メーター内のマイクロ流体の研究

Jan 11, 2024

Scientific Reports volume 12、記事番号: 19553 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

微生物誘発炭酸カルシウム (CaCO3) 沈殿 (MICP) は、粒状媒体の人工セメンテーションに代わる主要な持続可能な代替手段の 1 つです。 MICP は、細菌とカルシウムが豊富な溶液を土壌に順次注入して土壌粒子間に方解石結合を形成し、土壌の強度と剛性を向上させます。 MICP の性能は、細菌の増殖、溶質の反応性輸送、反応速度、結晶核生成および成長といった、根底にあるマイクロスケールのプロセスによって支配されます。 ただし、細孔スケールの不均一性が MICP 中のこれらのプロセスに及ぼす影響はよく理解されていません。 この論文は、寸法と空孔率が同じ2メートルの長さのマイクロ流体デバイスを均一および不均一な多孔質ネットワークとリアルタイムモニタリングと組み合わせることにより、MICPの時空間進化、全体的な化学反応効率および透過性の進化に対する孔スケールの不均一性の影響に光を当てます。 。 入口と出口の圧力を定期的に監視しながら、2 つのチップに強制流量と同じ初期条件による MICP 処理を 3 回繰り返しました。 この論文では、MICP で処理された多孔質媒体のマイクロ流体レプリカに沿った複数の位置のタイムラプス顕微鏡データから細菌と結晶を検出することを目的とした包括的なワークフローを提案します。 CaCO3 結晶は浸炭溶液 (CS) の導入から 1 時間後に形成され、結晶成長は 12 時間後に完了しました。 平均結晶成長速度は、不均質多孔質媒体では全体的に速かったが、セメンテーション注入の最初の 3 時間以降は遅くなった。 平均化学反応効率は、チップの中央で 34% のピークを示し、不均一多孔質ネットワークの反応経路の最後の 90 mm までは 20% 以上に留まることがわかりました。 均質な多孔質媒体は全体的に平均反応効率が低く、入口の 420 mm 下流で 27% でピークに達し、マイクロ流体チャネルの残りの部分では 12% 未満のままでした。 2 つのネットワークにおける化学効率のこれらの異なる傾向は、均質な多孔質媒体よりも不均質媒体の方が平均直径が大きい結晶の数が多いためです。 480 ～ 900 mm の間隔では、不均一多孔質媒体内の結晶の数は均一多孔質媒体内の結晶の数の 2 倍以上です。 結晶の平均直径は、チップ全体の均一な多孔質媒体では 17 ～ 40 μm であったのに対し、不均一な多孔質媒体では 23 ～ 46 μm でした。 不均質な多孔質媒体の透過性は、均質系の透過性よりも大きな影響を受けましたが、圧力センサーは、結晶が形成される最初の 2 時間の透過性の大きな低下と、その後の結晶成長中のそれほど顕著ではない透過性の低下を効果的に捕捉しました。既存の結晶だけでなく、新しい結晶の核生成と成長も同様です。

過去 10 年間に、微生物誘導炭酸カルシウム (CaCO3) 沈殿 (MICP) が、普通ポルトランド セメントをベースとした従来の土壌安定化に代わる持続可能な代替手段として浮上してきました1。 MICP は、一般にバイオグラウト工法と呼ばれる粒状土壌の剛性と強度を高めるための土壌改良 2、3、4 など、さまざまな潜在的なエンジニアリング用途について研究されています 5。 重金属と放射性核種の固定化6。 CO2 隔離 7 と、漏れを軽減するための CO2 隔離坑井のシール破損 8。 最も研究されているメカニズムである尿素分解ベースの MICP は 2 段階で発生します。 第 1 段階では、尿素分解性土壌微生物、つまり酵素ウレアーゼを分泌する細菌が尿素加水分解を触媒します (式 1)。 この反応により、微小環境の pH を上昇させるアンモニウム イオン (NH4+) と炭酸イオン (CO32-) が生成されます。 したがって、十分なカルシウムイオンの存在下では、アルカリ性が CaCO3 の沈殿を促進します (式 2)。

尿素分解による MICP の研究で最も一般的に使用される微生物は、スポロサルシナ パストゥリ (S. パストゥリ) (株指定 ATCC 11859) です。これは、他の多くの株よりも高いウレアーゼ活性が実証されている非病原性株であるためです9。 スポロサルシナ パストゥリはバチルス属に属し、内生胞子を形成し、好気性であるグラム陽性菌として特徴付けられます10。 細胞はカルシウムイオンを引き付ける負のゼータ電位を持っているため、不均一な核形成が促進されます11。 不均一核形成またはシード核形成とは、細胞、気泡12、鉱物13、14などの表面上の析出を指し、これにより核形成に必要なエネルギー障壁が減少し、核形成速度が増加します。 対照的に、均一核生成とは、結晶化溶液からの CaCO3 の沈殿を指します。 したがって、MICP における沈殿メカニズムは 2 つの異なる方法で誘発されます: (i) 核形成部位として機能する細菌による、つまり細胞上沈降による、および (ii) 前述の尿素による尿素分解細胞周囲の pH の上昇による。加水分解反応１５．

沈殿した CaCO3 は粒状培地の細孔空間を満たし、最も重要なことに、土壌粒子を橋渡しすることで真の凝集力を与え、最終的にせん断強度と剛性の向上につながります2。 CaCO3 の沈殿は土壌の空隙率と浸透性を低下させます。 MICP 処理による透水性の低下は、ほとんどの場合 1 ～ 3 桁未満です。これは、透水性を最大 8 桁まで低下させることができる化学グラウトと比較した MICP の利点です16。

MICP のフィールド適用における広いターゲットゾーンの修復には、反応物質を距離にわたって均一に送達することが重要です 17,18。 析出速度が高いと注入点付近で詰まりが生じる可能性がありますが、析出速度が低いとより高い均一性が得られます。 セメンテーション溶液 (CS) 中の尿素と塩化カルシウムのさまざまな化学濃度は、沈殿速度とパターンに影響を与え、ミクロスケールの不均一性を引き起こします。 細孔空間内に沈殿した CaCO3 のサイズ、形状、空間分布により、バイオセメント土壌のマクロスケールの浸透性と強度に違いが生じる可能性があります 19。 例えば、Al Qabany と Soga 19 は、1 M 尿素-塩化カルシウム 19 の高濃度 CS では、より大きな結晶が形成されて細孔が詰まり、より急速な浸透性の低下と沈殿の不均一性を引き起こすことを示しました。 降水量に影響を与えるもう 1 つの要因は、土壌の粒子サイズと勾配です 17。 CaCO3 の沈殿は、粒子が接触する場合により効果的です17。 モーテンセンら。 17 人は、緻密で整地度の高い粗い砂の方が、緩くて整地度の低い土壌よりも高い降水率を報告しました。これは主に、MICP の対象となる基材の固有の特性に起因すると考えられます。

注入されたカルシウムと尿素が CaCO3 に変換される割合として定義される化学反応効率は、原材料の無駄を避けるために MICP を現場規模で適用する際に制御すべき重要なパラメータです20。 Al Qabany et al.21 は、CS 内の化学物質濃度、処理時間、無流量に対する化学物質濃度の比として定義される有効投入速度など、カラム規模での効率に影響を与える要因を調査しました。反応に許容される時間 (保持時間)。 OD600 が 0.8 ～ 1.2 の場合、有効投入速度 0.042 mol/L/h により、使用した化学物質の濃度 (0.25 ～ 0.5 ～ 1 M 尿素) に関係なく、すべての砂サンプルで 80% 以上の反応効率が得られることがわかりました。 -塩化カルシウム）。 Zeng ら 22 は、野外規模の実験で 5% という非常に低い化学効率を報告しました。これは、反応物質を土壌マトリックスの特定のゾーン (砂レンズ) に導く優先流路に起因すると考えられます。

従来、バイオセメントで固められたサンプルは走査型電子顕微鏡 (SEM) によって観察されますが、バイオセメントで固められた土壌の繊維や質感に関する詳細な定性情報を得るには、処理後の破壊的なサンプリングが必要です 23。 近年、MICP23、24、25、26、27、28、29および酵素誘導方解石沈殿（EICP）30、31のマイクロスケールプロセスをリアルタイムで調査するために、マイクロ流体工学とイメージングを組み合わせた実験装置が開発されています。 マイクロ流体デバイスは、多孔質ネットワーク (ラボオンチップとして知られる) を統合し、イメージングと追跡を容易にします。 これらは、透明で厚みが薄いため、輸送プロセスをミクロスケールで視覚化することができ、生物医学研究 32、水モニタリング研究 33、多孔質媒体中の細菌の輸送 34、石油回収の強化 35 などの用途に一般的に使用されています。 単結晶の核生成と成長を研究するために活用されているもう 1 つの技術は、液滴マイクロフルイディクスです 36。 この設定を使用することで、著者らは結晶による細胞のカプセル化を調べることができました。これは、尿素分解を継続するために活性な細胞を利用できるという点で重要です。 上記を考慮すると、MICP 研究にラボオンチップを使用すると、(i) 細菌の定量、(ii) CaCO3 結晶の定量、(iii) 測定を含む一連のリアルタイム観察が可能になります。彼らの形の。

Xiaoら27は、均質な細孔ネットワーク反応マイクロ流体チャネルに収束する細菌懸濁液（BS）とCSを同時に注入するための2つの入口ポートを備えたポリジメチルシロキサン（PDMS）製のY字型マイクロ流体チップを使用した。 。 チップの 2.8 mm x 4.5 mm (WxL) の領域でキャプチャされた画像は、CaCO3 が最初に BS の注入側で沈殿し、次に CS の注入側で沈殿することを示しました。 さらに、細菌の拡散と移動性、MICP における結晶成長速度論および結晶分布に対するさまざまな濃度の塩化カルシウムの影響が Xiao らの研究で調査されました 29。 結果は、0.5 M の濃度により細菌の移動性が低下し、細菌が BS の注入側に限定されることが示されました。 一方、濃度 0.01 M では、MICP 処理の終了時にチップの全幅にわたって細菌のより均一な分布が達成され、これにより結晶のより均一な分布も得られました。

Wang ら 24、25、26、28 は、固化して切断された 3D オタワ 30-50 砂質土壌の断面画像に基づいて設計された、寸法 15 mm x 15 mm の PDMS マイクロ流体を使用しました。 Wang et al.26 は、細菌密度が高くなると、全体的に結晶数が増加し、結晶成長速度が速くなるということを実証しました。 より正確には、最高の細菌密度 (約 5.2 × 108 細胞/mL) では 2 × 107 結晶/mL が得られ、平均結晶体積は 450 μm3 でしたが、最低の細菌密度 (約 0.6 × 108 細胞/mL) ではより低い結晶体積が得られました。結晶の量は (1.1 × 106 結晶/mL) ですが、平均体積は 8000 μm3 と大きくなります。 細菌密度が 5.2 × 108 細胞/mL の場合、結晶成長は 1.5 時間で終了しましたが、細菌濃度が 10 分の 1 の場合、結晶成長は 15 時間かかりました。 Wang et al.28 は、マイクロ流体実験の結果を使用してカラム実験を最適化するという初めての試みを公表しました。 より具体的には、マイクロ流体実験は、カラム実験でも観察され、MICP と処理された土壌の機械的強度。

Kim et al.30 は、寸法 21.3 mm x 12.7 mm の均質ガラス製マイクロ流体デバイスを使用し、EICP によるマルチサイクル処理の沈殿速度論を調査しました。 細孔構造と沈殿した CaCO3 をセグメント化するための包括的な画像解析アルゴリズム。 私たちの知る限り、Kim et al.30 の研究は、均質な多孔質媒体中で十分に混合されていない状態をシミュレートするマイクロモデルでの実験中に観察された核生成速度と予測された核生成を比較した最初の研究です。古典的な核生成理論に基づいた速度。 マイクロ流体工学では 2D イメージングのみが可能であるため、結晶成長を 3 次元で評価するには、結晶の形状 (球状および半球状) に関して仮定を行う必要がありました。 Weinhardt et al.31,37 は、EICP による CaCO3 沈殿中の、擬似 1D および擬似 2D 細孔構造幾何学形状と数 mm 長の PDMS マイクロ流体チャネル内の圧力を堅牢に測定するための実験設定を提示し、幾何学形状が空隙率 - 透過性に及ぼす影響を観察しました。関係。 EICP 処理終了後の CaCO3 沈殿物の 3 次元を分解する X 線マイクロコンピュータ断層撮影法 (XRCT) を使用すると、回転楕円体と錐台の形状を使用して 2D 投影から沈殿した CaCO3 の体積を計算できることが示唆されました。

上記の研究では、異なる形状のマイクロ流体ドメインにおける、異なる注入間隔、細菌密度、CS 濃度を使用した BS および CS のさまざまな注入戦略をリアルタイムで視覚化しましたが、それらは数 mm2 の領域に限定されています。 ただし、MICP は反応物質が注入点から離れた場所で消費される反応性輸送現象であり、細菌の剥離速度は距離に応じて異なる場合があります。 さらに、細孔スケールの不均一性は、より長い距離にわたってバクテリアを移動させる可能性のあるより高速なゾーンにより、反応物の空間分布に影響を与えると予想されます。 私たちの知る限り、細孔スケールの不均一性が MICP の化学反応効率に及ぼす影響はまだ研究されていません。

この論文の目的は、MICP の化学反応効率に対する細孔スケールの不均一性の影響を調査することでした。 同じ初期多孔率をもつ 2 つのタイプのメートル長のマイクロ流体: 均一マイクロ流体と不均一マイクロ流体が作製されました。 この研究では、化学反応効率の評価と、均一および不均一多孔質媒体の透過性に及ぼす生成された沈殿 CaCO3 塊の影響の比較のための新しい実験設定を紹介します。 CaCO3 の沈殿は、メートル長の経路に沿ったさまざまな場所で一時的および空間的に監視され、細孔スケールについての洞察が得られました。 画像処理アルゴリズムは、実験画像を分析し、細菌の数、反応時間と空間分布に関して個々の沈殿鉱物および凝集した沈殿鉱物の核形成と成長を検出するために開発されました。 処理された画像に基づいて、包括的な統計分析が実行され、1 万個以上の細孔にわたるチップ全体に沿った細菌と結晶の分布が推定され、2 つの形状の特徴的な析出パターンが特定されました。

細孔スケールの不均一性の影響を評価するために、平均細孔サイズが数桁をカバーする非常に長いマイクロ流体デバイスを使用する包括的な実験セットアップ（図1a）を開発しました。このデバイスは、75 mmの顕微鏡スライドガラスに取り付けられます。図 1b、c に示すように 50 mm。 同じ注入戦略を、同じ多孔度 (n = 0.5) を持つ 2 つの異なる微小孔形状に 3 回適用しました。1 つは均質 (チップ全体で同じ細孔サイズ)、もう 1 つは不均質、つまり粒子間の距離が空間的に可変です。 最初の形状は、細孔スロートサイズ（λ1）が 50 μm に等しい同一の円筒形の固体粒子の規則的な格子で構成されていました（図 1b）。一方、2 番目の形状は、不規則に分布した固体粒子で構成され、細孔スロートサイズは 25 ～ 25 μm でした。から 350 μm、平均 λ2 = 70 μm (図 1c)38。 これらの人工多孔質媒体は、長さ L = 990 mm、幅 W = 3 mm、厚さ H = 0.050 mm で、均質多孔質媒体の場合は L = 19800λ1、W = 60λ1、H = λ1、L = 14143λ2、W = 43λ2、および不均一な多孔質媒体の場合、H = 0.7λ2。

(a) 実験セットアップの概略図。 注入戦略には、(1) 出口からの Milli-Q 水の注入、(2) 出口からの BS の注入、および (3) 入口からの CS の注入が含まれます。 PS1 と PS2 はそれぞれ入口と出口に接続された圧力センサーを示します。 BioRender.com で作成。 (b) 均一な多孔質媒体のマイクロ流体設計。 (c) 不均一な多孔質媒体のマイクロ流体設計。

マイクロ流体チップは、標準的なソフト フォトリソグラフィー プロセスを使用して製造されました。 PDMS デバイスは、Karadimitriou および Hassanizadeh39 によって説明されたプロトコルに従って製造されました。 PDMS ベースを硬化剤と 10:1 の比率で完全に混合しました。 続いて、混合物を真空中で脱気した後、型に流し込み、60 °C のオーブンで少なくとも 4 時間硬化させました。 PDMS マイクロ流体チャネルを型から取り外した後、直径 1.2 mm の入口と出口を打ち抜きました。 PDMS チップとガラスカバーの両方がプラズマで処理され、PDMS 表面が砂のように親水性 26 になりました。 次に、チップをガラスカバーに取り付け、100 °C のホットプレート上に少なくとも 30 分間置き、強力な永久結合を確保しました。 続いて、マイクロ流体チップをデシケーター内に置き、PDMS を約 30 分間脱気しました。これにより、チップの飽和中に PDMS に吸収された気泡が確実に除去されます。 PDMS はわずかにガス透過性の材料であるため、S. パストゥリの好気性増殖が可能になります。 ただし、実験を長時間実行すると、水が蒸発する可能性があります40。 したがって、実験が 24 時間未満で実行されるように注入戦略が選択されました。

現在の研究では、液体微生物増殖培地 (American Type Culture Collection (ATCC) 1376) を使用しました。これは、20 g/L 酵母エキス、10 g/L 硫酸アンモニウム、初期 pH の 0.13 mol/L トリス緩衝液水溶液から構成されています。 ９を別々に滅菌し、混合したものを使用した。 -80℃で保存したスポロサルシナ パストゥリを、4 mLの新鮮なATCC 1376増殖培地に接種しました。 細菌細胞を、180 rpm、30 °C の振盪インキュベーター内で 48 時間増殖させ、定常状態に達しました。 光学濃度（OD）は、分光光度計を用いて600 nmの波長で測定しました（OD600）。 マイクロ流体研究で使用される細菌懸濁液 (BS) は、光学密度が 0.4 ～ 0.55 になるように希釈 41 して得られました。 セメンテーション溶液（CS）は、等モル濃度（1 mol/L）のモル濃度 60.06 g/mol の尿素（CH4N2O）とモル濃度 110.98 g/mol の塩化カルシウム（CaCl2）（無水 Sigma-Aldrich）を希釈して調製しました。 Milli-Q 水中のモル。

実験は、温度 25 ± 1 °C のよく制御された環境で行われました。 以下では、(i) MIlliQ 水によるチップの飽和、(ii) BS の注入、および (iii) CS の注入の 3 つの連続注入で構成される注入戦略を詳細に説明します。その間、実験設定はわずかに変更されます。以下で説明します (図 1a)。 同じチューブを使用して BS と CS を注入すると、2 つの溶液が混合し、その後、マイクロ流体セットアップと比較して断面積が大きいチューブ内で尿素分解と沈殿が発生します。 したがって、結果として生じる降水量は、1 m の距離にわたる空間分布を表すものではありません。 したがって、使用したMilli-Q水とBSはマイクロ流体チャネルの出口（図1b、cの「出口」）から注入され、CSは入口（図1b、cの「入口」）から注入されました。 ）。 高精度圧力センサー (入口での動作範囲が 340 mbar の Elveflow MPS-S-1、出口での動作範囲が 70 mbar の Elveflow MPS-S-0) を流れの 7 cm 付近に直列に配置しました。入口から4cm、出口から4cm。 このセンサーにより、CS 注入中だけでなく、非流動滞留および沈殿段階でも流動条件下で 2 点間の圧力差を推定することができました。 圧力センサーはテープで顕微鏡ステージに固定され、Elveflow OB1 圧力コントローラー 42 に接続されました。 脱気したマイクロ流体チップをステージ上に水平に配置した。

表 1 は、BS と CS の組成と選択された注入戦略を示しています。 Milli-Q 水でマイクロ流体チップを飽和させるために、出口近くの圧力センサーを出口とガラス製注射器 (Hamilton) に接続し、シリンジ ポンプ (Harvard Apparatus) に取り付けられた 1 ～ 10 mL の Milli-Q 水が入ったようにしました。 )、入口は大気に開放されたままでした。 すべての接続には、Tygon チューブ 1/16 インチを使用しました。 チップは、流速 0.2 μL/s で 2 つの細孔容積の Milli-Q 水で飽和されました。 注入の終わりに、空気がマイクロ流体チップに浸透しないように、小さな水の泡が入口で観察された。 続いて、気泡が PDMS に吸収されるように、次のステップまで 30 分の時間間隔を置きました。

マイクロ流体チップが完全に飽和した後、出口からBSを注入した。 この目的のために、Milli-Q 水を含むシリンジを、BS を含む 5 mL のガラス製ハミルトン シリンジに置き換えました。 ５００μＬ（約７チップ細孔容積７５μＬ）の細菌注入を４０分間続けて、チップ全体に沿って細菌がほぼ均一に分布するようにした。

細菌注入段階の終わりに、細胞が沈降している間に、チャネルに沿った 19 の位置が観察のために選択されました。 このステップは約 1 時間続き、19 の異なる場所の位置と焦点を設定するのに必要でした。 この間、細胞は注射前の初期 OD600 0.40 ～ 0.55 から増殖しました。 したがって、セメンテーション注入の開始に対応し、初期の細菌濃度を表すことができる t = 0 で画像をキャプチャしました。 注入口から CS を注入するには、まず、排出口に接続されているガラス製注射器を慎重に取り外し、流出チューブを流出液収集用の 50 mL ファルコン チューブに配置しました。 Falcon チューブには 50 mL の Milli-Q 水が含まれており、蒸発を防ぎ、安定した流れ/流れのない状態を確保するために、注入中と流れがない状態の両方でパラフィルムとアルミ箔で覆われていました。 すでにBSで飽和しているCSを含むチューブがチップデバイスに接続されるとすぐに、尿素加水分解が入口で始まりました。 次に、10 mL のガラス製ハミルトン シリンジをシリンジ ポンプに取り付け、圧力センサーを介して入口チューブに接続しました (図 1a)。 注入口チューブをチャネルに接続する前に、接続時に完全に飽和するようにパイプの端に液滴が現れるように完全に飽和させました。 セメンテーション注入は流量 0.018 μL/s で実行されました。これは浸透速度 0.24 mm/s に相当し、実験室で調製された高さ 10 cm、直径 5 cm の砂サンプルに対して計算された浸透速度と同じです。 、気孔率 0.4、流速 10 mL/min4 で注入されました。 CS の保持時間は 12 ～ 24 時間でした。 適用される流量は、 \(Re = \frac{{\rho \overline{\lambda }\overline{u}}}{\mu } \ll 1\) のレイノルズ数に対応します (表 S1)。 \uprho\) は水の密度 (kg m−3)、\(\overline{\lambda }\) は平均細孔スロートサイズ (m)、\(\overline{u}\) は平均流体速度 ( ms−1)、\(\mu\) は水の動粘度 (kg m−1 s−1) です。 したがって、チップ内の流れは、粘性力によって支配される、ストークス流としても知られるクリーピング流として特徴付けることができます。 6 チップ細孔容積の CS を 6.75 時間注入しました。この期間中、新しい溶液の供給下で結晶核形成と成長が捕捉され、保持期間中継続されました。 比較のために、Xiao ら 29 は 7 つのチップ細孔容積からなる 1 回の注入ステップを報告しましたが、Kim ら 30 は各サイクルが約 100 細孔容積からなり 48 時間間隔で繰り返される 10 サイクルの処理を実施しました。 それにもかかわらず、これらの研究ははるかに短いチップに言及しており、単一の細孔容積の注入に必要な時間はわずか数分です。

タイムラプスイメージングは​​、Nikon DS-Ri2 デジタルカラーカメラを備え、NIS-Elements ソフトウェアによって制御される完全自動倒立 Nikon Eclipse Ti2 顕微鏡 (Plan Fluor 10 × 位相コントラスト対物レンズ) によって実行されました。 8,813 ピクセル（横方向 2.57 mm）× 13,252 ピクセル（縦方向 3.87 mm）のサイズの 9 枚のタイル状の画像で構成され、3 × 3 フィールドの大きな画像が、経路に沿った 19 位置で記録されました（図 2a）。 ）位相コントラスト（図2b）と明視野（図2c）という2つの異なる構成を備えています。 サンプリングされた 19 個の位置には、入口と出口の穴、入口と出口の近くの 3 つの位置 (左、中央、右)、および各列の中央が含まれます。 画像は改良された位相差顕微鏡（照明がほぼ横方向から起こるように、ph3 リングと ph1 対物レンズを組み合わせたもの）で撮影されたもので、暗い背景で細菌がわずかに明るくなり、結晶が明るく見えます。 対照的に、明視野顕微鏡構成（コンデンサーなし）で撮影された画像では、結晶の輪郭は暗く見えますが、細菌と背景は明るく見えます。 カメラの露光時間は、位相コントラスト イメージングの場合は 50 ms、明視野イメージングの場合は 2 ms に設定されました。 0.29μm/ピクセルの高分解能で細菌と結晶の両方を観察しました。 上で述べたように、位置は細菌の沈降中に選択され、焦点はチップの底部 (スライドガラス上) に存在する単一の不動細胞に基づいて作成されました。 CS の 1 つの細孔容積の注入時間は約 62 分でしたが、取得システムは前述の 2 つの光学構成で位置 1 から位置 19 までの画像を収集するのに 10 分かかりました。 収集された大規模なデータ系列の計算時間を最適化するために、画像取得の時間間隔は、より遅い成長速度が予想されるため、流動状態では 1 時間、保持フェーズでは 2 時間でした。 したがって、マイクロ流体チップ内のMICPの時間的変化をリアルタイムで監視しました。

(a) サンプリングされた位置。 (b) 位相差顕微鏡で取得した元の画像の緑色チャネルの寸法 1.022 mm × 1.022 mm のセクション、および (c) 位相差顕微鏡で取得した元の画像の緑色チャネルのセクション。

我々は、2 種類の生画像 (位相コントラストと明視野) の組み合わせ処理から沈殿した CaCO3 と細菌を識別するための包括的な画像処理アルゴリズムを MATLAB 言語で開発しました。

生の実験画像は 24 ビット RGB カラー画像で、それぞれが赤、緑、青の色を表す 8813 × 13,252 の 3 つの行列で構成されます。 各マトリックスには、0 (黒) から 255 (白) までの範囲の値が含まれます。 3 つのチャネルは、NIS Elements ソフトウェアを使用して 8 ビット グレースケール画像として個別に抽出されました (図 S1、S2)。 細菌細胞は緑色のチャネルで最大の強度を示し（図S1）、結晶も緑色のチャネルで最大の吸光度を示すことがわかりました（図S2）。 したがって、取得した画像の緑色のチャネルのみをさらに処理して、固体培地の構造 (粒子)、細菌、および沈殿した CaCO3 をセグメント化しました。 入口でのチューブの接続とCSの注入後、正に帯電したカルシウムイオンが負に帯電したS.パストゥリ細胞に結合するため、大きな細菌凝集体が入口付近に形成されました26（図S3）。 これらの凝集体の強度は、沈殿した CaCO3 の強度と同様です。 したがって、入口の最も近くで撮影された画像 (x = ~5 mm) はそれ以上処理されませんでした。

最初のステップとして、各位置からの画像が 2 つの異なる時点で選択されました: (i) 細菌のみが観察できる CS 注射の開始 (t = 0)、および (ii) CS 注射の終了後(t = 10 時間)、細菌と結晶の両方が観察できました。 画像は、各ピクセルが 0 (暗いピクセル) と 1 (明るいピクセル) の間の値を持つように 255 で正規化されました。 以下では、固体粒子、バクテリア、沈殿した CaCO3 ミネラルの 3 つの相を検出するワークフローを説明します。

t = 0で撮影された明視野画像から円筒形の固体粒子（つまり、画像内の円）を分離するために（図3a）、画像は適応閾値を超える値を置き換えるMATLABの「Imbinarize」関数で二値化されました。しきい値を下回る値は 1 (白)、しきい値を下回る値は 0 (黒) となります。 この適応型しきい値処理方法は、ピクセルの近傍の局所平均強度に基づいてしきい値を選択します。 「ForegroundPolarity」「dark」オプションは、柱の強度が背景の強度よりも低いため、柱の輪郭を検出するために使用されました。 しきい値は「感度」パラメータによって決定され、0 から 1 までの値を取ることができます (補足資料を参照)。 より高い感度を使用すると、より多くのピクセルが柱の輪郭として定義されます。 結果として得られる二値画像は、円形粒子とバクテリアの周囲、黒で示された円形粒子内部のノイズ、白で示された円形固体粒子の細孔空間と内部で構成されます（図 3b）。

t = 0 での明視野画像からピラーのバイナリ画像を抽出するワークフロー (a) グリーン チャネルの生画像の寸法 1.022 mm × 1.022 mm のセクション、(b) 画像の二値化、(c) 反転およびフィルタリング「bwpropfilt」で騒音と細菌を除去する。 (d) 「imfill」で柱を白く埋める。

円形粒子内のバクテリアとノイズを表すピクセルは、逆バイナリ イメージで「bwpropfilt」関数を使用して除去されました。 その結果、柱の周囲に相当する円が白色、細孔空間が黒色の二値画像が作成されました（図3c）。 最後に、「imfill」を使用して、円形の固体粒子を白色で塗りつぶしました（図3d）。

細菌は、t = 0でキャプチャされた位相コントラスト画像から分離されました（図4a）。 各画像は、「ForegroundPolarity」パラメータを「dark」オプションに設定し、適応しきい値処理方法を使用して「Imbinarize」で二値化されました。 バクテリアの強度はバックグラウンドよりわずかに高く、ピラーや結晶の周囲の強度よりははるかに低いため、「感度」の値は、バクテリアを検出するために試行錯誤して 0.1 ～ 0.2 の間で定義されました。 得られた二値画像では、細菌と柱の周囲が白く表示され、細孔空間と円形粒子の内部が黒で表示されます（図4b）。 次に、図 3d で以前に取得したバイナリ画像の柱に対応するピクセルを白に設定します (図 4c)。 最後に、画像領域アナライザーで定義された 10 ～ 900 ピクセル 2 (2.9 ～ 261 μm2 に相当) の領域の粒子をフィルター処理することにより、ピラーから細菌を分離しました。 細菌が黒い背景に白く見える二値画像が得られました（図4d）。 細菌は細胞分裂後に成長するため、さまざまな長さを示しました（図S4）。 同じ手順に従って、この時点でキャプチャされた位相コントラスト画像（図4e）からt = 10時間（図4f〜h）で細菌を分離しました。

t = 0 での位相コントラスト画像から細菌のバイナリ画像を抽出するワークフロー (a) グリーン チャネルの生画像の寸法 1.022 mm × 1.022 mm のセクション。 (b) 画像の二値化。(c) 図 3d の柱に対応するピクセルを白に設定します。(d) 「bwpropfilt」で柱を削除します。 t = 10 で (e) 緑チャネルの生画像。 (f) 画像の二値化、(g) 図 3d の柱に対応するピクセルを白に設定、(h) "bwpropfilt" で柱を削除します。

続いて、沈殿したCaCO3をt = 10時間で撮影した明視野画像から分離しました（図5a）。 適応型しきい値処理方法が使用され、「Imbinarize」オプションの「ForegroundPolarity」パラメーターを「dark」オプションに設定しました。 「感度」は、沈殿した CaCO3 の周囲を検出するために、試行錯誤で 0.4 ～ 0.5 の間で定義されました。 得られた二値画像では、結晶の周囲、柱、および少数の細菌は白く見えますが、細孔流体と円形粒子の内部は黒く見えます（図5b）。 MATLAB 関数「Imclose」を使用して、結晶の輪郭のエッジを滑らかにし、既存の穴を閉じました (図 5c)。 次に、「imfill」機能を使用して、結晶と柱を白で塗りつぶしました（図5d）。 さらに、図 3d の柱に対応するピクセルはゼロに設定されました。 次に、図3dのバイナリ画像をこのバイナリ画像から差し引いて、柱とその周囲を削除しました（図5e）。 実験中の照明の変化により、いくつかの柱の輪郭が残り、沈殿したCaCO3の体積に考慮されないようにそれらを除去するには追加の手順が必要でした（補足資料を参照）。 分離されたCaCO3相を図5fに示します。

t = 10 時間の明視野画像から結晶のバイナリ画像を抽出するワークフロー (a) 緑色チャネルの生画像の寸法 1.022 mm × 1.022 mm のセクション。 (b) 画像の 2 値化、(c) 結晶の輪郭のエッジを滑らかにし、既存の穴を閉じる MATLAB 関数「Imclose」、(d) 結晶と柱を白で埋める「imfill」関数、(e)図 3d の柱に対応するピクセルを黒に、(f) 結晶セグメンテーションの最終結果 (g) 細孔流体 (白)、固体粒子 (黒)、および細菌 (シアン) をセグメント化する画像処理アルゴリズムの最終結果t = 10 時間で。

アルゴリズムによって生成された最終処理画像では、細孔空間が白 (ピクセル値 0)、細菌がシアン (ピクセル値 1)、CaCO3 が赤 (ピクセル値 2)、柱が黒 (ピクセル値) で表示されます。 3）（図5g）。 このアルゴリズムを使用すると、明視野画像の緑色のチャネルの周囲の強度が小さいため、小さな結晶を同じサイズの細菌と区別できます。

細菌の表面被覆率は、細菌のバイナリ画像の値 1 を持つピクセルの面積を (MATLAB 関数「bwarea」を使用して) 計算することによって推定されました (図 4d)。 幅約 0.9 ～ 1.2 μm、長さ 2 ～ 3.5 μm という Sporosarcina pasturii 細胞の報告されたサイズと、細菌が細胞分裂によって増殖することを考慮すると 23、以下の計算では、個々の細菌の直径が長さ 4 μm であると仮定しました。幅 1 μm。細菌の数を計算するために、細菌の表面被覆率を個々の細菌の平均サイズ 4 μm2 で割りました。 細菌濃度は、Sporosarcina pasterii43 の棒状の形状に起因して、3 次元の幅 1 μm を想定し、細菌数を各画像の細孔容積で割ることによって推定されました。 細孔容積は、サンプリング位置の総容積から粒子容積を差し引くことによって推定されました。 サンプリングされた各位置の粒子の体積は、柱のバイナリ画像（図3d）内の値が1のピクセルの面積を計算し、マイクロ流体の深さ（50μm）を掛けることによって得られました。

結晶の形状が球形であると仮定すると 30、37、その等価直径 D は短軸と長軸 (単一または集合体) の平均として定義されました。 したがって、それらの等価体積は \(V_{cr,i} = \frac{4}{3}\pi \left( \frac{D}{2} \right)^{3}\) となります。 各サンプリング位置で沈殿した CaCO3 の総質量を計算しました。

ここで、ρ = 2.71 g/cm3 は方解石の密度、n は検出された鉱物の数 (単結晶と結晶集合体の両方の場合があります) です。

MICP の化学反応効率 E は、カルシウムがチャネルに沿って均一に分布していると仮定して、あたかも局所的に入手可能なカルシウムがすべて反応したかのように、測定された CaCO3 質量の理論的最大値に対する比率として定義されます。 したがって、採用された設定により、特定の沈殿パターンに光を当てることができ、次のような質問に答えることができます: (i) CaCO3 は、カルシウムが主に利用できる入口付近に優先的に堆積しますか? (ii) 細孔ネットワークの不均一性は、反応経路を横切る CaCO3 の堆積に影響を及ぼしますか。

注入された CS 内のカルシウム濃度は \(C_{{{\text{Ca}}^{2 + } }} = c_{{{\text{Ca}}^{2 + } }} M_{{{ \text{Ca}}^{2 + } }}\)、ここで \(c_{{{\text{Ca}}^{2 + } }} = 1\frac{{{\text{mol}}} }{L}\) はカルシウムのモル濃度で、\(M_{{{\text{Ca}}^{2 + } }} = 40.08\frac{{\text{g}}}{{\text{ L}}}\) はカルシウムのモル質量です。 したがって、 \(C_{{{\text{Ca}}^{2 + } }} = 40.08\frac{{\text{g}}}{{\text{L}}}\) となります。

化学式の化学量論によれば、 (2)、1 mol の \({\text{Ca}}^{2 + }\) が 1 mol の \({\text{CO}}_{3}^{ - 2}\) と反応して、 CaCO3 1モル。 したがって、注入された \({\text{Ca}}^{2 + }\) 40.08 g/mol は、マイクロ流体チップから洗い流される前にそのすべてが炭酸塩と反応すると、理論的には 100.09 g/mol CaCO3 を形成できます。

沈殿した CaCO3 の理論質量は次のとおりです。

ここで、\(M_{{{\text{CaCO}}_{3} }} = 100.09\;{\text{g/mol}}\) は CaCO3 のモル質量、\(Q\) は流量です、\({\Delta }t\) は CS 注入の開始からの時間間隔です。

各位置での局所的な化学効率は次のように計算されました。

ここで、 \(m_{{{\text{CaCO}}_{3} ,{\text{t }}}}^{{({\text{s}})}}\) は、 (3) で計算された各サンプリング位置の析出 CaCO3、\(PV_{l}\) は特定の位置の細孔容積、\(PV_{TOT} = 74\;\upmu {\text{L}}\ ) は、マイクロ流体チャネルの総細孔容積です。 各位置は \(PV_{TOT}\) の約 0.3% に相当します。 CS 注入の終了時、沈殿した CaCO3 の理論的質量はチップ全体で \(44.3\;{\text{mg}}\) ですが、サンプリングされた各位置では局所的な条件に応じて 110 ～ 130 μg になります。利用可能な細孔スペース。

細菌密度は、CaCO3 沈殿物の増殖速度、サイズ、数に影響を与えると考えられています26。 図 6a は、CS 注入の開始時 (t = 0) (図 6a) および t = 12 時間 (図 6b) における 3 回の実験で平均したチップ上の細菌濃度を示しています。 t = 0 では、細菌の平均濃度は、0 ～ 800 mm で不均一多孔質培地よりも均一培地の方が均一であり、~8 × 107 細胞/mL から 1.03 × 108 細胞/mL の範囲です。不均一多孔質培地では、細菌濃度は最初の 400 mm で約 2 × 108 細胞/mL から 1 × 108 細胞/mL に減少し、420 ​​mm でピークを示し、その後間隔 600 で約 1 ～ 1.05 × 1.05 × 108 細胞/mL に低下します。 –800 mm、均質な多孔質媒体中の濃度よりも約 50% 高いままです。 出口付近では、均質および不​​均質マイクロ流体システムの両方で、約 3 × 107 細胞/mL から 4 × 107 細胞/mL までのより低い細菌濃度が検出されました。

(a) CS 注射開始時の S. パストゥリの細菌濃度 (t = 0)。 (b) メートル長の反応経路を横切る t = 12 時間。 点は 3 回の反復の平均を表します。 影付きの領域は、3 つの反復の平均絶対偏差を表します。

CS 注入中、ピラーやスライドガラスに付着しなかった細菌は、CaCO3 結晶中に輸送またはカプセル化されました (図 7)。 t = 12 時間の時点では、不均一多孔質培地の方が均質培地よりもわずかに高い平均細菌濃度約 3 × 107 細胞/mL から 7 × 107 細胞/mL が保持され、平均濃度は約 2.5 × 107 細胞でした。 /mL から 5 × 107 細胞/mL までが 0 ～ 900 mm で観察され、出口近くではほとんどの細菌が洗い流されました。

均質なマイクロ流体チップの選択された細孔内での単結晶および結晶凝集体の成長は、入口から約 423 mm で捕らえられました。

均一および不均一マイクロ流体チップの選択された細孔における結晶成長の画像を、それぞれ図7および図8に示します。 結晶核形成は、均一および不均一多孔質媒体の両方で CS 注入の開始から 1 時間後に始まりました。 図 7 は、CS 注入開始から 3 時間後、入口から約 423 mm で形成された単一の CaCO3 結晶を示しています。 結晶はピラーとスライドガラスの両方で核形成され、細菌はそこに付着したままでした。 当初、すべての結晶は、隣接する固体粒子を橋渡しできるほど大きくないサイズを示しました。 t = 4 時間では、さらに 5 つの単結晶 (2 つは焦点が合っていません) が形成され、一方、既存の結晶は大きく成長しました。 単結晶の 1 つは、隣接する 2 つの粒子を橋渡しできるほど大きく成長しました。 他の 2 つの結晶が融合して結晶集合体を形成し、これも隣接する 2 つの固体粒子を橋渡ししました。 t = 5 時間では、すべての結晶が大きく成長しました。 しかし、その後の 1 時間 40 分の連続 CS 注入期間中、または t = 18 時間までの無流動期間中、この選択された位置ではさらなる結晶成長は観察されませんでした。

多孔質媒体の不均一レプリカの 3 つの円筒形固体粒子間の細孔空間における結晶凝集の進化。 この細孔は、入口から約 730 mm のサンプリング位置にあります。

図 8 は、CS 注入の開始から 1 時間後に形成された 4 つの小さな単結晶 CaCO3 を示しています。 Wang et al.13 と同様、互いに近い単核生成点は、それらが融合して結晶集合体 (メソ結晶 2) を形成するまで、別々に成長しました。 ここでは、ほとんどの成長は最初の 4 時間以内に発生しましたが、18 時間までは非常に遅い速度で成長が続きました。 この傾向は、塊状結晶成長のプロットによっても確認できます (図 9)。 この図は、(a) 入口付近と (b) マイクロ流体の中央の 2 つの位置での結晶塊の成長を示しています。 不均質な多孔質媒体では、成長が全体的により高かったことが観察できます。 どちらの多孔質媒体でも、増殖の大部分は最初の 4 時間以内に観察されました。 しかし、不均一多孔質媒体では、続く 9 時間の MICP 処理における増殖速度は、プラトーを示した均一多孔質媒体の増殖速度よりも高かった。 ほとんどの場合、結晶成長は 6 時間 40 分の CS 注入終了後 5 時間 (t = 12 時間) で完了しました。

均質および不​​均質多孔質媒体に沿った 2 つの位置 (a) x = 30 mm および (b) x = 574 mm での 12 時間の MICP 処理中の結晶塊の成長。 点は 3 回の反復の平均を表します。 影付きの領域は平均絶対偏差を表します。

流れの横方向における沈殿したCaCO3の分布は位置によって異なり、結晶は面全体を占めるか境界近くを占めます（図S5）。 これは、混合が促進されるゾーンに反応物をもたらす流路または優先経路を変化させる CaCO3 の沈殿に起因すると考えられます。 しかし、色素を用いた実験により、2 つのチップ内の流れ状況と、それが進化する細孔空間内での反応物の混合にどのような影響を与えるかについて、より多くの洞察が得られる可能性があります。

本研究における化学反応効率は、注入されたカルシウムが CaCO3 に変換される割合として定義されます。 沈殿した CaCO3 の推定質量は、均一多孔質媒体と不均一多孔質媒体の両方でマイクロ流体チャネルの中央にピークを示します (図 10a)。 図 10b は、均一および不均一な多孔質媒体における推定化学反応効率を示しています。 均一多孔質媒体と不均一多孔質媒体はどちらも、距離に関して不均一な反応効率を示します。 均質な多孔質媒体では、入口付近の効率は低く、420 ​​mm で平均 22% で最大に達しますが、600 ～ 990 mm の間では 11% 未満にとどまります。 対照的に、不均一多孔質媒体は、マイクロ流体の中央でより高い標準偏差とともに 37% の反応効率のピーク値を示し、入口から 500 ～ 900 mm の距離では 15 ～ 28% の値を示します。 この発見には、三重の分析後の不均一な多孔質ネットワークの偏差がより小さいことがさらに伴います。 私たちは、本研究で測定された効率値と実験室規模のサンプルについて文献で報告されている効率値との間の乖離 (通常 40%2 を超える) は、3D カラム実験における表面の利用可能性が高いためであると仮定します。粒子の角度とより複雑な三次元流路により、細胞の付着と方解石の沈殿が促進されます。

(a) 沈殿した CaCO3 の最終質量。 (b) 結晶成長が完了した MICP 処理終了時 (t = 12 時間) の推定反応効率。 点は 3 回の反復の平均を表します。 影付きの領域は、3 つの反復の平均絶対偏差を表します。

上記の発見に基づいて、予備的な観察は、BS と CS の導入に反対側の端を使用することにより、チップの中央でバイオセメンテーションが増加し、その後 CS 流路に向かって進化するということです。 ただし、フロー ネットワーク自体のアーキテクチャが、反応効率と結晶特性の点でこの進化に影響を与えているようです。 考えられる説明の 1 つは、均質な多孔質ネットワークにおける CaCO3 の主な傾向は、細孔喉を詰まらせるほど十分に成長しない小さな単結晶の傾向であり、最終的にはさらなる反応物質を引きつけ、その結果効率が低下するというものです。 不均質な多孔質構造の場合、傾向は異なり、さまざまな核形成点がより大きな凝集体に成長し（図11）、そのため詰まった細孔スロートのサイズが大きくなり、ネットワークの曲がりくねりに動的に影響を与えます。

(a) 結晶の平均直径。 (b) t = 12 時間における結晶の最終数。 点は 3 回の反復の平均を表します。 影付きの領域は、3 つの反復の平均絶対偏差を表します。

これらの特徴的な傾向は図 11a、b にさらに示されており、結晶の数とサイズは 2 つのチップで異なります。 600 ～ 800 mm の間では、結晶は均質媒質 (\(D_{eq}\) = 28 ～ 35 μm) よりも不均質媒質 (\(D_{eq}\) = 35 ～ 40 μm) の方が大きく見えます。そして、チップの後半でより大きな平均絶対偏差が得られました (図 11a)。 さらに、より多くの結晶（200 ～ 300 個の結晶）が 480 ～ 900 mm の間の不均一な多孔質ネットワークに捕捉されました。これは、均一なネットワーク（同じ間隔に 60 ～ 100 個の結晶）と比較して、より高い方解石の質量と効率を反映しています。 、最初の 200 mm でより低いバイオセメンテーションが捕捉されました。

CS注入中にマイクロ流体チャネルの透過性を測定しました。 非圧縮性流れに関するダーシーの法則を固有透磁率 k (m2) の観点から整理すると、次のようになります。

ここで、\(Q\) は強制流量 (m3/s)、\(\mu\) は水の動粘度 (N・s/m)、L (m) はマイクロ流体チャネルの長さ、A ( m2) は断面積 (HxW)、\(p_{1}\) (N/m2) は入口での測定圧力、\(p_{2}\) (N/m2) は測定圧力です。アウトレットで。

結晶が形成および成長する間のCS注入は、前述のように6時間40分間継続した。 図 12 は、均質および不​​均質多孔質媒体における実験の 3 回目の反復に対する CS 注入中の入口と出口の間で測定された圧力差を示しています。 生データは、Matlab の Savitzky-Golay フィルター 45 を使用して平滑化されました。これは、時間領域にわたる局所最小二乗多項式フィッティングに基づく移動ウィンドウ技術です。 圧力センサーは、結晶核生成と成長による空隙率の減少による圧力差の増加を捉えることができ、4 ～ 5 時間後にはほぼ定常状態に達しました。 これは、結晶成長の大部分が CS 注入の最初の 4 ～ 5 時間で起こるという、定性的 (図 7、8) および定量的 (図 9) の両方で結晶成長に関して観察された傾向と一致しています。 図 12 は、式 1 を使用して導出された固有透磁率の展開を示しています。 (6)。

(a) 圧力差の変化の生データとフィルター処理されたデータ (Savitzky-Golay フィルター 45 を使用)。 (b) CS 注入中の計算された固有透過性の変化。

CS 注入の終了後、均一な多孔質媒体の透過性の 16% の低下が観察されましたが、不均一な多孔質媒体の場合、その低下は 22% でした。 2 つのチップ間の透磁率低下の差はわずか 6% であり、これは、結晶のサイズと数の微視的な違いが巨視的な透磁率に主に影響を与えないことを意味します。 低い透過性の低下は、詰まっていない代替流路が十分に存在することを示しています。 透過率の全体的な変化は、1 桁の予想範囲内に留まります 19。 狭い細孔スロートでの CaCO3 の沈殿は、機械的強度と剛性を高める可能性があります 25,46。対照的に、開放細孔スロートでの沈殿は透過性を効率的に低下させる可能性があります 19,25。

同種および異種チップ内で MICP をリアルタイムで監視し、視覚化しました。 この研究では、MICP 処理中の透過性変化の評価と効率計算のための新しい実験設定が提示されました。 軌道に沿ったさまざまな位置での細菌の数と沈殿物の質量を定量化して、方解石の分布と反応効率を表現し、最終的に沈殿パターンに対する細孔ネットワークの影響を決定しました。 この研究では、包括的な画像取得によって生成される大量のデータの処理を容易にするために、MATLAB ベースの画像処理ワークフローが導入されました。 この研究から得られた主な結論は次のとおりです。

6 細孔容積の CS を連続注入すると、CS の注入開始から 1 時間後に CaCO3 結晶が形成され、12 時間後に両方のマイクロ流体チャネルで完了しました。

同一の処理条件が適用されたことを考慮すると、チップに沿ったさまざまな位置で生成された CaCO3 の質量に関する結晶成長は、不均一な多孔質媒体の方が全体的に高くなります。

BS と CS の導入に反対側の端を使用することにより、不均一な多孔質媒体では、バイオセメンテーションがチップの中央 (420 mm) で 34% に増加し、その後 20% を超える値で CS 流路に向かって進化しました。均質な多孔質媒体では、CS 注入点から 420 mm 後に 27% のピークに達し、残りのマイクロ流体媒体では反応効率は 12% 未満にとどまりました。 これは、両方の培地の初期細菌分布がほぼ同一であるにもかかわらず、直径が大きくなる結晶の数が増加する傾向が観察されたことに起因すると考えられます。 これは、反応性流路の動的な進化が、MICP によって誘発される CaCO3 堆積物の最終的な進化を理解するための重要な情報源であることを意味します。

上記の所見は、均質チップと不均質チップに注入する前の初期処理条件 (OD、流量パラメーター、注入設定) が同一であった 3 回の比較後に得られました。 均質な多孔質媒体では平均速度が均一であり、細菌の分布が均一になります。 対照的に、より高い速度とより低い速度のゾーンで構成される不均一な多孔質媒体では、より多くのバクテリアがチップの後半に蓄積し、これにより結晶に利用可能な核形成サイトがさらに多くなる可能性があります。 これは、多孔質材料の固有の特性とその多孔質ネットワークの構造が、降水の運命と曲がりくねった反応経路に影響を与えることを示唆しています。 私たちの研究は、地体力学の伝統的な分野で成長が期待される分野である顕微鏡、大規模データ解析、マイクロ流体デバイスの技術進歩を利用することにより、MICP の進化と利用可能な流れネットワークへの適応に新たな光を当てています。

提案された実験セットアップと画像解析フレームワークは、微小容量を使用したさまざまなレシピを使用した複数の治療パターンを介して、MICP のリアルタイムモニタリングに拡張できます。

この研究に使用されたデータセットとコードは、DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.7319582 で公開されると利用可能になります。

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この研究は、欧州連合の Horizo​​n 2020 研究およびイノベーション プログラム (助成契約番号 788587) に基づいて欧州研究評議会 (ERC) から資金提供を受けています。 著者らはまた、ローザンヌ大学 (Unil) の環境流体力学研究室、細菌培養の促進についてステファン・マヘ博士、およびメートル長のマイクロ流体チャネルの微細加工について浜田真由美博士に感謝したいと思います。

土壌力学研究所、EPFL、1015、ローザンヌ、スイス

アリアドニ・エルマログロウ、ディミトリオス・テルジス、リエス・ラルイ

環境流体力学研究所、UNIL、1015、ローザンヌ、スイス

ピエトロ・デアンナ

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AEは室内実験を実施した。 著者 AE、DT、および PdA は、実験室実験の設計、分析、解釈に貢献しました。 LL と DT はこのプロジェクトに対する資金援助を獲得しました。 著者全員が原稿をレビューしました。

ディミトリオス・テルジスへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Elmaloglou, A.、Terzis, D.、De Anna, P. 他メートル長の反応経路におけるマイクロ流体研究により、媒体の構造的不均一性が MICP による生体セメンテーションをどのように形成するかが明らかになりました。 Sci Rep 12、19553 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-24124-6

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受信日: 2022 年 6 月 14 日

受理日: 2022 年 11 月 10 日

公開日: 2022 年 11 月 15 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24124-6

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科学レポート (2023)

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