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May 28, 2023

Nature Communications volume 14、記事番号: 708 (2023) この記事を引用

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74 オルトメトリック

メトリクスの詳細

HIV 曝露前予防 (PrEP) のための超長時間作用型送達プラットフォームは、アドヒアランスを高め、公衆衛生上の利益を最大化する可能性があります。 我々は、皮下投与され、保護ベンチマークを超えてインテグラーゼ阻害剤カボテグラビル（CAB）を6か月以上放出できる、注射可能で生分解性で取り外し可能なin-situ形成インプラント（ISFI）について報告する。 CAB ISFI はメスのマウスおよびメスのマカクザルで忍容性が高く、毒性や慢性炎症の兆候はありません。 マカクザルでは、血漿 CAB 濃度の中央値が 3 週間以内に確立された PrEP 防御ベンチマークを超え、繰り返される直腸 SHIV 感染に対する完全な防御をもたらします。 12週目に2頭のマカクザルに小さな切開を介してインプラントを除去すると、72時間以内に血漿CABレベルが7〜48倍減少した。 CAB ISFI 用量を変換するためのモデリングは、3 mL の注射が投与後 5 か月以上にわたってヒトの予防基準を超えることを示唆しています。 我々の結果は、ヒトにおける超長時間作用型 PrEP に対する CAB ISFIS の臨床的進歩を裏付けています。

2021 年の時点で、流行が始まって以来、世界中で 3,840 万人が HIV とともに暮らしており、4,010 万人がエイズ関連の病気で死亡しています1。 エムトリシタビン（FTC）とテノホビル ジソプロキシル フマル酸塩（TDF）またはテノホビル アラフェナミドを組み合わせた毎日の経口投与による曝露前予防（PrEP）は、高いアドヒアランスのもとで服用すると、HIV 感染の予防に非常に効果的です2,3。 高いアドヒアランスは高い PrEP 有効性をもたらしますが、毎日の経口 PrEP に対する高いアドヒアランスを維持することは依然として大きな課題です 4-6。 低レベルの付着とその後の感染も、薬剤耐性ウイルスの発生につながる可能性があります7。 さらに、高い偏見、低い製品受容性、および/または性的パートナーに製品の使用を開示できないため、遵守レベルの低さは特にサハラ以南のアフリカの若い女性の間で見られます5。 サハラ以南のアフリカは世界中の新規 HIV 感染症の 60% 以上を占めているため、サハラ以南のアフリカ、特に女性における遵守問題を軽減することが PrEP の成功の鍵となります。 この目的を達成するために、HIV 予防オプションのパイプラインは、頻繁な投与を必要とせず、毎日の経口 PrEP に伴うアドヒアランスの課題の一部を克服できる可能性のある長時間作用型 (LA) PrEP 製品の開発に向けて進んでいます。 実際、長時間作用型製品は、特に HIV 感染率が最も高い集団において、毎日の経口投与の遵守と受容性がより高いことが研究で示されています 5、8、9、10、11。 したがって、PrEP の遵守と長時間作用型 HIV PrEP による受容性が高まると、最終的には HIV 感染率が低下する可能性があります。

インテグラーゼ阻害剤カボテグラビル（CAB LA）の注射可能な長時間作用型製剤は、2021 年後半に男性と女性の PrEP に対して FDA によって承認されました 12。 CAB LAの承認は、CAB LAが安全であり、毎日の経口FTC/TDFよりも効果的であることを示したHPTN 083および084試験の結果に続き、おそらく長時間作用型PrEP13、14、15のアドヒアランスの利点を反映していると考えられる。 この研究では、防御に必要な血漿 CAB 濃度がタンパク質調整 90% 阻害濃度 (4× PA-IC90、664 ng/mL16) の 4 倍以上であることも定義されています。 CAB LAは、最初は2か月間毎月、その後は隔月で3 mLの筋肉内注射で投与されます。 CAB LA は HIV PrEP と治療に大きな進歩をもたらしますが、大量の注射量 (3 mL/注射)、注射部位の反応 14,17、および必要に応じて治療を終了するために自己投与または除去できないことが、まだ課題となっています。対処されました。 さらに、最終半減期が長く（>40 日）16、投与後に除去できないため、CAB LA は治療中止後 15 か月以上血漿中に低いが検出可能なレベルの CAB が残留する長い薬理学的テールを示します 18 、19。 これらの次善レベルの CAB は、画期的な感染や薬剤耐性 HIV の発症を引き起こす可能性があるため、将来の感染を防ぐために尾部を覆う経口 PrEP の補充が必要となります 19。 これらの制限を克服するために、現在、取り組みは、6か月ごとまたはそれ以上などの延長された投与間隔を通じて保護血漿CABレベルを維持する、取り外し可能な自己投与（例えば、皮下投与）の超長時間作用型CAB製剤の開発に移行している。 このような製剤は、資源に乏しい国と豊富な国の両方において、大規模な実施を促進し、費用対効果と公衆衛生上の利益を最大化する可能性があります。

in situ 形成インプラント (ISFI) は、長い投与間隔、少ない注入量、回収可能性など、超長時間作用型 CAB 製剤にとって望ましい特性を提供する可能性があります 20,21。 ISFIs は、疎水性で生分解性のポリマー (例: ポリ(乳酸-グリコール酸共重合体) (PLGA))、生体適合性の水混和性有機溶媒 (例: N-メチル-2-ピロリドン (NMP) またはジメチルスルホキシド (DMSO) で構成されています) ）、および均一で注射可能な液体溶液または懸濁液を生成するために共製剤化される医薬品有効成分（API）22、23、24。 筋肉内または皮下空間に注射すると、水混和性有機溶媒が水性環境に拡散し、その結果、相反転が起こり、沈殿したポリマーマトリックス内に捕捉された API を含む固体または半固体のデポーが生成されます 23、24、25、26。 API は、ポリマーマトリックスを通した拡散および時間の経過に伴うポリマーのバルク分解を介してデポから放出されます。

PLGA および NMP を配合した ISFI は、CAB20、21 の HIV インテグラーゼ阻害剤類似体であるドルテグラビル (DTG) の長時間作用型放出について広く研究されています。 NOD scid共通ガンマ鎖ノックアウトマウスおよび骨髄・肝臓・胸腺（BLT）マウスでは、ISFIはPA-IC90の10～100倍を超えるレベルで11か月以上にわたってDTGを放出した。 これらのレベルは、感染マウスにおける複数回の高用量の膣内 HIV 感染からの高い防御とウイルス血症の抑制に関連していました 20,21。 さらに、PLGA は生分解性であるためインプラントの除去は必要ありませんが、この研究では、小さな皮膚切開によってデポーを簡単に回収できることが示されました。 除去後、血漿中の DTG レベルは 24 時間以内に PA-IC90 を下回り、7 日後には検出限界を下回りました 20。 これらの観察を総合すると、ISFI が新規な超長時間作用型送達システムとしての可能性を強調し、CAB を送達する ISFI の広範な評価を裏付けました。

本明細書では、我々は、薬物負荷が高く、少量での皮下投与に適したCAB ISFI製剤を開発し、特徴付けた。 我々は、安定性、微細構造、注入性、および in vitro および in vivo での放出動態を定義しました。 我々は、この製剤がメスのマウスおよびヒト以外の霊長類において安全であり、マカクザルおよびヒトにおいて確立されたPrEP保護のベンチマークを上回るレベルで6〜11か月間CABを放出できることを示した。 我々は、CAB LAおよび他の承認された経口PrEPレジメンの臨床効果を予測したPrEPのマカクモデルにおけるISFIからのCABの持続放出を、SHIV感染に対する長期的な保護と関連付けた。 私たちの研究は、ヒトにおける PrEP 保護に関連することが知られているレベルでの CAB の持続放出のための有望なプラットフォームを特定しました。

ポリマーの種類と分子量 (MW)、溶媒、ポリマーと溶媒の比率、薬物とポリマーと溶媒の混和性、薬物の物理化学的特性など、多くの要因が ISFIS からの薬物放出動態に影響を与えます 20、24、27。 ここでは、最大の CAB ローディングと高い in vitro 放出速度を備えた ISFI を開発するために、溶媒、薬物ローディング、ポリマー分子量、およびポリマーと溶媒の比率の影響を調査しました。 まず、さまざまな溶媒における CAB の飽和溶解度を調査し、最大の薬物負荷を達成するための製剤の理想的な溶媒系を決定しました (補足表 1)。 NMP と DMSO は、ISFI 配合物で一般的に使用される水混和性有機溶媒 24 であるため、これらの溶媒はさまざまな重量比でテストされました。 難溶性薬物の水溶解度を改善できるため、Tween 20、Pluronics、および Gelucire などの賦形剤の添加も研究されました 28。 これらのさまざまな溶媒における CAB の溶解度に基づくと、重量比 1:1 (w/w) の NMP:DMSO (「溶媒」と呼びます) が最も高い CAB 溶解度 (飽和溶解度 167.12 ± 12.04 mg/mL) を示し、したがって、この飽和溶解度を超える安定した ISFI 懸濁液として CAB を配合するために使用されます。

最適化と以前の研究の構築中に、すべての CAB ISFI 製剤は、50:50 PLGA からなる FDA 承認の生分解性ポリマーを使用して生成されました。これにより、ISFI20、21、29 からの抗レトロウイルス薬の超長時間放出が可能になり、次のような良好な分解プロファイルが得られます。数か月以内に完全な分解が引き起こされます30,31。 この分解プロファイルは、その後の ISFI 注入前にポリマーを完全に分解してポリマーの蓄積を防ぐのに理想的です。 さらに、すべての製剤は、10 kDa または 27 kDa の低分子量の 50:50 PLGA で構成されていました。これは、より低い分子量の PLGA は、より高い薬物負荷に対応でき、より多くの薬物放出を誘発し、より高い分子量の PLGA と比較して粘度が低くなり、注射器適性を確保できるためです31。 ISFI システムで使用されます24、32、33。

7 種類の CAB ISFI 製剤の累積 in vitro 放出研究を 35 日間評価し（図 1a）、薬物負荷、PLGA MW、およびポリマーと溶媒の比率の影響を調査し、薬物負荷と放出が最も高い最適な製剤を決定しました。率（図1および補足図1）。 結果は、(1) 薬物負荷の増加 (図 1b)、(2) 溶媒量の増加、(3) PLGA の MW の減少 (図 1c) によって CAB 放出速度が増加することを示しました。 すべての製剤は、非常に低いバースト放出（24 時間以内の放出 3% 未満）、1 か月以上の持続放出、および in vitro で 6 か月以上の放出が予測されました（図 1d）。 349 mg/mL CAB (1:4 w/w PLGA (27 kDa):溶媒) (処方 4)、500 mg/mL CAB (1:4 w/w PLGA (27 kDa):溶媒) (処方 5) を含む ISFI ）、および５００ｍｇ／ｍＬのＣＡＢ（１：４ｗ／ｗ ＰＬＧＡ（１０ｋＤａ）：溶媒）（配合物７）は、最初の３５日間、ゼロ次放出動態を示した。 さらに、薬物負荷（図1b）およびPLGA MW（図1c）を変化させると、CAB放出は有意に異なりました（p < 0.05）。 特に、５００ｍｇ／ｍＬのＣＡＢ（１：４ｗ／ｗＰＬＧＡ（１０ｋＤａ）：溶媒）（製剤７）および５００ｍｇ／ｍＬ（１：４ｗ／ｗＰＬＧＡ（２７ｋＤａ）：溶媒）（製剤）を含有するＩＳＦＩは、 5) PLGA MW の違いにもかかわらず、同等の放出速度論 (p > 0.05) を示しました。

a CAB ISFI 製剤の累積リリース。 b 累積 CAB 放出に対する薬物負荷の影響。 c 累積CAB放出に対するPLGA分子量の影響。 すべての in vitro 放出研究は、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、2% Solutol を含む pH 7.4) 中で 37 °C で行われました。 データは、n = 3 サンプルの平均 ± 標準偏差として表示されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 統計分析: b および c の製剤および時点に関する薬物放出量を比較する Tukey の多重比較検定を使用した二元配置分散分析。 *p < 0.05、***p < 0.001、****p < 0.0001、p > 0.05 の場合は ns (有意ではない)。 d CAB ISFI製剤の放出動態の要約表。 溶媒 = 1:1 (w/w) NMP:DMSO。

製剤 5 と 7 の間の同様の放出速度は、PLGA MW の違いに関係なく、製剤中のかなり高い薬物負荷 (500 mg/mL CAB) に起因すると考えられ、これが CAB 放出プロファイルを促進します。 両方の配合物において、ＰＬＧＡ対ＣＡＢ比（ｗ／ｗ）は１：３．５ｗ／ｗ（４１．２％ＣＡＢおよび１１．８％ＰＬＧＡ）である。 したがって、配合物５および７におけるＰＬＧＡ ＭＷの違いは、配合物３および６（ＰＬＧＡ対ＣＡＢ比１：０．７５ｗ／ｗ）などの、異なるＰＬＧＡ ＭＷを有する他の配合物と比較して、ＣＡＢ放出にそれほど大きな影響を与えなかった。 ）。

製剤 5 および 7 からの同様の有望な薬物放出プロファイルに基づいて、これらの製剤の in vitro 放出は 180 日に延長されました (補足図 2a)。 製剤7と比較して、約2か月後に製剤5からのCABのより高いin vitro放出が観察されましたが、パイロットマウス研究では、最大90日間、2つの製剤間で血漿中のCAB濃度に差が見られませんでした（補足図2b）。 製剤 7 は、PLGA MW (10 kDa) が低いため、その後の研究のために選択されました。 PLGA MW が低いほど粘度が低くなり (補足表 2)、注射器適性が確保されます。 さらに、10 kDa PLGA (製剤 7) は、27 kDa PLGA (製剤 5) と比較してより速く分解すると予想され、ポリマーの完全な分解を確実にし、その後の投与時のポリマーの蓄積を軽減するために選択されました 24、32、33。

最終的に、500 mg/mL CAB (1:4 w/w PLGA (10 kDa):溶媒) ISFI (製剤 7) (CAB ISFI と呼ばれる) が、その高薬物負荷と高含有量により最適化された製剤として選択されました。インビトロ放出速度を分析し、デポー微細構造の観点からさらに特徴付けました。 薬物放出動態はデポー微細構造の影響を受け、さらにポリマー、溶媒、薬物の物理化学的特性、薬物と溶媒の混和性によって影響を受けることが知られています20,24。 補足図3に示すように、CAB ISFI微細構造は走査型電子顕微鏡（SEM）で定性分析され、CAB結晶が密に詰まったデポーを形成しました。微細構造は、90日間のインキュベーションにわたってISFI微細構造に明らかな細孔形成もなく変化しませんでした。インビトロで培地を放出します。 さらに、CAB ISFI とプラセボ ISFI (CAB フリー) に対して走査型電子顕微鏡エネルギー分散型 X 線 (SEM EDX) 分析を実行し、SEM 画像に見られる CAB 結晶を確認しました (補足図 4)。 SEM EDXの結果は、プラセボISFI内に結晶が存在しないことを実証し、元素分析から結晶がCAB ISFI内のCABで構成されていることを確認しました（フッ素基の存在、補足図4）。 最終的に、これらの結果は、90 日間にわたる CAB の in vitro および in vivo 放出動態を裏付けます。

最適化された CAB ISFI の保存期間を決定するために、2 つの保管条件 (40 °C/75% 相対湿度 (RH) および 4 °C) で 30 日間および 90 日間の安定性研究を実施し、その後保管後の放出を分析しました。試験管内で。 安定性は、ISFI 製剤の物理的外観 (色、粘度、相分離)、および保管後の薬物の安定性と濃度に基づいて決定されました。

4 °C または 40 °C/75% RH で 30 日間、および 4 °C で 90 日間後、CAB ISFI 製剤の物理的外観 (色、シリンジ操作性、相分離) に視覚的な違いは見られませんでした。 薬物濃度は初期濃度（t = 0）と同等であり（差<5％）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって薬物分解ピークは観察されませんでした（補足図5a）。 40℃/75％RHで90日後、製剤はもはや注射可能でも均質でもなくなり（補足図5b）、これにより保存後の放出動態の分析ができなくなりました。

図 2a および b は、4 °C または 40 °C/75% RH で 30 日間、および 4 °C で 90 日間後に得られた in vitro での保存後の放出動態を示しています。 保管条件に関係なく、保管後の CAB 放出はベースライン (t = 0) の製剤と比較して遅く、有意に異なりました (p < 0.05)。 具体的には、40 °C/75% RH および 4 °C で保存した場合の CAB in vitro 放出は、それぞれ 7 日後 (p = 0.0042) および 21 日後 (p = 0.0004) でベースラインと比較して有意に異なりました。 最終的に、すべての製剤は、90 日間の in vitro 放出後にベースラインと比較して有意に異なりました (p < 0.0001) (図 2a)。

a ベースライン (t = 0)、30 日、および 4 での保存後 90 日における CAB ISFI (500 mg/mL CAB (1:4 w/w PLGA (10 kDa):溶媒)) の累積 in vitro 放出動態°C および 40 °C/75% RH。 すべての in vitro 放出研究は、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、2% Solutol を含む pH 7.4) 中で 37 °C で行われました。 データは、n = 3 サンプルの平均 ± 標準偏差として表示されます。 統計分析: 製剤および時点に関して CAB 放出を比較する Tukey の多重比較を使用した二元配置分散分析。 in vitro での保存後 90 日目までに、すべての保存製剤はベースラインと大きく異なり、遅い CAB 放出を引き起こしました (p < 0.0001)。 b からの CAB ISFI 保存後の in vitro 放出動態の要約表。 c ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）分析によって測定されたプラセボ製剤のPLGA重量平均分子量に対する保管条件の影響。 d 4℃および40℃/75％RHで30日および90日後のプラセボ製剤におけるPLGA分解の要約表。 溶媒 = 1:1 w/w NMP:DMSO。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

この放出速度の低下は、安定した保存条件下での PLGA 加水分解の影響を受けた可能性があります。 PLGA 分解物は加水分解中に結晶化する可能性があり 24、その結果、より結晶性の高いポリマーネットワークが形成され、薬物の放出が遅くなる可能性があります。 分解を確認するために、プラセボ ISFI 製剤 (1:4 w/w PLGA (10 kDa): 溶媒) のゲル浸透クロマトグラフィー (GPC) 分析では、4 °C で保存した場合に MW が 2.3% 減少し、分子量が 36.1% 減少したことが実証されました。初期PLGA MW（t = 0）と比較した、40℃/75％RHで90日間保存したときのMW（図2cおよびd）。 さらに、プラセボ製剤の pH を保管の前後で測定しました。 ベースライン時および 4 °C で 90 日間保存した後、プラセボ製剤の pH は中性 (pH = 6 ～ 7) でしたが、40 °C/75 で 90 日間保存した後では、pH はより酸性になりました (pH = 4)。 % RH での分析により、特に 40 °C/75% RH での保管後に、PLGA がその酸副生成物に分解することがさらに確認されました。 全体として、PLGA 分解が最小限 (2.3%) であること、および 90 日後に製剤の注入性と均質性を維持できることからわかるように、CAB ISFI は 4 °C での保存でより安定でした。

CAB ISFI の in vivo 安全性研究は、メスの BALB/c マウスを用いて実施され、治療や注射を受けなかった対照マウスと比較して、注射後の局所的および全身的な炎症を評価しました。 研究の結果は、CAB ISFIの忍容性が良好であり、マウスには明らかな毒性、行動の変化、または体重減少の兆候が見られないことを示しました（補足図6）。 切除されたインプラントと周囲の皮下組織の組織病理学的分析により、CAB ISFIはデポー周囲の浸潤免疫細胞によって示される軽度から中程度の局所炎症を示したことが実証されました（図3a）。 3日目と7日目の皮膚顕微鏡炎症スコアの中央値は3（中等度の炎症）で、おそらく注射に対する初期免疫反応によるもので、試験した3匹のマウスのうち2匹で30日目までに減少しました（図3b）。

a 注射後 3、7、および 30 日目に切除されたデポーおよび周囲の皮下組織の局所炎症を収集し (CAB ISFI 処置マウスの場合は n = 3/時点、対照 (注射なし) マウスの場合は n = 1/時点)、彼。 アスタリスクは CAB インプラントを示します。 矢印は浸潤した免疫細胞と炎症領域を示します。 すべてのスケール バーは 1 mm を表します。 b デポ周囲の皮下組織の炎症スコアは、光学顕微鏡を使用して評価され、認定された病理学者によって盲検的に採点されました。 黒色のバーは、各時点での炎症スコアの中央値を表します (時点ごとに n = 3)。 炎症スコア: 0: 炎症細胞は予想される範囲内に存在します。 1: 炎症は最小限で、免疫細胞の増加はほとんどなく、点在する免疫細胞も存在します。 2: 軽度の炎症、免疫細胞の小さなクラスターから炎症の薄いまたは局所的な痕跡、または貯蔵所を取り囲む拡散性の細胞数の軽度の増加。 ３、中等度の、より厚い、または複数の炎症跡、またはデポーをびまん的に取り囲む中程度の数の細胞。 ４、正常な組織構造、または貯蔵所をびまん性に取り囲む大量の細胞を置き換えるのに十分な大きさの重度の合体した炎症の痕跡。 5、正常な組織構造の拡張領域に取って代わる、顕著な炎症が存在します。 c 注射後3日目（n = 3）、7日目（n = 3）、および30日目（n = 5）にELISAによって定量された血漿中のTNF-α濃度（pg/mL）。 d 注射後3日目（n = 3）、7日目（n = 3）、および30日目（n = 5）にELISAによって定量された血漿中のIL-6の濃度（pg/mL）。 e 90日間の血漿中のCAB濃度（平均±標準偏差）（1215 mg/kg）（時点ごとにn = 6）。 CAB の 1x および 4x PA-IC90 値は点線で示されています (それぞれ 166 ng/mL および 664 ng/mL)。 個々のマウスの血漿サンプルを補足図 7 に示します。ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

全身性炎症は、血漿中の TNF-α および IL-6 炎症促進性サイトカインを定量する酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA) によって評価されました。 結果は、全身性の急性または慢性炎症を示さなかった。 TNF-αは0～20 pg/mLの範囲であり、注射なしの対照群と同等でした（p = 0.5521）（図3c）。 血漿中のIL-6レベルは0〜45 pg/mLの範囲であり（図3d）、レベルは注射なしの対照群で見られるものと同等でした[p = 0.4188（多重比較による二元配置分散分析）]。 炎症スコアまたは炎症誘発性サイトカインレベルのばらつきは、個体間のばらつき、またはマウスのホルモン周期のばらつきに起因すると考えられます 34。 全体として、これらの結果は、CAB ISFI は一般に忍容性が高く、明らかな毒性や慢性炎症の兆候がなく安全であると考えられることを実証しました。

CAB ISFI の in vivo 薬物放出動態を評価するために、雌 BALB/c マウスで薬物動態 (PK) 研究を 90 日間実施しました。 CAB血漿濃度は、高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析LC/MS-MS法を使用して定量され、90日間にわたってプロットされました（図3e）。 さらに、3 つの数学モデル (0 次、1 次、拡散制御 35) に対して CAB 放出動態を評価しました。 我々は、マウスで観察された in vivo での CAB 放出が、90 日間の PK 研究期間にわたって 0 次モデル (0 次モデル R2 = 0.97; 1 次モデル R2 = 0.87; 拡散制御モデル R2 = 0.86) に最もよく適合すると判断しました。 さらに、血漿中の平均CAB濃度は、90日間の研究全体を通じて、すべてのマウス間で4×PA-IC90（664ng/mL16）よりも6〜53倍高かった（図3eおよび補足図7）。

BALB/c マウスにおける有望な安全性と PK データに基づいて、アカゲザルにおける安全性、PK、有効性を評価するために CAB ISFI 製剤が選択されました。 ただし、マカクザルの注射量（1 mL 注射 2 回）はマウスの場合（50 μL）よりもはるかに多いため、マカクザルの研究にスケールアップする前に、in vitro で大量の製剤の注射可能性を確保することが不可欠でした。 最適化された CAB ISFI 製剤の注射可能性を評価するために、ポリアクリルアミド ハイドロゲルを利用しました 36。 ポリアクリルアミドヒドロゲルは、注射部位における生体内皮下組織の機械的特性を模倣し、PBS 槽への直接注射による標準的な生体外放出方法よりも、ISFI の生体内放出とのより良い相関関係を引き出すことが示されています 36,37。 CAB ISFI 製剤では、注入時の転相が速いため、注入性の評価が不可欠でした。これは、有機溶媒の水との高い混和性と PLGA MW24 の低さに起因すると考えられます。 転相が速すぎると、製剤がシリンジと針の間で固化し、注入の流れが妨げられる可能性があります。

そのため、ポリマーと溶媒の比率とPLGA MWが異なるいくつかのプラセボ製剤、および最適化されたCAB ISFI製剤（1:4 w/w PLGA（10 kDa）：溶媒）の注射可能性を調査しました。 ポリアクリルアミドヒドロゲルへの製剤の注入可能性は、1 mL の注入量で 16 ゲージ (G)、18 G、および 19 G の針を使用して調査されました (補足表 3)。 補足表 3 に示すように、1:4 w/w PLGA (10 kDa):溶媒プラセボまたは CAB ISFI 製剤の 19 G 針によるヒドロゲル マトリックスへの 1 mL の注射は、相反転が速く、時間が経つため成功しませんでした。デポーの形成により、針を通る製剤の流れが妨げられます。 これは、低分子量の PLGA (10 kDa) と大量の溶媒 (1:4 w/w PLGA:溶媒) の組み合わせに起因すると考えられます。 一方、より高い PLGA MW (27 kDa) またはより低い量の溶媒 (1:3 および 1:2 w/w PLGA:溶媒) で調製した 1 mL のプラセボ ISFIs をヒドロゲル マトリックスに注入することに成功しました。 さらに、最適化された CAB ISFI (500 mg/mL 1:4 PLGA (10 kDa): 溶媒) のヒドロゲル マトリックスへの 1 mL の注入は、18 G または 16 G 針を使用して成功裏に達成されました。 これらの結果に基づいて、マカクザルの研究において CAB ISFI 製剤を簡単に投与するために 16 G 針が使用されました。

CAB ISFIを6頭のメスのアカゲザルに投与しました。 １匹のマカクザル（ＲＨ－１０８０）を除き、すべての動物に１ｍＬの注射を２回別々に受けた（合計１０００ｍｇのＣＡＢ）。１匹のマカクザル（ＲＨ－１０８０）にはＩＳＦＩの１．０ｍＬおよび０．５ｍｌの注射、または合計７５０ｍｇのＣＡＢが投与された。 体重あたりに基づいて、動物には 72.8 ～ 143.9 mg/kg の CAB が投与されました (中央値 = 113.8 mg/kg)。 マカク属 RH-42012 は、別の研究で SHIV に感染しているがそれ以外は健康な動物であり、PK 目的のみに含まれていました。 図 4a は、血漿中の CAB の縦方向の濃度を示しています。 全体として、すべてのマカクザルは、24週目にベンチマーク濃度(1230ng/ml)に達したRH-1073を除き、4週目までに4×PA-IC90を超える血漿CAB濃度を達成した。 4週目、8週目、および12週目におけるCABの血漿中濃度中央値（範囲）は、それぞれ982 [406-1977]、1950 [578-5627]、および2127 [522-2552] ng/mL、または約1.5～3.2-であった。 4× PA-IC90 の上に折ります。 マカクザル RH-1097 および RH-1093 の 2 つの CAB ISFI を 12 週目に除去すると、除去後 72 時間で血漿 CAB レベルがそれぞれ 7 倍と 48 分の 1 に減少し、2 週間後には約 10 ～ 100 分の 1 に減少しました。 (図4a)。 同様に、マカク RH-42012 で触知可能な 2 つの ISFI のうち 1 つを 14 週目に除去すると、1 週間以内に血漿 CAB が約 2 倍減少しました (1550 ～ 765 ng/mL)。 CAB 濃度はさらに 3 週間にわたって 4× PA-IC90 を超えたままでした。 無傷の CAB ISFI を持つ残りの 3 匹の動物では、16、20、24、および 28 週目の血漿 CAB 濃度中央値は、1923 [534-2082]、2,227 [646-2827]、1230 [971-1585]、および 886 [それぞれ473〜1415] ng/mL、または4× PA-IC90の1.3〜3.4倍を上回ります（図4b）。 注目すべきことに、1匹の動物(RH-1048)における血漿CABレベルは、47週目で4×PA-IC90(838ng/mL)を超えたままであった。 全体として、これらの結果は、最適化された CAB ISFI 製剤の 1 mL 注射を 2 回行うと、最長 6 ～ 11 か月間、防御閾値を超えるレベルでマカクザルに CAB を放出できることを示しています。

血漿中のCAB濃度の長期的評価。 2つのCAB ISFIは12週目にマカクザルRH-1097および1093から除去され(青および紫の実線丸)、2つのCAB ISFIのうちの1つは14週目にマカクザルRH-42012から除去された(緑の実線丸)。 点線は除去後の CAB レベルを示します。 b アスタリスク (*) は、12 ～ 14 週目に ISFI が除去された動物を示します。 インプラント除去後のデータは中央値の計算には含まれません。 c CAB ISFIを有する3匹のマカクザル（RH-42012、RA-1048、およびRA1080）の血漿、直腸組織、および膣組織で検出されたCABレベル。 サンプルは、移植後の 3 つの異なる時点 (4 週目、8 週目、および 12 週目) で同じ動物から収集されました。 黒いバーは中央値を表します。 d 血漿に対する膣組織 (VT) および直腸組織 (RT) の CAB 濃度の比。

CAB 濃度は、4 週目、8 週目、および 12 週目に 3 頭のマカクザル (RH-42012、RA-1048、および RA-1080) の膣および直腸組織でも測定されました。図 4c は、CAB が両方の組織で一貫して検出されたことを示しています。唯一の例外は、4週目に膣組織にCABが検出されなかったマカクザルRH-1048です。直腸組織中のCAB濃度中央値は、4週目と8週目の間で約3倍に増加し(それぞれ333～1004ng/g)、週ごとにわずかに減少しました。 12 (713 ng/g)。 膣組織中の CAB 濃度の中央値も、4 週目から 8 週目に約 2.8 倍に増加し（それぞれ 293 ～ 849 ng/g）、12 週目では 823 ng/g に留まりました。組織と血漿の比率（図 4d）は、経時的に安定したままでした。膣[中央値 = 0.18 (0.15-0.32)]と直腸区画[中央値 = 0.42 (0.23-0.43)]でも同様でした。

ISFI から送達された CAB が直腸保護を与えることができるかどうかを調査するために、移植後のさまざまな時点で一連の SHIV 攻撃実験を実行しました。 まず、4週目から8週目まで週に2回チャレンジした2匹のマカクザル（RH-1093およびRH-1097）の短期防御を評価しました（1匹あたり合計8回のチャレンジ）（図5a）。 1 回の SHIV 曝露後に感染した未処理のリアルタイム対照 (RH-1092) とは対照的に、両方の動物は SHIV 感染から保護されました。 長期防御は、14週から18週の間にSHIVに週に2回曝露した2頭の追加のマカク（RH-1048およびRH-1080）で評価されました（1匹あたり8回の攻撃）（図5b）。 血漿 CAB レベルを PA-IC90 の 4 倍以上に維持した 1 匹の動物 (RH-1048) は、25 週から 28 週の間にさらに 6 回の SHIV チャレンジを受けました。 CAB 処置された 2 匹の動物は感染から保護されましたが、未処置のリアルタイム対照 (RH-1084) は感染から保護されました。 1回のSHIV曝露後に感染した（図5b）。 全体として、27 週間にわたる累積 38 回の直腸 SHIV 曝露中、1 回の ISFI 治療で 4 頭のマカクザルが完全に保護されました。

a CAB ISFI による短期保護。 CAB処理した2匹のマカクザル（RH-1093およびRH-1097）と未処理のマカクザル1匹（RH-1092）を、移植後4週間から8週間の間に直腸からSHIVに曝露した。 各動物は、週に 2 回、最大 4 週間にわたって直腸 SHIV 攻撃を受けました (合計 8​​ 回の曝露)。 矢印は SHIV 曝露を示します。 ＩＳＦＩは１２週目に外科的に除去された（青および紫の実線丸）ｂ チャレンジ期間および３２週間の追跡期間中の動物におけるリアルタイムＰＣＲによって検出された血漿ＳＨＩＶ ＲＮＡレベル。 c CAB ISFI による長期保護。 CAB治療を受けた2頭のマカクザル（RH-1080およびRH-1048）と未治療のマカクザル1頭（RH-1084）は、移植後14週から18週の間、週に2回、直腸SHIV攻撃を受けた（最大8回の曝露）。 動物 RH-1048 は、25 週から 28 週の間にさらに 6 回の SHIV 攻撃を受けました (合計 14 回の曝露)。 矢印は SHIV 曝露を示します。 d チャレンジ期間および24～36週間の追跡期間中の動物におけるリアルタイムPCRによって検出された血漿SHIV RNAレベル。

安全性と忍容性を評価するために、最長 12 週間、またはインプラントが除去されるまで毎週、インプラントの周囲の領域を検査しました。 この評価には、12 の移植部位と合計 144 の臨床観察の累積分析のために 2 回の注射を受けた 6 頭のマカクザルが含まれていました。 Draize スケールに基づくと、すべての移植部位は目立たず、12 週間の研究期間中に局所的な皮膚反応の兆候は示されませんでした (図 6a および補足図 8)。 半定量的な組織病理学的評価は、インプラント除去中（移植後 12 ～ 14 週間）に 3 頭のマカクザルから移植部位で採取された 3 mm 外科パンチ皮膚生検で行われました。 比較のために、CAB ISFI 注射を受けなかった動物から 3 mm の外科的パンチ生検を収集しました。 皮膚生検では、対照を含む動物間にリンパ形質細胞浸潤がまったく存在しないか、最小限しか存在せず、どの組織切片にも感染または異物（残留インプラント）の証拠が存在しませんでした（図6bおよび補足表4）。

ISFI治療を受けた6頭の動物のインプラント部位における局所皮膚反応のヒートマップ。 局所的な皮膚反応は、Draize スケール (0-なしから 4-重篤) を使用してスコア化されました。 b 皮膚の組織病理学。 動物あたり 1 つの皮膚生検を、治療動物 RH-1093、RH-1097、RH-42012 (n = 3) および未治療対照 (n = 1) から移植時に採取しました。 すべてのスケール バーは 1 mm を表します (H&E、元の倍率 × 4)。

in vivo 研究後のインプラントの回収可能性を評価するために、安楽死時に小さな皮膚切開を行うことにより、投与後 30 日 (n = 6)、60 日 (n = 6)、および 90 日 (n = 6) 日にマウスから CAB ISFI を除去しました。 ISFI はすべての動物から首尾よく除去され、貯蔵所の周囲に線維化組織はありませんでした (図 7a)。 30 日目 (n = 6)、60 日目 (n = 6)、および 90 日目 (n = 6) に除去されたデポをさらに処理して、ポリマーの分解 (n = 3/時点) および残留 CAB 濃度 (n = 3/時点) を評価しました。 。 マウスでの90日後、これらの分析の結果は、デポー質量の59.5±13.4％の減少（図7b）および49.7±5.4％のPLGA分子量の減少（図7c）を示した。 重要なことに、90日目にマウスから回収したインプラントには61.6±6.5％のCABが残存しており、これはISFIからのCAB放出が90日を超えて持続できることを示している（図7d）。

a 注射後 30 日、60 日、および 90 日後に BALB/c マウスから取得した CAB ISFI の画像。 b マウスにおける注射後 30、60、および 90 日の CAB ISFI 質量（平均 ± 標準偏差; n = 6/時点）を、50 μL 注射量（60.75 mg）からの初期 ISFI 質量（0 日目）と比較した。 0 日目の質量は、50 μL の注入量に基づいて計算され、製剤の密度 (1.215 g/mL) を使用して注入時のおおよその質量が決定されました。 c 初期用量（50μL注射中25mg）と比較した、マウスへの注射後30日、60日、および90日後のISFIの残留CABの定量化（n = 3サンプルの平均±標準偏差）。 d ニートPLGA（10 kDa）と比較した、マウスへの注射後30、60、および90日のCAB ISFIにおけるPLGA分子量の減少（n = 3サンプルの平均±標準偏差）。 e 注射後 84 日および 98 日後に 3 頭のアカゲザルから採取したインプラント (背中上部の左右の位置に注射) の残留薬剤の定量化。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

さらに、注射後 84 日目に 2 頭のマカクザル (RH-1097 および RH-1093) から両方の CAB ISFI が除去され、98 日目に 3 頭目のマカクザル (RH-42012) から 1 つの ISFI が除去されました。 図７ｅに示すように、デポー除去後、インプラント当たり平均４８．３２±１１．４４％のＣＡＢが残存した。

個々の CAB クリアランス率は、1.5 ～ 2 mL の皮下 CAB ISFI を投与した 6 匹のマカクザルの血管外 PK プロファイルに基づいて推定されました (補足図 9) [中央値 (IQR) = 15.9 (9.1 ～ 25.2) mL/(h*kg) ］および PK サンプリングの 7 日前および 1 日前に 50 mg/kg の筋肉内 CAB LA を投与された 9 頭の歴史的参照マカク [中央値 (IQR) = 12.4 (11.7-14.3) ml/(h*kg)]38。 これら 2 つの長時間作用型製剤の投入率は、観察された血漿濃度に、ISFI 治療を受けた 6 匹のマカクの投与時の体重、または歴史的参照マカクの推定体重 8 kg で補正されたそれぞれの動物の推定クリアランス率を乗じることによって導出されました (図 8)。 ）。 効果的な臨床用量の目標投入速度は、公開されている CAB 集団 PK モデル (CL = 151 mL/h、V2 = 5270 mL、Q = 507 mL/h、および V3 = 2430 mL)39 の平均パラメータを使用して推定され、ヒト血漿をシミュレートしました。さまざまな IV 注入速度での濃度。 3 mg/日および 0.75 mg/日の投入量では、それぞれ 4× PA-IC90 および 1× PA-IC90 を超える血漿濃度が達成されました。 私たちのマカクザル研究で観察された CAB ISFI 入力率の中央値は、投与後 28 日目から 140 日目までにこの 3 mg/日の臨床有効性閾値を超えました。 注入量が注入量に比例して増加すると仮定すると、3 mL CAB ISFI 注入は、投与後 21 日目から 168 日目まで、つまり投与後 5.6 か月までにこの閾値に達することになります。 6日間隔で2回の50 mg/kg CAB LA筋肉内注射を投与されたマカクザルと比較して、CAB ISFIは中央値の97日間余分に予測防御閾値を上回る割合を維持した(図8b)。

CAB ISFI入力率は、観察された血漿濃度に、血管外PKプロファイルによって決定されるそれぞれの動物のクリアランスを乗算することによって推定されます。 破線および点線の基準線は、それぞれ 4× PA-IC90 および PA-IC90 を超えるヒト血漿濃度に達すると予測される 3 mg/日および 0.75 mg/日の投入量を示します。 b この研究で観察された a の CAB ISFI 入力速度の中央値 (±IQR) (緑の線) は、3 mL の注入量で予測された中央値 (入力速度が容量に比例して増加すると仮定、紫の線) と n について推定された速度に重ねられています。 = PK サンプリングの 7 日前および 1 日前に 50 mpk (mg/kg) の筋肉内 CAB LA を投与された 9 頭の参照マカク 38。

我々は、少量の注射量で投与間隔を延長し、直腸 SHIV 感染に対する耐久性のある保護を提供し、製品の回収を可能にする超長時間作用型 CAB ISFI について報告します。 私たちは、マカクザルにおいて確立された PrEP 防御ベンチマークを上回る CAB 放出が最大 6 ～ 11 か月間続くことを実証し、これらのデータを臨床曝露の推定に使用しました。 当社の製剤を 2 mL または 3 mL 注射すると、ヒトの血漿濃度がそれぞれ 4 か月または 5 か月にわたって 4 × PA-IC90 以上に維持されることがわかりました。

CAB ISFI は注射可能な状態を保ち、薬物分解を示さず、40 °C/75% RH で最大 30 日間、4 °C で最大 90 日間保存した場合でも均一な CAB 濃度を維持し、製剤の安定性を実証しました。 保存後の in vitro 放出研究では、両方の保存条件で CAB 放出が遅くなりましたが、ベースラインと 4 °C で保存した 90 日後の CAB 累積放出の差はわずか 3% 程度でした。 また、インプラント固化の可能性を引き起こす ISFI の高速転相特性が、大量 (1 mL 以上) の注入量の投与に伴う制限となる可能性があるかどうかを理解するために、ポリアクリルアミド ハイドロゲルでの ISFI 注入可能性の研究も実施しました。 1 mL 以上の注入量には 18 G または 16 G の針ゲージを使用できることを実証しました。 BALB/c マウスでは、血漿 CAB 濃度は 90 日間で 4× PA-IC90 よりも最大 53 倍高かった。 アカゲザルでは、CAB ISFIS は 4× PA-IC90 以上の血漿 CAB 濃度を 6 ～ 11 か月間維持しました。これは、これまでに報告され、より短期間で血漿 CAB レベルが保護基準を超えることが実証された長時間作用型 CAB 製剤とは異なります 40,41,42。 43. メスの BALB/c マウスとメスのアカゲザルを対象とした in vivo 安全性研究では、CAB ISFI は十分に忍容性があり、局所的または全身的な炎症は顕著なレベルではないことが示されました。 さらに、マウスとマカクでは注射後90日まで触知可能なインプラントが依然として回収可能であり、有害事象の場合に容易に除去できる能力を実証しており、これにより、場合のように経口PrEPで長い薬理学的尾部を覆う必要がなくなる可能性がある。現在の CAB LA 処方を使用します。 また、注射後 84 ～ 90 日で回収した後、マウスでは CAB の約 60% がインプラントに残っており、マカクザルでは各インプラントに 30 ～ 60% の CAB が残っていることにも注目し、CAB ISFI がより長期間放出される可能性があることを実証しました。時間の。

アカゲザルでは、50 mg/kg の CAB LA 注射により、確立された PrEP 保護ベンチマークを超える血漿 CAB 濃度が約 6 週間提供されます 44。 ここでは、kg あたり 1.5 ～ 2.9 倍の CAB しか含まない 1 mL CAB ISFFI を 2 回注射すると、このベンチマークを超える血漿 CAB レベルを 6 ～ 11 か月間維持できることを示します。 直腸および膣組織においても、CAB 濃度は CAB LA で治療したマカクザルで見られる濃度の範囲内であり、臨床用量 600 mg の CAB LA を投与したヒトで達成される濃度よりも約 2 ～ 4 倍高かったが、潜在的な限界は次のとおりである。私たちの分析には移植後の最初の 12 週間のみが含まれていたことがわかりました 44,45。 さらに、超長時間作用型 CAB ISFI には、前臨床開発中の他の長時間作用型 CAB 製剤に比べて顕著な利点があります。 カルナカランら。 は、長期作用型親水性ポリ（エーテル-ウレタン）放射線不透過性 CAB インプラントについて報告しました。このインプラントは、マカクザルにおいて 12 週間にわたって 1× PA-IC90 以上の血漿レベルを達成しましたが、移植後約 2 週間後には 4× PA-IC90 を下回りました。サル 1 匹につき 6 本のインプラント41。 各インプラントには約 274 mg の CAB が含まれており、生体内で 1 日あたり平均 348 μg の CAB が放出されました41。 周ら。 およびクルカルニら。 は、マカクザルにおいて 1 年間にわたる CAB の長時間作用型放出 (CAB 相当量 45 mg/kg、筋肉内注射量約 2 mL) を実証した注射可能なナノ製剤 CAB プロドラッグについて報告しましたが、CAB 血漿中濃度は 4× PA-IC90 を下回り、それぞれ、約 60 日 42 および 200 日 43 後の PA-IC90。 私たちの研究で記載された注射可能な生分解性CAB ISFIは、マカクザルにおいて6〜11か月間、4×PA-IC90を超える血漿CABレベルを実証し、わずか2回の1 mL皮下注射で複数の直腸SHIV攻撃に対して100％の防御を示しました。

数か月にわたってマカクザルにおいて100%の防御を示した我々の結果は、我々の知る限りでは、単回のCAB投与で観察されたPrEP活性の記録としては最長記録であることも表している。 血漿 CAB レベルが 4 × PA-IC90 を超える期間に SHIV 攻撃を限定しました。これは、この濃度がマカクザルとヒトにおける十分に確立された PrEP 保護ベンチマークを表すためです。 したがって、累積 38 回の直腸 SHIV 曝露にもかかわらず観察された完全な保護は、完全に予想外ではありませんでした。 1× PA-IC90 を超えるレベルもマカクザルにおける直腸 SHIV 感染に対する有意な (>95%) 防御と関連しているため、CAB ISFIS からの PrEP 活性の持続期間をさらに定義することが重要である 40,46。 この分析はまた、CAB ISFI の用量または注射量の潜在的な減少、およびヒトにおける 3 mL 注射で予測される 5.6 か月を超えて予防期間が延長される可能性についても情報を提供する可能性があります。 しかし、CAB LAを受けて目標レベルを維持したヒトにおける稀な画期的な感染症の記録は、CABの投与量を下げることに反対する可能性があります47,48。

3 か月後のインプラント除去後のマカクザルの血漿 CAB 濃度の分析からも、ISFI の回復可能性に関する重要な情報が得られました。 2 頭のマカクザルでは、2 つのインプラントを除去すると 2 週間以内に血漿 CAB レベルが 10 ～ 100 分の 1 に急速に低下しましたが、そのうちの 1 頭では CAB が持続的に検出されたことから明らかなように、インプラント物質の残留が明らかでした。血漿中の PA-IC90 を超えるレベル。 別のマカクザルでは、2 つのインプラントのうち 1 つを除去すると、1 週間以内に血漿 CAB レベルが急速に 2 分の 1 に減少しました。 すべての場合において、CAB 用量の約半分が回収された ISFI に残存しており、これは CAB ISFI がより長期間放出される可能性があることを示唆しています。 除去可能範囲を定義し、ISFI による CAB が枯渇するまでの時間を理解するには、今後の研究が必要です。 提案された CAB ISFI は HIV PrEP に対して有望な可能性を示していますが、この処方にはいくつかの制限があります。 たとえば、マウスの安全性研究では毒性や有害事象の兆候は観察されませんでしたが、研究のサンプルサイズが小さいため (n = 3)、結果は限られています。 したがって、将来の研究には、より大きなサンプルサイズを使用してマウスで包括的な安全性研究を実施し、最大180日間の長期安全性を評価することが含まれる予定です。 もう1つの制限は、注射後最初の2週間でマカクザルのCAB濃度が初期低下し、レベルが4×PA-IC90を下回るとPrEP活性が失われる可能性があることです。 この低放出期間がヒトで確認された場合、初回の CAB ISFI 注射後 2 mL 注射では 28 日間、または 3 mL 注射では 21 日間、代替の HIV 予防手段を推奨することになります。 現在の CDC PrEP ガイドラインでは、潜在的な感染経路に応じて、毎日の経口 PrEP の開始後 7 ～ 20 日間、別の HIV 予防法を推奨しています 49。 もう 1 つの潜在的な制限は、配合物に有機溶媒が含まれており、大量に使用すると毒性を引き起こす可能性があることです。 NMP を静脈内投与した場合のマウスの致死量中央値 (LD50) と無影響レベル (NOEL) は、それぞれ 3600 mg/kg と 257 mg/kg です50。 あるいは、DMSO の LD50 と NOEL は、血流中に投与された場合、非ヒト霊長類ではそれぞれ 4000 mg/kg と 3300 mg/kg であり、マウスの LD50 は 14,000 mg/kg です 51。 私たちの研究では、溶媒あたり約 300 mg/mL をマウス (溶媒あたり 700 mg/kg) およびマカクザル (溶媒あたり 71 mg/kg) に投与しましたが、慢性または明白な毒性の兆候は示されませんでした。 ISFI はマカクザルにおける DMSO および NMP の LD50 および NOEL 制限を大幅に下回っていますが、将来の研究には、潜在的な毒性の懸念を軽減するために溶媒の量を減らす取り組みが含まれる必要があります。

これらの制限に対処し、この研究をさらに進めるための追加研究には、(1) CAB ISFI のバースト放出、投与量を増やす、または経口導入用量を実施して、投与期間中に血漿中濃度が 4× PA-IC90 以上に留まるようにすることが含まれます。注射後最初の 1 か月 (2) CAB 放出の完了と完全なポリマー分解までの時間を決定し、完全な PK プロファイルを in vivo で評価します。(3) 硫酸バリウムを組み込んで X 線モニタリング用の放射線不透過性インプラントを生成し、次の場合に回収可能性を高めます。必要に応じてインプラントの移動を調査します。 さらに、我々は、単一の ISFI に複数の ARV をロードして、マウスで超長時間作用型放出動態を達成できることを実証しました 20。 したがって、将来のさらなる研究には、HIV 治療用途のために現在提案されている CAB ISFI 製剤への別の ARV の追加が含まれる可能性があります。

総合すると、これらの結果は、PrEP を送達し、ヒトへの臨床進歩をサポートするための超長時間作用型プラットフォームとしての CAB ISFIS の有望性を強調しています。 観察された前臨床安全性と CAB LA に対する広範な薬物動態学的生物学的同等性は非常に有望であり、臨床的に実証されれば、おそらく有効性試験を必要とせずに規制当局の承認への迅速な経路がもたらされる可能性があります。 CAB ISFI は、臨床現場に進められた場合、アドヒアランスが高く、非常に望ましいものになると予想されます。 研究によると、長時間作用型注射剤は、投与頻度が低く、馴染みがあり、容易であるため、他の潜在的な剤形（毎日の経口錠剤や膣リングなど）と比較して、HIV 感染率が最も高い地域でユーザーの受け入れやすさと遵守率が最大になることが示されています5,10。使用法と裁量権。 さらに、提案された製剤は皮下注射されるため自己投与可能であり、ユーザーの受け入れやすさとアクセスのしやすさをさらに高める可能性があります。 全体として、超長時間作用型 CAB ISFI は臨床現場で年に 2 ～ 3 回投与できる可能性があり、HIV 情勢を前進させ、世界中で予防の選択肢を広げることができます。

50:50 ポリ(DL-ラクチド-コ-グリコリド、PLGA) は、LACTEL (バーミンガム、アラバマ州; カタログ番号 B6010-1P、ロット番号 A17 ～ 142、分子量 27.2 kDa、固有粘度 0.26 ～ 0.54 Dl/) から購入しました。 g; カタログ番号 B6017-1G、ロット番号 A15-108、分子量 10 kDa、固有粘度 0.15 ～ 0.25 Dl/g)。 N-メチル-2-ピロリドン (NMP、USP) は、ASHLAND (デラウェア州ウィルミントン、製品コード 851263、100% NMP) から入手しました。 ジメチルスルホキシド (DMSO、99.7% 以上) は、Fisher Scientific (マサチューセッツ州ウォルサム) から購入しました。 Solutol-HS 15、リン酸緩衝食塩水 (0.01 M PBS、pH 7.4)、HPLC グレードのアセトニトリル (ACN)、および水は、Sigma Aldrich (ミズーリ州セントルイス) から購入しました。 Gelucire 44/14 (カタログ番号 1356950) は、Sigma Aldrich (セントルイス、ミズーリ州) から購入しました。 Tween 20 は、Fisher Scientific (ニュージャージー州ハンプトン、カタログ番号 BP337-100) から購入しました。 テトラヒドロフラン (THF) は、Sigma Aldrich (ミズーリ州セントルイス、カタログ番号 SHBF9530V) から購入しました。 98.5% アクリルアミド (AM) と過硫酸アンモニウム (APS) は Acros Organics (カリフォルニア州カールスバッド、AM カタログ番号 16435000、APS カタログ番号 40116-1000) によって購入され、2% ビスアクリルアミド溶液と N、N 、Ｎ'，Ｎ'－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ニュージャージー州ハンプトン；ビスアクリルアミドカタログ番号ＢＰ１５０－２０、ＴＥＭＥＤカタログ番号ＢＰ１４０４－２５０）から購入した。 高純度 (99% 以上) CAB は Selleckchem (テキサス州ヒューストン、カタログ番号 S7766) から購入し、滅菌濾過済み DMSO (99.7% 以上) は Sigma-Aldrich (ミズーリ州セントルイス、ロット番号 RNBH5297) から購入しました。

逆相 HPLC 分析は、ダイオード アレイ検出器とオートサンプラー付き LC ポンプを備えた Agilent 1260 HPLC システム (Agilent Technologies、米国カリフォルニア州サンタクララ) で実行しました。 CAB 分析に使用した固定相は、40 °C に維持された Inertsil ODS-3 カラム (5 μm、4.6 × 150 mm 100 Å、[GL Sciences, Torrance, CA]) でした。 クロマトグラフィーによる分離は、水中の 0.1% トリフルオロ酢酸および ACN (H2O/ACN 95:5 v/v) からなる移動相を使用した勾配溶出によって達成されました。 流量は 1.0 mL/分で、合計実行時間は 25 mL の注入ごとに 25 分でした。 CAB は 254 nm の波長で分析され、保持時間は 11.4 分でした。 アッセイの校正範囲は 0.48 ～ 250 μg/mL でした。 HPLC データ収集には、Agilent OpenLab ソフトウェア (バージョン C.01.08) を使用しました。

NMP、DMSO、NMP:DMSO のさまざまな重量比 (w/w) (1:1、9:1、および 2:8 w/w)、9:1 NMP:Gelucire 44/14 中の CAB の飽和濃度 ( w/w)、9:1 w/w (NMP:DMSO):Tween 20 (補足表 1) を使用して、CAB 負荷を最大にするための ISFI システム内の最適な溶媒を決定します。 CAB 飽和溶解度も、in vitro 放出研究中のシンク条件 (最大溶解度 52 の 1/5 以下) を確保するために、放出媒体 (2% ソルトールを含む PBS) 中で測定されました (補足表 1)。 放出媒体にソルトールを添加すると、放出媒体中の疎水性薬物の溶解度が増加し、in vitro 放出研究全体を通じてシンク条件が確実に維持されることが示されています 20。 CAB の飽和溶解度は、PBS 単独と比較して、PBS に 2% Solutol を添加すると 4.3 倍増加しました。

補足表 1 に示す以下の溶媒における CAB の飽和溶解度を決定するために、100 mg の CAB を個々のバイアルに秤量し、それぞれの溶媒 100 mg を加えました。 混合物を37℃で24時間撹拌した。 サンプルを 16,000 × g (Eppendorf Centrifuge 5415R、米国) で 30 分間遠心分離して、過剰な未溶解薬物を除去しました。 サンプルのアリコート (n = 3) を飽和上清から収集し、ACN20 で希釈しました。 飽和アリコート中の薬物濃度をHPLC分析によって決定した。

50:50 ポリ(DL-ラクチド-コ-グリコリド) (PLGA) (分子量 27 kDa または 10 kDa) を、重量比 1:1 (w/w) NMP:DMSO と 1:2 または 1:4 で混合しました。 7 mL シンチレーションバイアルに w/w を入れ、室温で混合して溶解し、均一なプラセボ製剤を作成します。 続いて、カボテグラビル (CAB; 100 ～ 400 mg/g) をそれぞれのポリマー/溶媒溶液に添加し、薬物を可溶化し、標的薬物負荷で安定した ISFI 溶液または懸濁液を生成させました。 プラセボ製剤への薬物の完全な溶解と薬物溶液または懸濁液の均一性を確保するために、サンプルのアリコート (1 ～ 2 mg、n = 4) を薬物製剤から収集し、ACN に溶解しました。 薬物濃度はHPLC分析により定量した。

インビボ研究では、ISFI 製剤をバイオセーフティキャビネット内の無菌条件下で調製しました。 すべての溶媒および ISFI プラセボ製剤は濾過滅菌されました (Sterile Purdisc 13 mm ナイロン シリンジ フィルター、0.2 μm、カタログ番号 6786-1302)。 続いて、CAB を滅菌濾過したポリマー/溶媒溶液に添加し、可溶化して、目標薬物負荷で安定した ISFI 溶液または懸濁液を生成しました。 薬物の完全な溶解と均一性を確保するために、サンプルのアリコート (1 ～ 2 mg、n = 3) を薬物製剤から収集し、ACN に溶解し、HPLC 分析によって薬物濃度を定量しました。

インプラントの微細構造は、前述のように走査型電子顕微鏡 (SEM) によって評価されました 20,30。 簡単に説明すると、インビトロ ISFI の微細構造を評価するために、30 ± 3 mg の ISFI 溶液または懸濁液を 2% ソルトールを含む 200 mL の 0.01 M PBS、pH 7.4 に 37 °C で注入しました。 所定の時点（インキュベーション後 3、30、および 90 日）で、インプラントをバス溶液から取り出し、急速冷凍し、48 時間凍結乾燥しました（FreeZone ベンチトップ凍結乾燥機、Labconco、ミズーリ州カンザスシティ） 。 不完全な相反転および溶媒交換によって引き起こされる可能性が高いインプラントの歪みのため、3 日目以前の SEM イメージング用の ISFI のサンプル調製は不可能でした 20,27,53。 凍結乾燥後、画像化のために断面を露出させるために、すべてのデポを半分に切断しました。 続いて、凍結乾燥サンプルをカーボンテープを使用してアルミニウムスタブに取り付け、9 nmの金-パラジウム合金（60:40）でスパッタコーティングしました（Hummer X Sputter Coater、Anatech USA、カリフォルニア州ユニオンシティ）。 次に、加速電圧 5 kV、口径 30 μm、平均作動距離 10 mm の Zeiss Supra 25 電界放出型走査型電子顕微鏡 (Carl Zeiss Microscopy, LLC、ニューヨーク州ソーンウッド) を使用して、コーティングされたサンプルを画像化しました。 SEM エネルギー分散型 X 線 (EDX) イメージング/分析を受けた ISFI は、カーボン テープを使用してアルミニウム スタブに取り付けられ、3 nm の金導電性コーティングでスパッタ コーティングされました。 次に、日立 S-4700 電界放射型走査電子顕微鏡を使用し、加速電圧 20 kV、ビーム電流 10 μA、平均作動距離 12 nm でコーティングされたサンプルを画像化しました。 EDX 分析は、顕微鏡に取り付けられた Oxford INCA PentaFet-X3 で加速電圧 20 kV で実行されました。

インビトロ放出研究は、以前に記載されているのと同様に実施されました20。 簡単に言うと、CAB ISFI の in vitro 薬物放出動態を、薬物を封入したポリマー溶液または懸濁液 (30 ± 3 mg) を 200 mL の放出媒体 (2% ソルトールを含む 0.01 M PBS pH 7.4) に注入し、シンク下でインキュベートすることによって調査しました。 37℃の条件。 ソルトールを添加すると、リリース媒体中の CAB の溶解度が増加し、シンク条件が維持されます 52。 CAB の飽和溶解度は、PBS 単独と比較して、2% Solutol を含む PBS では 4.3 倍増加しました。 シンク条件は、2% ソルトールが飽和溶液の 1/5 倍未満である PBS 中の最大 CAB 濃度として定義されました 52。 放出媒体を完全に除去し、シンク状態を維持するために毎週新しい媒体と交換した。 サンプルのアリコート (1 mL) を 1 週間は毎日、その後は毎週収集しました。 放出媒体中の薬物濃度は、HPLCによって測定した。 累積薬物放出はHPLC分析から計算され、インプラント内の薬物の総質量によって正規化されました。 すべての実験は 3 回繰り返して実行されました。

ISFI の安定性研究は、以前に記載されたのと同様に実施されました 20。 CAB ISFI 製剤は、Fisher Scientific Isotemp Incubator (ペンシルバニア州ピッツバーグ) 内の 4 °C または 40 °C/75% 相対湿度 (RH) のガラスチャンバー内で保管されました。 製剤バイアルが入っているガラスチャンバーには、40 °C で 75% の相対湿度を達成するために塩化ナトリウムの飽和塩水溶液が含まれていました54。 相対湿度 75% を確認するために、ガラスチャンバー内に湿度センサーが組み込まれています。 インキュベーション後 30 日および 90 日後に製剤を取り出し、サンプルのアリコート (1 ～ 2 mg、n = 4) を収集し、HPLC で分析して薬物含有量と薬物分解の可能性を評価しました。 配合物はまた、その物理的状態（すなわち、色および粘度）の変化について視覚的に検査された。 製剤が物理的安定性（つまり、変色、相分離または沈殿がない）、時間0での対照と同様の薬物含有量（<10％の差）、および均一な懸濁液を示した場合、保存後のin vitro放出研究を実施しました。

GPC は前述のように実行されました 30。 簡単に言うと、GPC を利用して、保存後のプラセボ ISFI のポリマー分解と、注射後 30 日、60 日、および 90 日後に BALB/c マウスから回収した CAB ISFI のポリマー分解を評価しました。 プラセボ ISFFI、CAB ISFIs、およびニートポリマーの GPC 分析は、TSKgel GMH-M カラムを備えた Tosoh Biosciences EcoSEC Elite HLC-8420 で実行されました。 カラムの寸法は 7.8 mm × 30 cm、細孔サイズは 5 ミクロンです。 テトラヒドロフランを移動相として流速０．５ｍＬ／分で使用した。 分子量はポリスチレン標準と比較して報告され、屈折率 (RI) 検出によって分析されました。

メスの BALB/c マウスにおける CAB ISFI の全身性および局所的炎症を評価するために、30 日間の in vivo 研究が実施されました（8 ～ 10 週間、Jackson Laboratory）。 すべての実験は、ノースカロライナ大学動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールに従って実行されました。 マウスの飼育条件には、周囲温度 68 ～ 72°F、湿度 30 ～ 70% で 12 時間/12 時間の明暗サイクルが含まれていました。 マウスに、19 G 針を使用して 50 μL の CAB ISFI 製剤を皮下注射しました (n = 9 マウス)。 2匹のマウスには注射を受けず、対照として使用した。 投与後 3、7、および 30 日目にマウスを屠殺し（CAB ISFI 治療群については各時点で n = 3 匹、3 日目には n = 1 匹の対照マウス、および治療も注射も受けなかった 30 匹）、血液サンプルを採取しました。心臓穿刺による血液を毛細管に収集し、-80 °C で保存し、酵素免疫吸着法 (ELISA、MAX) によって腫瘍壊死因子アルファ (TNF-α) やインターロイキン 6 (IL-6) などの炎症誘発性サイトカインを定量しました。 ™ デラックス セット、BioLegend®)。 ＩＳＦＩは、組織学用に、デポーとその下に皮下脂肪がある皮膚の周囲１ｃｍを周囲に切除し、標本全体をカードストック上に平らに置いて組織を平らに固定することによって採取した。 標本を、組織：固定液の比率が 1:10 の 10% 中性緩衝ホルマリンに室温で 72 時間置き、標本が粗くなるまで室温の 70% エタノールに移しました。 固定した皮膚標本を、デポーを中心に向けて中央で切断し、切断した皮膚の端をパラフィンブロックに埋め込みました。 サンプルを 4 μm で切片にし、Leica Biosystems の自動染色装置 XL を使用してヘマトキシリンおよびエオシンで染色しました。 切片をヘマトキシリン (Richard-Allen Scientific、7211) で 2 分間、エオシン -Y (Richard-Allen Scientific、7111) で 1 分間染色しました。 Richard-Allen Scientific の Clarifier 2 (7402) および Bluing (7111) 溶液を使用して反応を区別しました。 炎症は、認定獣医病理学者によって次のように採点されました。 0: 炎症細胞が予想される範囲内に存在します。 1: 炎症は最小限で、免疫細胞の増加はほとんどなく、点在する免疫細胞も存在します。 2: 軽度の炎症、免疫細胞の小さなクラスターから炎症の薄いまたは局所的な痕跡、または貯蔵所を取り囲む拡散性の細胞数の軽度の増加。 ３、中等度の、より厚い、または複数の炎症跡、またはデポーをびまん的に取り囲む中程度の数の細胞。 ４、正常な組織構造、または貯蔵所をびまん性に取り囲む大量の細胞を置き換えるのに十分な大きさの重度の合体した炎症の痕跡。 5、正常な組織構造の拡張領域に取って代わる、顕著な炎症が存在します。 治療グループの局所的および全身的な炎症を、注射なしの対照グループと比較しました。

雌 BALB/c マウスにおける CAB ISFI の in vivo 薬物動態を評価するために、90 日間の in vivo 研究が実施されました（8 ～ 10 週間、Jackson Laboratory）。 マウスを含むすべての実験は、ノースカロライナ大学動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールに従って実行されました。 マウスの飼育条件には、周囲温度 68 ～ 72°F、湿度 30 ～ 70% で 12 時間/12 時間の明暗サイクルが含まれていました。 マウスに、19 G 針を使用して 50 μL の CAB ISFI 製剤を皮下注射しました (n = 6 マウス)。 1時間、1日、3日、7日、30日、60日、および90日の時点で、マウスから末梢血をEDTAでコーティングした毛細管に採取し、血漿を単離した。 すべてのサンプルは、PK 分析まで -80 °C で保存されました。 CAB は、液液抽出によってマウス血漿から抽出され、その後 LC-MS/MS によって分析されました。 簡単に説明すると、マウス血漿 25 μL を、安定な同位体標識 13C,2H2,15N-CAB を含む 80:20 水:メタノール 40 μL および酢酸エチル 300 μL と混合しました。 混合および遠心分離後、有機層を除去し、蒸発乾固した。 ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、抽出物を７５μＬの０．１％ギ酸を含む７５：２５の水：０．１％ギ酸を含むアセトニトリルで再構成した。 クロマトグラフィー分離は、Waters XTerra MS C18 (50 × 2.1 mm、粒子サイズ 3.5 μm) 分析カラムを使用し、勾配条件下で AB Sciex API-5000 トリプル四重極質量分析計で検出しながら実行しました。 アッセイのキャリブレーション範囲は 25 ～ 50,000 ng/mL でした。 校正標準および品質管理サンプルは、公称濃度の 15% 以内でした。

有害事象が発生した場合に投与後に ISFI を安全に除去できるかどうかを評価するために、CAB ISFI を雌 BALB/c マウス（8 ～ 10 週、Jackson Laboratory）に皮下注射（50 μL）し（n = 18）、ISFI を除去しました。 30 日目 (n = 6)、60 日目 (n = 6)、および 90 日目 (n = 6)。 マウスを含むすべての実験は、ノースカロライナ大学動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールに従って実行されました。 マウスの飼育条件には、周囲温度 68 ～ 72°F、湿度 30 ～ 70% で 12 時間/12 時間の明暗サイクルが含まれていました。 投与後 30 日 (n = 6)、60 日 (n = 6)、および 90 日後 (n = 6) にマウスを安楽死させ、注射部位に隣接する小さな切開を行うことで ISFI を除去しました。 30日目、60日目、および90日目に抽出されたISFIをさらに処理して、GPC分析による質量損失、ポリマー分子量の減少を評価し（n = 3/時点）、残留薬物を定量化しました（n = 3/時点）。 残留薬剤濃度を定量化するために、余分な組織をインプラントから注意深く除去しました。 薬物抽出を容易にするためにインプラントを ACN に配置し、残留薬物濃度を HPLC 分析によって定量しました。

我々は、ポリアクリルアミドヒドロゲルを利用して、非ヒト霊長類に与えられる同様の注入量（１ｍＬ）でのＣＡＢ ＩＳＦＩの注入可能性を評価した。 ポリアクリルアミドヒドロゲル (40 mL) の調製は、以前に報告されたプロトコル 36、37 から適応されました。 簡単に言うと、40重量%のアクリルアミド水溶液(16 mL)、2重量%のビスアクリルアミド水溶液(2 mL)、および22 mLの0.01 M PBS pH 7.4を混合することによって、40 mLのヒドロゲルを調製した。 混合物を４℃に冷却し、続いて１０重量％ＡＰＳ（２ｍＬ）および２００μＬのＴＥＭＥＤを加え、４℃で一晩放置して溶液を重合させた。 1 mL のプラセボ ISFI または CAB ISFI 製剤を 16、18、または 19 G 針でヒドロゲルに注入し、注入可能性を評価しました。

すべての動物手順は、疾病管理予防センター (CDC) 施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 マカクザルは、「実験動物の管理と使用に関するガイド」に従って、CDC の獣医師の管理下で CDC で飼育されました。 すべての処置は麻酔下で行われ、適切な住居環境、栄養補助食品、十分な栄養補給の機会の提供など、不快感を最小限に抑えるためのあらゆる努力が払われました。

雌のアカゲザルの背中上部の異なる 2 か所に CAB ISFI (500 mg/mL) を皮下注射しました (1 部位あたり 0.5 ～ 1 mL)。 簡単に説明すると、麻酔をかけた動物を腹側臥位に置き、3ccシリンジに充填された半水性ISFI懸濁液を16G針を使用して皮下空間に投与した。 針を抜いた後、投与部位に指で短時間圧力を加えた。

インプラント除去の実現可能性を評価し、薬剤尾部を測定するために、触知可能なままの ISFI を、12 週目に 2 頭のマカクザル (RA-1097 および RA-1093、それぞれ 2 本のインプラント) から、および 14 週目に 1 頭の動物 (RH-1093) から外科的に採取しました。 42012; 1 つのインプラントが回収されました）。 動物を腹側臥位に置き、デジタル触診によってインプラントの位置を確認しました。 外科用メスを使用して、各インプラントの上に 1 つの皮膚切開 (約 1 インチ) を作成しました。 ISFI 物質は周囲の結合組織から慎重に分離され、ピンセットを使用してほぼ無傷で回収されました。 切開部位は異常がないか視覚的に検査され、その後、ポリジオキサノン縫合糸で閉じられる前に滅菌生理食塩水で洗い流されました。 動物は、獣医師によって毎週監視され、手術部位が適切に創傷治癒しているかどうかを評価し、局所感染の兆候がないことを確認した。

縦断的PK評価のために、6頭のメスのアカゲザルにCAB ISFIを投与し、続いて血漿、直腸および膣組織中の薬物レベルを測定した。 ５匹の動物には１ｍＬの注射を２回（合計１０００ｍｇのＣＡＢ）、１匹の動物（ＲＨ－１０８０）には１および０．５ｍＬの注射量（合計７５０ｍｇのＣＡＢ）を与えた。 CAB レベルは、以前に記載されている検証済みの LC-MS 法を使用して、血漿中では最長 11 か月間、組織では 4、8、および 12 週目に毎週測定されました 55。 直腸生検および膣生検は、マカクザル RH-42012、RA-1048、および RA-1080 から 4、8、および 12 週目に採取されました。定量下限は、生検および血漿についてそれぞれ 1 ng/mg および 10 ng/mL でした。 。

我々は、現在承認されているすべての PrEP レジメンの臨床効果を予測する反復曝露 SHIV162P3 直腸攻撃モデルを使用しました 56。 SHIV162P3 は、NIH AIDS Research and Reference Reagent Program (ARP-6526) から入手し、アカゲザル PBMC で増殖させました。 最終チャレンジストックを 10 TCID50 に希釈し、液体窒素中で 1 mL アリコートとして個別に保存し、各直腸チャレンジの前に解凍しました。 このモデルでは、10 TCID50 の SHIV162p3 に曝露された未処理の対照アカゲザルは、中央値 2 回の攻撃後に感染します 56,57。 研究には6頭のメスのアカゲザル（10歳、体重7～11kg）が使用された。 4人にはCAB ISFIを移植し、CAB濃度がタンパク質調整IC90の4倍（4×PA-IC90）を超えた期間中、週に2回SHIV162p3を直腸に曝露した。 これらのうち、2 人は移植後 4 週間から 8 週間の間に、それぞれ合計 8 回の SHIV チャレンジを受けました。 CAB ISFI デポーを 12 週目に両方の動物から外科的に除去して薬物テールを測定し、薬物休薬期間中の SHIV 感染をモニタリングしました。 残りの 2 匹の動物には、14 週目から 18 週目まで週に 2 回攻撃を与えました。 これらの動物のうちの1匹（RH-1048）は、25週目から28週目の間にさらに6回の攻撃を受けた。各グループのCAB処置動物の感染結果を、同じSHIV162p3ストックおよび用量で同時に攻撃した2匹の未処置動物と比較した。 攻撃中および診断検査のためのフォローアップ段階中、血液を毎週採取した。 血漿中のSHIV RNAは、50 RNAコピー/mlの感度でRT-PCRアッセイによって定量されました。 ウイルス特異的血清反応は、合成ペプチド酵素イムノアッセイアッセイ (BioRad、Genetic Systems HIV-1/HIV-2、レドモンド、ワシントン州) を使用して測定されました56。 SHIV攻撃および16週間の追跡期間中に血清陰性かつウイルスRNA陰性であれば、動物は保護されているとみなされた。

CAB ISFI インプラントの安全性と忍容性を評価するために、毎週健康チェックを実施しました。 身体検査には、動物の体重、一般的な健康状態のモニタリング、目に見える皮膚反応がないかインプラント周囲の領域の徹底的な検査が含まれます（補足図8）。 紅斑および浮腫は、Draize スケールに基づいて視覚的に等級付けされ、0 (反応なし) から 4 (重篤な反応) までのスコアで評価されました 58。

インプラント除去中に、薬物レベルを測定し、組織学的評価を行うために、インプラント位置の中央および頭蓋面で 2 つの 3 mm 外科用パンチ皮膚生検が収集されました。 1 つの生検は重さを量り、薬物レベル検査のために急速冷凍し、もう 1 つは組織学的検査のために 10% ホルマリンで固定しました。 ホルマリンに保存した生検材料を二等分し、包埋し、薄片化し、ヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) で染色しました。 切片は、炎症の種類と強度、線維症の多さ、および壊死の存在について評価されました。 切片は盲検化され、2 人の獣医病理学者によって独立して評価されました。 真皮および皮下組織内の好中球、リンパ球、形質細胞、マクロファージ、好酸球、反応性線維芽細胞および線維芽細胞を含む炎症細胞に対して、ISO ガイドライン (ISO 10993-6:2007) に基づく半定量スコアを使用しました。 各細胞型による浸潤の分布と重症度は 0 ～ 5 のスケールでスコア付けされ、0 は細胞が存在しないことを表し、5 は特定の細胞型による広範な浸潤を表します。

各インプラント (左および右) を組織から抽出し、BSL2 + 無菌環境の ACN に配置しました。 次に、サンプルを無菌環境から取り出し、振盪インキュベーター上に置きました。 抽出溶液からサンプルのアリコート (1 mL、n = 3) を収集し、HPLC で分析しました。

マカクザルにおける CAB ISFI 入力率の推定をサポートするために、ISFI 投与後 98 ～ 329 日間にわたって収集された血漿濃度を使用して、4 匹の動物について Phoenix WinNonlin v8.3 の線形アップログダウン台形則を使用して個々の CAB クリアランス率を NCA によって推定しました (補足図9)。 この推定は、投与後 84 日目にインプラントが除去された 2 匹の動物 (RH-1093 および RH-1097) では実行できませんでした。 したがって、AUCINF は式 \(f=\left(\right.{C}_{{last}}+\left({kel}*{{AUC}}_{{last}}\right)] に基づいて導出されました。 /({kel}*{{AUC}}_{{INF}})\)59 ここで、f は吸収された線量の割合 (つまり、負荷された質量 – 残留質量) であり、kel はデータに基づいて 0.173 hr-1 に固定されました。新薬申請で報告されています39。その後、クリアランスは \({Cl}=({Dose}*F)/({{AUC}}_{{INF}})\) によって計算されました。すべての計算は、 SQ 投与経路は 100% であり、これは報告された LA CAB IM 注射の集団 PK モデルに使用された仮定と一致しています 39。

マカクザルにおける CAB ISFI と CAB LA 入力率の比較をサポートするために、Quintessa Graph Grabber v2.0.2 ソフトウェアを使用して、50 mg/kg の CAB LA を 6 日間 2 回 IM 注射した 9 匹のマカクザルの公表されている濃度対時間のグラフから PK データを抽出しました。離れて38。 NCAを上記のように使用して、体重8 kgを想定して個々の動物のクリアランスを推定しました。

統計分析は、GraphPad Prism バージョン 9.4 (GraphPad Software, Inc.、米国カリフォルニア州ラホーヤ) で実行されました。 薬物負荷およびPLGA分子量を変化させたときのインビトロCAB放出プロファイルの差異を分析するために、二元配置ANOVA試験およびTukeyの多重比較試験を時点および製剤に関して実施した。 ベースラインと比較した保存後の in vitro CAB 放出プロファイルの違いを分析するために、時点と保存条件に関して二元配置 ANOVA テストと Tukey の多重比較テストを実行しました。 二元配置ＡＮＯＶＡ試験およびシダック多重比較試験を、時点および血漿中のＴＮＦ－αおよびＩＬ－６濃度に関して実行し、注射なし対照群とのインビボ全身性炎症の差異を分析した。 すべての統計検定について、0.05 未満の P 値は有意であるとみなされました (95% 信頼水準)。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

ソース データは、この論文の基礎となる図 1a ～ c​​、2a、c、3e、7b ～ d、および補足の図 1a ～ c​​、および 2a、b に提供されています。 他のすべてのデータは論文内で提供されます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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この研究は、国立アレルギー感染症研究所（SRB および MK への助成金番号 R01AI131430、SRB への R01AI162246、JVG への R01AI140799）、トランスレーショナル サイエンス推進国立センター（SRB への助成金番号 KL2TR001109-04）、ノース大学の支援を受けました。チャペルヒル エイズ研究センター (P30 AI050410) および国立科学財団大学院研究フェローシップ プログラム (ICY への助成金番号 DGE-1650116) のカロリーナ。 内容は著者のみの責任であり、必ずしも国立アレルギー感染症研究所の公式見解を表すものではありません。 この原稿の調査結果と結論は著者のものであり、必ずしも疾病管理予防センターの公式見解を表すものではありません。 マウス ISFI 注射を支援してくれた UNC Animal Studies Core (ASC)、UNC Clinical Pharmacology and Analytical Chemistry Core (CPAC)、特に Lauren Tompkins と Brian Van Horne、および Chapel Hill Analytical and Nanofabrication Laboratory (CHANL) に感謝します。 ）SEM EDX 分析の支援、特に Amar Kumbhar に感謝します。

これらの著者は同様に貢献しました: Isabella C. Young、Ivana Massud。

この作品は、Gerardo Garcίa-Lerma、S. Rahima Benhabbour の著者が共同で監修しました。

ノースカロライナ大学チャペルヒル校、エシェルマン薬科大学院、薬剤工学および分子薬学部門、米国ノースカロライナ州チャペルヒル

イザベラ・C・ヤング＆S・ラヒマ・ベンハブール

米国疾病管理予防センター、国立 HIV/エイズ、ウイルス性肝炎、性感染症、および結核予防センター、HIV 予防部門、研究部門、米国ジョージア州アトランタ

イヴァナ・マスード、アンドリュー・ウォンサム、チュオン・ディン、ティエンチェン・エドワーズ、ジェームズ・ミッチェル、ワリド・エネイン、チャールズ・W・ドバード、J・ジェラルド・ガルカ＝レルマ

ノースカロライナ大学チャペルヒル校エシェルマン薬科大学院薬物療法および実験療法学科、米国ノースカロライナ州チャペルヒル

マッケンジー L. コットレル、アマンダ シャウアー、クレイグ サイクス & アンジェラ DM カシューバ

ノースカロライナ州立大学およびノー​​スカロライナ大学チャペルヒル校共同生体医工学部（米国ノースカロライナ州チャペルヒル）

ルーパリ・シュリヴァスタヴァ、パニータ・マトゥラヴォングサディット、アルカ・プラッシャー、アリソン・ソーソン、S・ラヒマ・ベンハブール

国立疾病管理予防センター、国立新興・人獣共通感染症センター、科学資源部門、比較医学部門、米国ジョージア州アトランタ

ヴィクトリア・ムロッツ

国立疾病管理予防センター、国立新興・人獣共通感染症センター、高影響病原体・病理学部門、感染症病理学部門、米国ジョージア州アトランタ

ジョシリーン・ナシメント・セイシャス

ノースカロライナ大学チャペルヒル校心理神経科学学部、チャペルヒル、ノースカロライナ州、米国

アリヤニ・パレラ

米国ノースカロライナ大学医学部、ラインバーガー総合がんセンター、病理サービスコア、チャペルヒル、ノースカロライナ州、米国

ガブリエラ・デ・ラ・クルス & ステファニー・A・モンゴメリー

トランスレーショナルサイエンス国際センター、感染症部門、エイズ研究センター、ノースカロライナ大学チャペルヒル校、米国ノースカロライナ州チャペルヒル

マルチナ・コバロワ & J. ビクター・ガルシア

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概念化: SRB、JGG-L.、IM、CWD、JVG、MK 方法論: JGG-L.、SRB、IM、ICY、CW​​D、PM、AP、MLC、SAM、GDC調査: ICY、IM、CWD、PM、AP 、RS、AW-S.、CS、JM、AT、AP、AS、CD、MLC、SRB、JGG-L。 視覚化: ICY、IM、CWD、SRB、JGG-L、。 TE、VM、JNS 資金調達: SRB、JGG-L.、JVG、MK プロジェクト管理: SRB、JGG-L.、JVG、MK、ADMK、WH 監督: SRB、JGG-L.、JVG、ADMK 執筆 - 原文ドラフト: ICY、IM、CWD、SRB、JGG-L.、MLC、CS、SAM、執筆 – レビューおよび編集: ICY、IM、CWD、SRB、JGG-L.、JVG、MK、WH

J. Gerardo Garcίa-Lerma または S. Rahima Benhabbour との通信。

SRB、ICY、RS、および PM は、超長時間作用型薬物送達のための注射可能なポリマーベースの薬物製剤について記載した特許の発明者です。 JGG-L. と WH は米国での名前です。 「化学予防による HIV 感染の阻害」に関する政府特許。 JGG-L.、 IM、WHは米国での名称です。 「HIV曝露後予防法」に関する政府特許と米国。 「HIV曝露前予防法」に関する政府特許出願。 残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Cristian Apetrei と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Young, IC、Massud, I.、Cottrell, ML 他。 カボテグラビルを使用した超長時間作用型 in situ 形成インプラントは、メスのマカクザルを直腸 SHIV 感染から保護します。 Nat Commun 14、708 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-36330-5

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受信日: 2022 年 9 月 16 日

受理日: 2023 年 1 月 24 日

公開日: 2023 年 2 月 9 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36330-5

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