガラスに貼り付けることができます。

a、b 上面から見た顕微鏡写真: aa 開いたバルブとブリッジを備えた制御層、ba は閉じたバルブとブリッジを備え、流路を閉じていない加圧制御チャネル。 丸い流路には青い食品着色料が含まれており、制御チャネルには水が含まれています。 c バルブの部位の断面図から見た、開いたバルブと閉じたバルブの概略図。 制御チャネル (P ↑ ) を加圧すると、バルブが閉じます。 d–g 製造プロセスの簡略図。 d 直立した丸い構造を備えたマイクロミル加工された金型を使用して、PDMS を流動層として鋳造します。 e 長方形構造 (制御チャネル) を備えたマイクロミル加工されたモールドが制御層として使用されます。 PDMS をモールド上にスピン コーティングすると、制御チャネルとフロー チャネルの間に薄い PDMS 膜が形成されます。 f PDMS を事前に硬化し、その後 2 つの層を位置合わせすることができます。 g コントロール層をスライドガラスに貼り付けます。 最終的に製造されたデバイスは 3 つの層で構成されます。 スライドガラス、コントロール層、フロー層

バルブを完全に密閉するには、流路が丸みを帯びた、理想的には滑らかな形状である必要があります。 走査型電子顕微鏡 (SEM) 画像を撮影したところ、この突き出た丸い構造をミリングした結果、PMMA モールド内の階段状の構造が示されました (図 2a、b)。 Dektak 表面形状計 (Veeco) を使用して、PMMA 型内のフライス加工された丸い構造の表面プロファイルを測定しました (補足情報 S.2)。 階段状構造の垂直段差を測定したところ、１０μｍであった。 フローチャネルのPDMSキャストの断面を図S1に示します。 チャネルの表面粗さを低減するために、Ogilvie et al.39 に基づいて、PMMA 型の 5 分間のクロロホルム処理が実行されました。 (補足情報 S.1、解決策 1B)。 SEM画像（図2c、d）は、丸い突起構造の表面に対する溶媒処理の平滑化効果を示しています。 この平滑化効果は、処理された金型の Dektak 測定でも見られました (補足情報 S.2、図 S3)。 バルブを閉じているときは漏れがなく (検出限界: 10 nL/分)、追加の平滑化ステップに関係なくポンプに使用できることがわかりました。 したがって、系統的特性評価チップ、蠕動ポンプ、または混合および計量装置にはクロロホルム処理を使用しませんでした。 細胞培養に使用する循環チップの金型を平滑化します。

丸い流路の PMMA モールドの SEM 画像: クロロホルム溶媒処理前 (a、b) と後 (c、d)

特性評価用のチップの概略上面図。 このチップは 4 つのバージョンで製造されており、それぞれ固定流路幅 (250、500、750、または 1000 µm) を備えています。 流路の高さは流路幅の % として変化し、青色のグラデーションで示されます。 制御チャネルの高さはチップのバージョンごとに固定されており、制御チャネルの幅はフロー チャネル幅の % として変化します。 b 固定流路幅を示した 4 つのバージョンのチップを製造しました。 c 異なる作動圧力（右下の 4 本の垂直バーで示される：1、1.25、1.5、1.75 バール）での 4 つのチップ バージョンのバルブ閉鎖（バーごと、n = 9 ～ 12）。 個別のチップ バージョン (流路幅 250、500、750、および 1000 µm) のバルブ クロージャは、補足情報 S.5 に記載されています。

異なる寸法および/または制御ライン圧力を持つバルブの系統的な特性評価は、さまざまな寸法や用途を持つ PDMS デバイスを製造するための有用な設計ツールを提供します。 この系統的な特性評価により、さまざまな作動圧力における流路幅と高さの範囲に必要な制御チャネル幅が決まります。 4 つの特性評価チップ (それぞれが制御チャネルとフロー チャネルの間に 25 の断面を含む) が設計され、製造されました。 各チップについて、丸い流路の幅は固定されました (幅 250、500、750、または 1000 μm、図 3a、b を参照)。 流路幅のパーセンテージ (%) として与えられる流路の高さの範囲を調べました。 さらに、一定範囲の幅を持つ 5 つのコントロール チャネル (すべて流路幅のパーセンテージ (%) として指定) を調べました。 マイクロミル加工された金型の PDMS 鋳造物の断面図は、フロー チャネルと制御チャネルについてそれぞれ補足情報 S.3 と S.4 に記載されています。

流路には青色の食用色素が充填され、一定範囲の作動圧力 (1、1.25、1.5、および 1.75 bar) が制御チャネルに適用されました。 コントロール/フロー チャネルの断面を顕微鏡で観察し、フロー チャネル内の青色の食用色素の存在を確認しました (図 1b を参照)。 図 3c は、異なる作動圧力における 4 つのチップ バージョンすべてについて平均したバルブ閉鎖の割合を示しています。 図 3c は、私たちが提案した製造方法が、幅の 70% までの高さのさまざまなサイズの流路を閉じるのに機能したことを示しています。 狭い制御チャネル (流路幅の 10 ～ 12% の幅) では、流路の高さが幅の 20% より高い限り、流路のブリッジは問題になりませんでした。 閉鎖の場合、流路と同じ幅の制御チャネルが最も堅牢であるように見えますが、設置面積が大きいという欠点がありました。 小さな設置面積が好ましい場合、より高い作動圧力では、流路幅の 60% の制御チャネル幅でも十分です。

OoC は、幅 1 mm、高さ 150 μm から 1 mm までの範囲のチャネルを持つことが多いため 16、17、18、19、20、25、これらの OoC 寸法に適合するバルブをさらに調べることにしました。 この論文の残りの部分では、幅 1000 μm、高さ 400 μm のチャネル (以後「マクロバルブ」と呼ぶ) のバルブの閉鎖を調べました。

マクロバルブの閉動作は、フローチャネルと制御チャネルに異なる圧力を加えることによって調べられました。 2 つの圧力調整器を使用してフロー チャネルの入口と出口に差圧 (dP) を適用し、1 つの圧力調整器を使用して制御チャネルに圧力を適用しました。 バルブと直列の流量センサーを使用して、さまざまな圧力での流量を測定しました (図 4a を参照)。 制御ラインに 900 mbar 以上を加えることで、2.5 mbar ～ 10 mbar の範囲の 4 つの入力圧力すべてに対してバルブを閉じることができました。

a マクロバルブの閉動作。 視覚的な誘導のためのライン。 dP = 流路の入口圧力と出口圧力の差圧。変化し、異なる色で示されます (n = 1)。 b 6 相パターン (101、100、110、010、011、001) によるさまざまな周波数および作動圧力での蠕動ポンプのポンピング速度。 3 つの作動圧力すべてについて、ポンピング速度と作動周波数の間に線形関係が観察されます。 1 バール、R2 = 0.9999 (n = 3)。 1.2 bar、R2 = 0.9997 (n = 1); 1.5 bar、R2 = 0.9998 (n = 1)。 c ペリスタルティックポンプの 6 相作動パターンの概略図

バルブの漏れも検査され、補足情報 S.6 に示されています。 簡単に言えば、平均バルブ漏れは nL/min の範囲にあり、これは開いたバルブでの流量のわずか 0.1% にすぎません。このことから、閉じたバルブの漏れはアプリケーションでは無視できると結論付けることができます。

3 つの連続したバルブを使用して蠕動ポンプを作成しました。 蠕動ポンプのポンピング速度は、異なる周波数での6相パターン（101、100、110、010、011、001、図4cに概略的に示されている）でのバルブの作動によって検査されました。 図 4b は、各作動圧力に対する作動周波数とポンピング速度の間の線形応答を示しています。 周波数 20 Hz では、最大ポンピング速度 47.9 µL/min が達成されました (図 4b を参照)。 1 bar での測定ではほとんど目に見えない小さな誤差バーが示すように、1 つのポンプ内での測定は再現可能でした。 図S2に示す別の蠕動ポンプも線形応答を示しました。 20 Hz を超える周波数は、最大スイッチング周波数が 20 Hz の使用されたバルブマニホールド設定では達成できないため、調査されませんでした。

図5aに概略的に示されている混合および計量装置には、2つの入口、2つの出口、およびオンチップ蠕動ポンプが含まれていました。 混合および計量装置は、チップの流路内で食用色素と水を混合することを特徴としていました。 混合中にチップ内の流体の画像が取得され、材料と方法のセクションで詳しく説明するように、後で検量線を使用して濃度に変換されました。

a 強度が測定された部位を示すデバイスの概略上面図。 b ミキシング前のチャンネルの画像。 チャネル幅 (破線で示す) は 1 mm です。 c ミキシング後のチャンネルの画像。 このチャネルは丸みを帯びていることに注意してください。 したがって、実際の濃度は一定ですが、コーナーの強度は低くなります。 対応する校正については、補足情報 S.7 を参照してください。d 経時的な混合効率。 混合とその後のフラッシングの期間が示されています。 17 秒の混合後、混合効率は 90% に近づきます。 e、f 混合前 (e) と混合後 (f) のチャネルの幅 (距離 x) に沿った計算された濃度。 17 秒の混合後、90.4 ± 3.32% の平均混合効率が観察されました (n = 3)。 100% 食用色素 (注入口 B) を水 (注入口 A) で希釈します。 g 強度が測定された部位の表示 (赤いボックス) を含むデバイスの概略上面図。 h 実験開始時の混合および計量装置の画像。 i 100% 食用色素を水で 5 サイクル希釈した後のチャネル内の食用色素の濃度を計算します。 食品色素濃度の指数関数的な減少は、R2 = 0.999 の y = 102.69e−0.561x の指数関数的近似で観察されます (n = 3 測定)。

混合量は、混合後の濃度プロファイルと完全に混合した場合との差として定量化できます。 これを、完全に混合されていないプロファイル (ステップ関数) と同じ完全に混合された場合の差の一部とみなすと、以前に報告された混合効率の定式化に到達します。

ここで、N はピクセル行の数、cmeasured はチャネルに沿って測定された濃度、\(\bar c\) はチャネルに沿った平均濃度、c0 はチャネルに沿った完全に混合されていない濃度プロファイルです。 この c0 プロファイルでは、Johnson et al.40 が説明しているように、非混合状態の基準として、チャネル幅の半分の 0 からチャネル幅の残りの半分の 2\(\bar c\) までのステップ関数を採用します。 。

図 5a は、強度が測定され、濃度が計算された場所を概略的に示しています。 図 5b、c は混合前後の実際の写真を示し、距離 x に沿った計算された濃度を図 5e、f に示します。 混合効率は、混合前の 3.46 ± 1.61% から、17 秒の混合後の 90.4 ± 3.32% に向上しました。 図5dに示すように、混合効率も経時的に計算されました。 混合プロセスのビデオ記録は補足情報 S.8 にあります。

混合および計量装置は、一連の希釈を実行するためにも使用されました (図 5g–i)。 まず、図5gに示すデバイスのフローチャネルを食品色素で満たし、バルブが混合ループを閉じた後、続いてメインチャネルを100％水でフラッシュしました（図5g、h）。 この水を、混合ループ内に存在する食用色素と 17 秒間混合し、食用色素を希釈しました。これを 5 回繰り返し、希釈サイクルとして示しました。 希釈シリーズのパフォーマンスのビデオ記録は、補足情報 S.9 にあります。 チャネル内の濃度は、混合実験の場合と同じ方法で計算されました（材料と方法および補足情報 S.7 でさらに説明されています）。 チャネル内の濃度は、図5iに希釈サイクルごとにプロットされています。 各サイクルで総ループ容積の約 37% が置換されるため、希釈系列は予想どおり指数関数的適合 (R2 = 0.999) を示します。

せん断応力とパラクリンシグナル伝達因子への継続的な曝露の両方が、in vitro 培養内皮の完全性において重要な役割を果たします。 これら 2 つの要素は、オフチップ ポンプ 41 またはマイクロバルブで構成されるオンチップ ポンプ 24、42 を介してチップ内の細胞培養液を再循環することによって実現できます。 提示された混合および計量装置により、閉ループでの媒体の再循環が可能になります。 「再循環チップ」は、混合および計量チップの設計と同様の設計 (図 6a) を持っていますが、バルブの幅は 1 mm、流路の幅は 1 mm、高さは 200 μm です 43。 再循環チップは、細胞にせん断応力を加えながら蠕動流下で内皮細胞を 96 時間培養する概念実証実験に使用されます。 この 96 時間の間に、ペリスタルティック ポンプのマクロバルブのオン/オフが合計 3 × 106 回切り替わりました。 蠕動ポンプは、3 相 (011-101-110) 作動パターンで 10 Hz で動作するようにプログラムされ、ポンピング速度は 3.7 μL/min になりました (図 6c、点線)。 このパターンは、ポンピング パターンの各ステップで同じ数の閉じたバルブがあるため、ポンピング中にループ内で再循環する培地の量を一定にするために、最初の細胞培養実験に使用されました。 同じチップは、6 相作動パターンでより高いポンピング速度を達成することもできました (図 6c、実線)。 内皮細胞は、播種後96時間で流路内にコンフルエントな細胞層を形成しました（図6b、d）。

a 蠕動ポンプ (赤) と細胞チャンバー (緑) を示すデバイスの概略上面図。 白い矢印は媒体再循環ループを示します。 b 一定の蠕動流下でオンチップで96時間培養したHUVEC（継代数7）の位相差顕微鏡画像。 スケールバーは 1 mm を表します。 c 3 相および 6 相の作動パターンを使用したさまざまな周波数でのオンチップ蠕動ポンプのポンピング レートを測定しました (両方とも n = 1)。 d 細胞核（NucBlue）およびF-アクチン（赤）が染色されたGFP発現（緑）HUVECの蛍光画像。 スケールバーは 1 mm43 を表します

私たちが提案する製造方法（図 1d ～ g に簡単に示し、「材料と方法」セクションで詳細に説明）は、ソフト リソグラフィー ステップを 1 つだけ行う 2 つのポジ型を使用してマクロバルブを製造するアプローチを提供します。 この方法は完全にマイクロミリングに依存しており、リフローフォトレジストを使用した従来のフォトリソグラフィープロセスに比べていくつかの利点があります。 マイクロミリングでは、1 つのモールド内でさまざまな高さを実現できるため、設計者に大きな自由が与えられますが、フォトリソグラフィーのマスターにとっては、追加のマスクと製造ステップが必要になるため、はるかに面倒になります。 さらに、私たちが提案する方法は完全にクリーンルームフリーであり、マイクロミル加工されたモールドは製造後に下塗りやコーティングを必要としません。 2 つの金型をマイクロミリングするのに必要な時間は、金型のサイズ、金型内の構造の量と複雑さによって異なります。 ここで実証された蠕動ポンプおよび混合および計量装置では、1 つの装置の両方の型のフライス加工にそれぞれ 1.5 時間および 2 時間かかりました。 これは、両方のウェーハを製造するのに少なくとも 6 時間を必要とする、リフロー フォトレジストを使用したフォトリソグラフィー技術の製造プロセスより 3 倍高速です。

当社のマクロバルブの寸法が大きいため、一般的なマイクロ流体バルブよりも 2 つの層の位置合わせの許容誤差が大きくなります。 この位置合わせは、単純な実体顕微鏡を使用することによって、または肉眼によっても行うことができ、ユーザーは非常に正確であったり経験が豊富である必要はありません。 チャネルとバルブの寸法 (高さと幅) はすべて、従来のリフロー フォトレジスト法で一般的に得られる寸法よりも 1 桁 (10 倍) 大きいです。

丸いPMMA構造の垂直の「階段」ステップ（図2a、b）は10μmであると測定され、これはHSMworksソフトウェアの特定のパラメーターによって調整できます（補足情報S.1、ソリューション1Aでさらに説明されています）。 。 より高い精度も可能ですが、より多くの計算能力が必要となり、より多くの計算 (およびミリング) 時間がかかります。 丸い構造を滑らかにするための別のアプローチは、Ogilvie et al.39 (補足情報 S.1、溶液 1B) に基づくクロロホルム溶媒処理です。 図 2 は、このクロロホルム溶媒処理による PMMA 金型表面の明確な平滑化を示しています。 ただし、クロロホルム溶媒処理の効果は、使用するシャーレの容量、使用するクロロホルムの容量と濃度、クロロホルム液面と PMMA モールドの表面の間の距離など、いくつかの要因に依存する可能性があります。 その結果、溶媒処理を使用する前に最適化が必要となり、製造プロセスが複雑になります。 流路を完全に遮断するには、両方の追加の平滑化オプションは必要ないことがわかりました。

実行された体系的な特性評価 (図 3 および補足情報 S.3 ～ S.5) は、さまざまなサイズおよび/または用途のバルブを製造するための貴重な設計ツールを提供します。 このバルブの閉鎖は、制御層とフロー層の間の薄い PDMS 膜の厚さに大きく依存することに注意してください。 異なる回転速度、PDMS 比、サイズモールド、または PDMS 粘度が使用される場合、この厚さが異なる可能性があり、バルブ特性の違いにつながります (補足情報 S.1 問題 2 ～ 4 を参照)。 250 μm チップの制御層とフロー層の両方の幅と高さの偏差が非常に高いため、幅 500 μm 以上の丸いチャネルを閉じるには、提案された製造技術を使用することをお勧めします (補足情報 S. 3-S.5)。

フローチャネルに 20 mbar の圧力を加え、制御チャネルに 1.5 bar の圧力を加えたときのバルブ漏れは nL/min の範囲にあり、これはバルブが開いている場合の流量のわずか 0.1% であり、検出限界を下回っています。 (10 nL/min) の流量センサーを使用します。 開いたバルブから 90％ 閉じたバルブまでの 90％ 応答時間は 0.5 秒未満でした（図 S6）。 この 0.5 秒が経過すると、流量センサーの感度が低下して正確に測定できなくなります。 ただし、流量はマクロバルブを使用して PDMS チップの外側で測定されるため、流体の慣性により応答時間に遅れが生じる可能性があります。 OoC アプリケーションでの区画化を目的とする場合は、この応答時間とバルブの密閉性で十分です。

図 4b は、作動周波数が増加するにつれて、蠕動ポンプのバルブを制御するバルブマニホールドの最大スイッチング周波数である 20 Hz までポンピング速度が増加することを示しています44。 OoC で最も一般的に使用される流量は 0.5 μL/分 18,19,25 または 1 μL/分 16,17 で、これは提示されたペリスタルティック ポンプで簡単に得ることができます。 最大ポンプ速度は 48 μL/min であると報告しています。これは、従来のリフロー フォトレジスト法で製造されたペリスタルティック ポンプについて報告されているポンプ速度よりもはるかに高い値です。 これらのポンプによって通常達成されるポンプ速度は、0.05 μL/min から最大 0.15 μL/min の範囲です12、14、22、23。 従来の Quake スタイルのバルブを使用したデバイスのポンピング速度は 7.5 µL/min であることが文書化されています 45。 ただし、これらのポンプはこれらのポンピング速度を得るために非常に高い周波数 (300 ～ 400 Hz) を必要とし、この研究で使用した外部電磁弁マニホールドではそれを得ることができません。 Goulpeau らが使用している高速電磁弁は、この問題を解決できる可能性があります。 ただし、達成可能な圧力スイッチ時間は、作動容積 (つまり、チューブと制御チャネルの容積) によっても制限されます 45。

図 4b は、作動周波数とその結果として生じるポンピング レートのほぼ完全に線形な応答を示しています。 別々のポンプは、異なる周波数と作動圧力でわずかに異なるポンピング速度を示しますが、前述の直線性により校正が容易になります。 所望の流量に応じて、補足情報 S.1、解決策 4 (図 S2) で説明されているように、適切な作動圧力と周波数を決定することで蠕動ポンプを校正できます。 1 つのポンプ チップ内で、流量対周波数のプロットは非常に再現性が高いことが示されています (図 4b、1 バール)。

混合効率を、混合前の 3.46 ± 1.61% から 17 秒の混合後の 90.4 ± 3.32% まで改善できることを示しました (図 5)。 比較すると、Kondapalli et al. は、チップ上のタンパク質のリフォールディングを応用した混合および計量装置を示し 24 、完全に混合するために必要な混合時間は 45 秒であると報告しました。 ただし、混合効率は定量的に報告されていません。

90% を超える混合効率は、チャネルに沿った均一な分布を示していると考えられます 46。 しかし、文献によれば、マイクロ流体ミキサーは、混合を引き起こす特定のチャネル構造を備えたパッシブミキサーであり、したがって、所定の流量に対して単一の混合効率を有する。 私たちのシステムの混合効率を文献に記載されているパッシブミキサーの混合効率と比較することは、次の 2 つの理由により困難です。1 つは、混合が再循環によって能動的に行われること、2 つ目は、混合ループには混合中に再循環されるデッドボリュームが含まれていることです。 どちらの効果も時間の経過とともに混合効率に変化をもたらします。 最初の効果は、単純に無限に再循環して、ますます優れた効率を達成できることを意味します。 2 番目の影響は、デッドボリュームが再循環するにつれて、測定された混合効率に最初はある程度の振動が存在することを意味します。 これを克服し、文献との比較を容易にするために、代わりに、混合効率が 90% に達するために振動が消滅するまでに必要な時間を特徴付けました。 図5dでは、10秒間の再循環後に振動が消え、17秒後に約90％の混合効率に達することがわかります。

図 5g–i に示す希釈系列は、各サイクルで染料が同量の水で希釈されているため、予想どおりの指数関数的フィットを示しています。 フィッティングは希釈係数 0.561 を示し、これは混合ループ内のチャネルの体積を計算することで得られる予想される希釈係数 0.584 に近づきます (補足情報 S.10)。 他の希釈係数は、チップ内の体積比を調整することによって実現できます。

概念実証の細胞培養実験により、このデバイスは生体適合性があり、数日間にわたる内皮細胞の細胞培養が可能であることを示しました。 最初の長期実験中に、制御層とスライドガラスの間の結合が 24 時間以上の作動に耐えられるほど強くないことがわかりました。 これを解決するために、制御層の下に PDMS 層を追加しました。これについては、「材料と方法」セクションで詳しく説明します。 最初の細胞培養実験では、96 時間にわたってバルブを作動させることが可能であることを実証しました。その間、バルブの ON/OFF を 3 × 106 回繰り返しました。

蠕動ポンプは、3 相パターンに従って 10 Hz で作動すると、約 0.01 Pa のせん断応力を生成しました (長方形のチャネルの壁せん断応力の近似値を使用して計算)。 これは、血管にとって生理学的に適切なせん断応力 (>~0.5 Pa) ではまだありません 48,49,50。 ただし、これは、セル チャンバーの寸法を縮小するか、より高いポンピング レートを達成することが示されている 6 相パターンを使用することによって解決できます。 ガットオンチップなどの他のオルガンオンチップアプリケーションの場合、発生するせん断応力はすでに十分です25。

Quake スタイル PDMS マクロバルブ用の直接ポジ型のマイクロミリングに基づく、ここで紹介したクリーンルーム不要の製造プロセスは、私たちの知る限り、これまでに記載されていない方法です。 我々は、高さ 700 μm、幅 1000 μm までの丸い流路を横断するための橋と遮断するためのバルブの両方を形成できることを示します。 バルブとブリッジの寸法の体系的な特性評価が実行されます。これは、通常 Quake の製造に使用される従来のリフロー フォトレジスト法では達成できない、数百マイクロメートル (250 ～ 1000 μm) オーダーの寸法を持つデバイスにとって貴重な設計ツールです。 -スタイルのバルブ。 寸法は OoC 用に特別に調整されており、最初の細胞培養実験の結果は、このバルブ技術を使用することにより、自動培地更新で少なくとも数日間細胞を培養できるという結論を裏付けています。 さらに、マクロバルブのストロークボリュームが大きいため、蠕動ポンプを使用して最大 48 µL/min のポンプ速度を達成できます。 これらのマクロバルブの統合により、OoC における細胞培養条件の多重化および自動制御が可能になります。 これらのパラメーターは、手動処理の必要性を減らしながら、より高いスループットの OoC を取得するために不可欠です。

各設計について、制御層とフロー層用に 2 つの PMMA モールドが 3D-CAD ソフトウェア (SolidWorks®、2018) で設計されました。 突起構造の寸法はチップの設計によって異なります。 入口と出口は、ISO ワークショップ協定 23:2016 規格に対応するグリッド上にありました51。

SolidWorks® に統合された CAD/CAM ソフトウェアである HSMworks を使用して、フライス加工ステップをプログラムしました。 具体的には、流動層の設計における許容差と平滑化設定は、滑らかで丸みを帯びた突出構造を得るために不可欠でした (補足情報 S.1、解決策 1A を参照)。 ＰＭＭＡストック材料をマイクロミリング（Ｄａｔｒｏｎ Ｎｅｏ、ドイツ）して、ポジティブモールドを得た。 フロー層には直径 1 mm のミルが使用され、制御層の最小フィーチャには直径 0.4 mm のミルが使用されました。 オプションで、Oglivie et al.39 に基づく PMMA 型の 5 分間のクロロホルム溶媒処理を実行できます (補足情報 S.1、ソリューション 1B)。 マイクロミリング後、金型を水ですすぎ（最終的なバリやほこりを除去するために超音波バスを使用することも任意）、窒素ガンを使用して乾燥させることによって、ほこりを除去することができます。 PMMA モールドは下塗りやコーティングを必要とせず、PDMS 鋳造に直接使用できます。

図 7 に示す PDMS デバイスの製造プロセスは、Unger et al.12 に基づいています。 PDMS (RTV 615、Permacol BV、オランダ) をフロー層用に (1:7 (w/w))、コントロール層用に (1:20 (w/w)) 混合し、続いて 1.5 時間脱気しました。 PDMS (1:7 (w/w)) を流動層の型にキャストしました。 制御層として、PDMS (1:20 (w/w)) をマイクロミル加工した PMMA モールド上に 60 秒間スピンコートし、バルブ部位に約 60 μm の厚さの膜を形成しました。 この厚さ 60 μm の膜に必要な回転速度は、金型のサイズと制御層の高さに依存します。 さまざまなチップに使用される回転速度は、製造プロトコルの他の関連パラメーターとともに補足情報 S.11 (表 S6) にまとめられています。 室温で 20 分間回転させた後、コントロール層を平らな表面に置き、その後両方の層を 60 °C で 45 分間予備硬化させました。 予備硬化後、流路の入口を 1 mm の生検パンチ (Ted Pella, Inc.、米国) で開けました。 その後、2 つの層を位置合わせして一緒に押し付けて接着し、60 °C で一晩硬化させました。 次に、制御チャネルの入口を0.75 mmの生検パンチ(Harris Uni-core)で打ち抜き、制御層をスライドガラスにプラズマ接合した。 最終的なデバイスは、2 つの PDMS 層 (フローおよび制御) と 1 つのガラス層の 3 つの層で構成されました。

PDMS デバイスの製造プロセスの概略図。 *ステップ 3b の回転速度は、PMMA 制御層モールドのサイズに依存することに注意してください。

細胞培養にバルブを数日間使用している間に、スライドガラスからのコントロール層の剥離が観察されました。 再循環チップのこの問題を解決するために、追加の PDMS 層がスライドガラスに追加されました。 ＰＤＭＳを混合し（１：１０（ｗ／ｗ）、Ｓｙｌｇａｒｄ １８４ シリコーンエラストマーキット、Ｄｏｗ ｃｏｒｎｉｎｇ）、脱気し、ガラススライド上に３００ｒｐｍでスピンコートした。 この層は 60 °C で 14 分間予備硬化され、その後、コントロール層と PDMS コーティングされたスライドガラスが酸素プラズマ処理されました。 接着後、チップを 60 °C で完全に硬化させました。 補足情報 S.1、問題 5 に記載されている代替方法を使用した予備的な結果では、デバイスの信頼性と安定性の有望な改善が示されました。 この製造方法については、今後さらに詳しく検討していきます。

図 8a は、バルブの閉鎖動作をテストするための実験設定を示しています。 2 つの圧力調整器 (Fluigent、LINEUP™ シリーズ) を使用して流路の入口と出口に圧力を加え、これらの圧力の差が差圧 (dP) です。 1 つの圧力調整器 (Fluigent、LINEUP™ シリーズ) を使用して、制御チャネルに圧力を加えました。 バルブと直列に、流量センサー (Fluigent、FRP サイズ L) を配置しました。

a バルブの閉鎖動作のテスト、b ペリスタポンプによって生成されるポンピング速度の測定、および c 混合効率と希釈系列の測定のための実験セットアップ

体系的な特性評価のために、流路に青色の食用色素 (JO-LA) を充填し、カラー CCD カメラ (FLIR Grasshopper 3、U23S6C) を備えた顕微鏡を使用してバルブの閉鎖を観察し、画像を記録しました。 制御チャネルの作動には、カスタムメイドのシステム (Convergence Industry BV、オランダ) が使用されました。

図 8b は、蠕動ポンプ速度を測定するための実験装置を示しています。 3 つのバルブを作動させるために、制御チャネルへの圧力はバルブ マニホールド (Festo) を介して適用されました。バルブ マニホールド (Festo) の最大スイッチング周波数は 20 Hz で、Easyport モジュール (Festo) によって制御されます。 蠕動ポンプを特定の周波数と圧力で 5 分間または 10 分間作動させました。 流出物をエッペンドルフチューブに収集し、ポンピングの前後に重量を測定した(Balance SX64、Mettler Toledo)。

混合および計量装置 (図 8c) では、制御チャネルの作動にカスタムメイドのシステム (Convergence) が使用されました。 制御チャネルは 1.5 bar の圧力で作動しました。 混合のために、3 つのバルブも 6 パターンで 10 Hz の周波数で 20 サイクル作動しました。 圧力調整器 (Fluigent、LINEUP™ シリーズ) を使用して、混合および計量装置の両方の入口に圧力を加えました。 画像はグレースケール カメラ (Grasshopper3 GS3-U3-23S6M、Point Gray カメラ) を使用して撮影されました。

画像処理と解析は MATLAB (2017b) を使用して実行されました。 まず、全体的な強度の変動を補正するためにバックグラウンド補正が実行されました (補足情報 S.7)。 混合および計量装置の流路に水で希釈した既知濃度の食用色素を充填する校正セッションが実施され、校正曲線が得られました（図S7）。 図S7aは、流路が食品色素で満たされている場合、流路の丸いプロファイルにより、測定された強度が流路の幅（図5b、cの距離x）に沿って異なることを示しています。 これを解決するために、ピクセル行ごとに校正曲線が確立されました。 チャネルの幅に沿ったさまざまなサイトでの 3 つの検量線が図 S7b-d に示されており、(I0/I) が濃度に対してプロットされています。 すべての検量線は 2 次多項式フィットに従いました。 これらの検量線を使用すると、チャネルに沿った未知の濃度を計算できます (図 5)。 混合プロセスの個別の画像フレームを分析することにより、混合効率が経時的に計算されました（図5d）。 平均濃度 (\(\bar c\)) は画像フレームごとに計算され、その特定のフレーム/時点での混合効率を計算するために使用されました。

緑色蛍光タンパク質 (GFP) を発現するヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC) (Angio-Proteomie、米国) を、コラーゲン I でコーティングされた T75 内皮増殖培地 (EGM) (Cell Applications, Inc.、カリフォルニア州、米国) で培養しました。フラスコ (CELLCOAT®、Greinder Bio-One)。 細胞培養の前に、再循環チップを酸素プラズマ処理 (40 秒、50 ワット、Femto Science、Cute) で滅菌し、フロー チャネルを 70% エタノール (Boom、オランダ) でフラッシュし、続いてリン酸塩でフラッシュしました。緩衝生理食塩水 (PBS、Sigma-Aldrich)。 GFP 発現 HUVEC (継代数 7) を細胞チャンバーに 4 × 106 細胞/mL の播種密度で播種しました。 オンチップの蠕動ポンプは、10 Hz で 3 相 (011-101-110) 作動パターンを実行するようにプログラムされました。 ループ内の細胞培養培地の一部は 2 時間ごとに自動的に交換されました。 入口 1 と出口のバルブが開き、細胞チャンバーが閉じられました (図 6a)。その間、オンチップポンプがチップ内に新鮮な培地を 1 分間送りました。

オンチップ培養実験は、デバイスを特注のインキュベーション システム 9 に 96 時間置くことによって実行されました。

蛍光顕微鏡分析では、HUVEC を PBS 中の 4% パラホルムアルデヒド (Sigma Aldrich) で固定し、続いて PBS 中の 0.3% Triton-X (Sigma Aldrich) で透過処理しました。 細胞を PBS 中の 15 µL/mL の AcinRed (Thermo Fisher Scientific) と NucBlue (Thermo Fisher Scientific) の両方で染色し、F-アクチン フィラメントと細胞核をそれぞれ視覚化しました。 蛍光画像と位相コントラスト画像は、EVOS FL 細胞イメージング システムを使用して取得されました。

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著者らはイングに感謝します。 Johan Bomer は、SEM 画像の撮影と Dektak 表面プロファイリング測定の実行に協力してくれました。 このプロジェクトは、オランダ科学研究機構 (NWO) からの Building Blocks of Life 助成金 (助成金番号 2) によって資金提供されました。 737.016.003 および助成契約番号 737.016.003 に基づく革新的医薬品イニシアチブ 2 共同事業による。 この共同事業は、欧州連合の Horizo​​n 2020 研究およびイノベーション プログラム、EFPIA および JDRF International からの支援を受けました。

BIOS Lab on a Chip Group、MESA+Institute、Technical Medical Center、Max Planck Institute for Complex Fluid Dynamics、Twente大学、エンスヘーデ、オランダ

エルスベス GBM ボシンク、アンケ R. フォルレルツェン、ジョシュア T. ロエスバーグ=ザール、ローズ I. ゼゲリンク & マチュー オディク

オランダ、エンスヘーデ、トゥエンテ大学テクニカルメディカルセンター、Applied Stem Cell Technologies Group

アンケ・R・フォルレルツェン & アンドリース・D・ファン・デル・メール

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EGBMB は実験を実施し、設計を製作し、データ分析と原稿執筆に貢献しました。 ARV は実験を実施し、実験計画、実験セットアップ、原稿執筆に貢献しました。 JTZ はデータ分析と後処理、原稿執筆に貢献しました。 ADvdMは原稿執筆・編集・監修に協力しました。 LIS と MO はデータ分析、原稿執筆、プロジェクト監督に貢献しました。 著者全員が原稿を読んで承認しました。

Elsbeth GBM Bossink または Mathieu Odijk への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Bossink、EGBM、Vollertsen、AR、Loessberg-Zahl、JT 他。 クリーンルームフリーで製造されたマクロバルブの系統的な特性評価。オルガンオンチップ用途向けに調整された自動流体処理用のポンプとミキサーを実証します。 Microsyst Nanoeng 8, 54 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41378-022-00378-y

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受信日: 2022 年 1 月 13 日

受理日: 2022 年 3 月 18 日

公開日: 2022 年 5 月 23 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41378-022-00378-y

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