ウイルス崩壊を迅速かつ安価に評価するための新しい不活化ウイルス システム (InViS)

Oct 23, 2023

Scientific Reports volume 12、記事番号: 11583 (2022) この記事を引用

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新型コロナウイルス感染症（COVID-19）のパンデミックにより、世界中で抗ウイルス表面に大きな関心が集まっており、ここ数年でウイルスの感染を減らすための革新的な材料システムの研究開発が劇的に増加しました。 国際標準化機構 (ISO) 規格 18,184 および 21,702 は、多孔質および非多孔質表面の抗ウイルス特性を特徴付ける 2 つの標準的な方法です。 しかし、パンデミックの最後の数年間に、抗ウイルス材料のより迅速かつ安価な特性評価の必要性が認識されました。 したがって、抗ウイルス技術の初期段階の開発と抗ウイルス材料の生産の品質監視を安全かつ効率的に促進するために、不活化ウイルス システム (InViS) に基づく補完的な方法が開発されました。 InViS には、ウイルスエンベロープが崩壊するときに蛍光が測定可能なほど増加する自己消光型蛍光色素が組み込まれています。 本研究では、既知の抗ウイルス剤によるウイルス崩壊に対する InViS の感受性が実証され、新規材料および表面の特性を評価する可能性が探求されています。 最後に、InViS はフェイスマスク層内のウイルス粒子の運命を決定するために使用され、技術的および医療用途向けの抗ウイルス表面システムの開発をサポートする興味深いツールとなっています。

2019年12月に武漢で謎の未知の肺疾患として始まったものは、「スペイン風邪」に似た深刻なパンデミック、つまり新型コロナウイルス感染症に発展した。 引き金となるのはベータコロナウイルスSARS-CoV-2で、喉や気道の炎症、咳、息切れ、疲労、発熱、筋肉痛、結膜炎、嗅覚障害、味覚障害などのさまざまな症状を引き起こします。 重症の場合は、急性肺不全、多臓器不全、死に至る可能性があります1。

2022 年 6 月の時点で、世界中で確認された新型コロナウイルス感染症の感染者数は 5 億 2,900 万人に達し、死亡者数は 600 万人を超えています2。 その間に効果的なワクチンやより良い治療戦略が開発されてきましたが、伝染性の高い新たな変異株と貧しい国での低いワクチン接種率により、医療システムは引き続き限界に追い込まれています。 したがって、ウイルスの伝播を防ぐためには、接触の減少、衛生管理、フェイスマスクなどの非医薬品的介入が引き続き重要です3。

これらの対策の全体的な目標は、人々の間での病気の感染を遅らせることです。 新型コロナウイルス感染症（COVID-19）は、主に、密接に接触している人々の間で飛沫によって広がります4。 しかし、病気の伝播には他のメカニズムも考えられます。 たとえば、エアロゾル感染は屋内の混雑した換気の悪い空間で発生する可能性があり、また、感染者がウイルスに汚染した表面や物体に触れ、その後目、鼻、口（媒介物）に触れることによって、間接的に新型コロナウイルス感染症に感染する可能性もあります。送信）4． SARS-CoV-2は、ウイルスが付着した表面の化学的性質に応じて、数時間から数日間安定であることが示されています。 たとえば、van Doremalen et al. SARS-CoV-2 がプラスチックやステンレス鋼の表面上で数時間安定して存在することを実証しました。 これらの表面に塗布した後、生存ウイルスは最大 72 時間検出でき、SARS-CoV-2 の半減期はステンレス鋼では 5.6 時間、プラスチックでは 6.8 時間と推定されました5。 対照的に、段ボールの表面では 24 時間後に生存ウイルスは検出されず、銅の表面では 4 時間以内にウイルスが不活化する傾向がありました 5。 チンら。 SARS-CoV-2 は滑らかで疎水性の表面ではより安定であることが確認されました。 3 時間後には印刷用紙や組織培養紙から感染性ウイルスは回収できませんでしたが、2 日後でも処理された滑らかな表面 (ガラスや紙幣)、4 日後でもステンレス鋼やプラスチック、疎水性の外側には生存可能な感染性ウイルスが依然として存在していました。 7日後のサージカルマスクの層6.

この高い表面安定性によりスミア感染のリスクが高まるため、タッチスクリーン、ドアノブ、換気フィルター、繊維製品、電車の座席、手すりなどの脆弱な表面に到達したウイルス粒子を、さらなる消毒プロセスなしで即座に不活化できれば、非常に有益です。 不適切なマスクの取り扱いはよくある問題であるため、同じことがフェイスマスクに付着したウイルス粒子にも当てはまります。

したがって、抗ウイルス材料、コーティング、フェイスマスクの開発は、新型コロナウイルス感染症と戦うだけでなく、将来の同様のパンデミックや伝染病の発生を防ぐためにも非常に重要です。

ウイルスを不活化したり、破壊したりする方法はいくつかあります。 最もよく知られているのは、ウイルスの脂質およびタンパク質構造を崩壊させる洗剤またはエタノール溶液 7、8、9、10、波長 200 ～ 300 nm の紫外線 (UVC) などの放射線 11、12、13、オートクレーブなどの熱処理 14 です。 、15、酸化16、17、または高い正の表面電荷18、19。 新しい抗ウイルス材料が開発される場合、ウイルスを捕捉、不活化、および/または殺す可能性を調査し、定量化することが重要です。 現在、プラスチックおよびその他の非多孔質表面の抗ウイルス活性の測定 (ISO 21702) と繊維製品の抗ウイルス活性の測定 (ISO 18184) を規制する 2 つの ISO 規格が利用可能です。 どちらの基準でも、感染性ウイルス力価はプラークアッセイまたは組織培養感染量中央値 (TCID50) 法のいずれかによって決定する必要があります。 これらのアッセイは両方とも、実際の感染性ウイルスを使用する必要があり、ウイルスによって引き起こされる細胞変性効果を in vitro で視覚的に評価できるという原理に基づいています。 これらのアッセイは、材料の抗ウイルス活性に関して信頼性が高く同等の結果をもたらしますが、いくつかの欠点があります。たとえば、SARS-CoV-2 などの実際のウイルスを扱うには、特別なインフラストラクチャ (たとえば、バイオセーフティ レベル 3 を備えたラボ) と訓練を受けた従業員が必要です。 これにより、ほとんどの産業および研究現場でのこれらの分析の広範な使用が妨げられ、その結果、現在の新型コロナウイルス感染症のパンデミック中に観察されたような新しい抗ウイルス材料の急速な開発が遅れます。 したがって、潜在的な抗ウイルス特性について、多数の材料および表面の迅速、安価、安全な事前スクリーニングを促進するための、新規の特性評価方法が緊急に必要とされている。

この研究では、不活化オクタデシルローダミン R18 をロードした A/Brisbane 59/2007 インフルエンザ ウイルス システム (InViS) を感染性ウイルスの代用として利用し、簡単な蛍光測定によってウイルスの崩壊を評価します。 この新しいウイルス システムにより、さまざまな化学物質、洗浄剤、材料の抗ウイルス効果を簡単な方法で研究できます。蛍光プローブは無傷のウイルス脂質構造内で自己消光するため、ウイルス粒子が崩壊すると蛍光が増加します (図 1)。 。

InViS は、抗ウイルス材料によって引き起こされるウイルスエンベロープの崩壊を検出するための蛍光アプローチです。

この研究では、抗ウイルス化学物質 (70% エタノール、クエン酸)、さまざまな潜在的な抗ウイルス ナノ粒子 (NP) の効果を分析することにより、代替の事前スクリーニング方法としてのこの新しい InViS の応用分野、予測力、および限界を調査し、定義しました。そして表面コーティング。 さらに、InViS の使用を活用して、フェイスマスク層内のウイルス粒子の運命と局在を評価および定量化しました。

ウイルスの不活化と蛍光色素 20 の負荷は、ワクチン研究に適用される確立された手順です。 ここでは、抗ウイルス特性評価の分野におけるこのような不活化ウイルスの可能性を探ります。 この研究で使用される不活化ウイルス システム (InViS) は、不活化オクタデシルローダミン (R18) 標識 A/Brisbane/2007 インフルエンザ ウイルス溶液で構成されており、その蛍光は膜の破裂または融合によって増加します 21。

測定されたウイルス濃度は 1.5 × 1013 (± 9.8 × 1010) 粒子 mL-1 で、ウイルス粒子は 110.6 ± 0.8 nm の非常に均一なサイズを示しました。 ウイルス内部の蛍光標識は自己消光され、無傷のウイルスの蛍光は界面活性剤オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル（OEG）の添加後の蛍光のわずか23％でした（図2A）。 動的光散乱 (DLS) 測定により、洗剤がウイルス粒子に損傷を与え、その崩壊を引き起こしたことが確認されました。 界面活性剤投与前の InViS システムは単分散 (多分散指数 (PdI) 0.063 ± 0.023) でしたが、OEG の添加により、ウイルス断片に対応すると考えられる小さいピークと大きいピークを備えた高度に多分散のサンプル (PdI 0.443 ± 0.048) が得られました。凝集したウイルス構造と界面活性剤ミセル (図 2B)。 したがって、InViS システムを使用すると、高速かつ簡単な蛍光読み取りによって化学物質や材料のウイルス崩壊特性を評価できます。 検出限界（機器のベースライン応答からの蛍光の増加によってウイルス崩壊が検出できなくなる粒子濃度として定義される）は段階希釈によって決定され、108 粒子 mL-1 でした。

InViS に対する OEG の影響。 (A) InVis の蛍光強度は 300 秒にわたって連続的に監視されました。 280 秒後、OEG をサンプルに添加してウイルスの崩壊とウイルス膜からの蛍光 R18 標識の放出を誘導しました。 (B) 洗剤投与の前後に DLS によって測定された粒度分布。 完全な InViS は高度に単分散です。 界面活性剤と接触すると、ウイルスは崩壊し、いくつかの残留凝集塊とより高い多分散指数をもたらします。

InViS が洗剤に敏感なだけでなく、異なる抗ウイルス力を持つ他の既知の抗ウイルス化合物も検出できることを検証するために、70% エタノールとクエン酸 (1 M) を使用してさらなる実験を実行しました。 どちらの化学物質も蛍光シグナル強度の大幅な増加を引き起こしました (図 3)。 ただし、穏やかな抗ウイルス剤クエン酸 22 (pH 2.95) は R18 標識の部分的な放出のみを誘導しましたが、70% エタノールの添加により、陽性洗剤対照と同様のほぼ完全な放出が検出されました。

クエン酸 (1 M) および 70% エタノールとインキュベートした後の InViS の蛍光強度。 PBS中のInViSおよびOEGで処理したInViSは、それぞれ陰性および陽性対照として機能した。 結果は、それぞれ 2 回反復した 3 回の独立した実験からの平均値と対応する標準偏差を表します。 ネガティブコントロールと比較して $p < 0.01、£p < 0.001。

さまざまな研究により、酸化銅 (CuO)、酸化亜鉛 (ZnO)、二酸化チタン (TiO2)、金 (Au)、銀 (Ag)、セレン (Se)、酸化グラフェン (GO) を含むいくつかの NP が抗ウイルス特性を備えていることが示されています 23。 24、25、26、27、28、29 ですが、根底にある毒性メカニズムは完全には理解されていないことがよくあります。 これらの NP タイプの抗ウイルス機構にウイルス崩壊が含まれるかどうかを調べるために、InViS をさまざまな NP 濃度で 2 時間および 24 時間インキュベートし、蛍光強度を測定して蛍光 R18 標識の放出の可能性を検出しました。 蛍光レベルは増加せず、ネガティブコントロール（NPを含まない無傷のInViS）と同等であったため、調査したNPはいずれもInViSエンベロープを破壊できませんでした（図4）。 NP 濃度が増加すると、未処理の対照サンプルと比較して蛍光強度の減少さえありました。 潜在的な干渉反応を避けるために、蛍光測定の前にNPを遠心分離によって除去しましたが、さらなる干渉研究を実施し、NPの自己蛍光シグナルまたは蛍光測定に対する非特異的影響が存在しないことを確認しました（データは示されていません）。

InViS を NP とインキュベートした後の蛍光強度。 NP 懸濁液を InViS 溶液とともに 2 時間および 24 時間インキュベートし、蛍光測定前に懸濁液を遠心分離して NP を除去しました。 ネガティブコントロールは PBS (0.4% v/v) 中の InViS、ポジティブコントロールは PBS (0.4% v/v) および OEG (1.25 mg mL-1) 中の InViS です。 結果は、実験ごとに 2 つの技術的反復を行った少なくとも 3 つの独立した実験からの平均値と対応する標準偏差を表します。 *ネガティブコントロールと比較した場合、p < 0.05、$p < 0.01、£p < 0.001、#p < 0.0001。

化学物質や NP の抗ウイルス効果を検出するための InViS システムを評価した後、表面やコーティングの抗ウイルス能力を検出するためのその適合性をさらに評価しました。 平らで非多孔性の抗ウイルス表面を得るために、滅菌細胞培養プレートを新規の抗ウイルスコーティング溶液でコーティングしました（特許番号 PCT/EP2021/06058030）。 InViS をコーティングされた表面またはコーティング溶液の液体形態と接触させたところ、両方の場合において蛍光強度の大幅な増加が検出できました (図 5)。これはウイルスのカプセルの崩壊を明確に示しています。

抗ウイルスコーティングと接触後の InViS の蛍光強度。 液体およびコーティングされた形態の抗ウイルスコーティング溶液 (特許番号 PCT/EP2021/06058030) の両方で蛍光が大幅に増加し、ウイルスのカプセルの崩壊を示します。 PBS中の無傷のInViSおよびOEGとインキュベートしたInViSの蛍光レベルは、それぞれ陰性および陽性対照として機能しました。 結果は、2 回の技術的反復による 3 回の独立した実験の中央値と対応する標準偏差を表します。 ネガティブコントロールと比較して $p < 0.01 および £p < 0.001。

私たちは、ウイルスの崩壊を検出することに加えて、InViS システムは多層フェイスマスクや織物中のウイルス粒子の運命と局在を検出するのにも適していると仮説を立てました。これは、どの層が強力な抗ウイルス活性を発揮する必要があるかを理解するための非常に貴重な情報です。 私たちは、濾過効率試験システムを使用して、布製コミュニティマスク、サージカルマスク、および FFP2 (EN149 規格で定義され、米国規格の N95 マスクに対応) マスクを InViS を含むエアロゾルに曝露しました。 比較として、繊維の濾過効率を評価するための現在の欧州標準手順 (EN13274-7) に相当する塩溶液を使用した濾過効率試験も実施しました。 濾過試験後、さまざまなマスク層を剥がし、走査型電子顕微鏡 (SEM) (塩および InViS、繊維コミュニティ マスクのみ) および蛍光測定 (InViS のみ、すべてのマスク タイプ) によって粒子の位置を評価しました。

コミュニティマスクの外側の織物層（図6A、A'、B）と内側のメルトブローン層（図6C、C'、D、D'、F–H）の濾過効率テストの前後の顕微鏡写真を示します。塩または InViS 粒子を使用します。 さらに、マスク層内のウイルス粒子の識別を容易にするために、TEM グリッド上の InViS の SEM (図 6E) が含まれています。 InViS 粒子はサイズが約 100 nm の単分散であるように見えましたが、塩の結晶はより大きく見えました。

ろ過効率テスト後の繊維コミュニティマスク内の NaCl および InViS 粒子の局在化。 NaCl による濾過効率試験後の顕微鏡写真は、(A) 織物コミュニティ マスクの最外織層、(B) NaCl 粒子による濾過試験後の最外織層の細孔、(C) 内側のメルトブローン濾過層、および ( D) 内側のメルトブローン濾過層によって濾過された塩粒子。 (A' ～ D') は、(A ～ D) の白い象限の倍率を表します (C では見えない別の領域からの C' を除く)。 InVIS による濾過効率テスト後の顕微鏡写真は次のとおりです: (E) 透過型電子顕微鏡 (TEM) グリッド サンプル ホルダー上の InViS の SEM 画像、(F) および (G) 内側のメルトブローン濾過層 (塩の結晶と InViS 粒子は矢印で強調表示されています)と矢印）。 (H) は、濾過実験を受けていない内側のメルトブローン層からの参照繊維です。

濾過効率の実験中、空気は最初にマスクの外側の織物層の細孔を通過し、そこでは細孔付近に塩粒子の優先的な蓄積が観察されたが、外層の繊維の大部分には粒子がなかった（図6B）。 、B')。 InViS 粒子は外側の織物層では観察されませんでした。 次に、空気が内側のメルトブローン層に到達すると、塩 (図 6D) および InViS (図 6F、G) 粒子がかなり蓄積していることがわかりました。 内側メルトブローン層への InViS 粒子の優先的な局在化を半定量的にさらに裏付けるために、相補的な蛍光測定を実行しました。 したがって、異なるマスク層をエタノールで処理して、吸着した InViS からローダミンを放出しました。 外科用マスク、布地マスク、FFP2 フェイスマスクの各層に対応する蛍光強度を図 7A、B に示します。 このウォッシュアウトにより InViS の崩壊が生じましたが、蛍光強度は濾過されたウイルス粒子の量に比例するため、各層のウイルス粒子の定量は可能でした。

InViS による濾過効率テスト後の、布地マスク、サージカルマスク (A)、および FFP2 (B) マスクのさまざまな層の蛍光強度。 気流は右から左（外層から内層）に流れました。 EtOH コントロールはエタノール溶液のみの蛍光値です。 結果は、2 回の技術的反復による 3 回の独立した実験の平均値と対応する標準偏差を表します。 *コントロールと比較して、p < 0.05、$p < 0.01、£p < 0.001、および #p < 0.0001。

深刻な新型コロナウイルス感染症のパンデミックは、過去 2 年半で人々の生活を劇的に変えました。 オフィスでの通常の仕事、友人との会合、文化的イベントへの参加、旅行など、これまで当たり前と思われていたことが突然不可能になりました。 ロックダウンにより世界中の人々が自宅待機を余儀なくされ、経済に悪影響を及ぼしました。 医療システムは限界に達し、多くの人が重篤な病気に苦しんだり、死亡したりしました。 パンデミックと戦うために、多くの研究者や臨床医は、この病気を理解し、効率的なワクチンと治療法の選択肢を開発するという高いプレッシャーの下で取り組みました。 並行して、繊維産業は、人々の間での病気の感染を遅らせるために、使いやすく快適で効果的なフェイスマスクの開発に集中的に取り組みました31。

すぐに、抗ウイルス材料および表面の開発が、SARS-CoV-2 の蔓延を遅らせ、直接接触による感染を防ぐ効果的な手段であることが認識されました。 ただし、抗ウイルス材料の開発には時間とコストがかかります。 大きな問題の 1 つは、新しく開発されたコーティングと材料の抗ウイルス特性は、実際のウイルスを使用したテストを実施することによってのみ評価できるということでした (ISO 21702 および ISO 18184)。 これには、訓練を受けた従業員と特別なインフラストラクチャ（バイオセーフティレベル 3 を備えたラボなど）が必要でしたが、ほとんどの材料開発者にとってアクセスが困難であり、革新的な抗ウイルス材料の開発が大幅に遅れました。

したがって、安価であり、取り扱いが容易で安全な代替試験方法は、革新を進め、実際のウイルスを用いたさらなる試験のための有望な候補を迅速に特定するために、新しい抗ウイルス材料設計の迅速な事前スクリーニングを促進する上で非常に価値があります。 この研究では、簡単な蛍光測定によって液体、化合物、材料のウイルス分解活性を迅速、安価、安全に検出できる新しい代替ウイルスシステムであるInViSを紹介します。 我々は、SARS-CoV-2と構造的に類似性があり、表面にヘマグルチニンを有するサイズ約100nmのエンベロープRNAウイルスを構成する、不活化ローダミン18標識A/ブリスベン59/2007インフルエンザウイルスを使用した。 このウイルスは、抗原ウイルスの構造を保存するβ-プロピオラクトンで不活化されていますが、核酸塩基のアルキル化、ゲノム複製の抑制、ゲノム分解の誘導、タンパク質とゲノムの架橋によりウイルスは非感染性になります32。 InViS の最も興味深い特徴は、蛍光プローブがウイルス膜内で自己消光することです。 その結果、ウイルス粒子が崩壊して蛍光色素を放出すると、InViS の蛍光が大幅に増加します。

エタノールは脂質膜の溶解とタンパク質の変性によってウイルス粒子を分解できることが知られています 33,34,35。 同様に、pH が低いと膜の分解が起こる可能性があります 36、37、38。 したがって、既知の抗ウイルス液に対する感度をテストするために、InViS を 70% エタノールとクエン酸にさらしました。 実際、どちらの化学物質も蛍光を大幅に増加させました。 InViS 粒子がエタノール溶液と接触すると、ウイルスの完全な分解が 5 分以内に起こりました。 クエン酸溶液の場合、ウイルスの崩壊は部分的なままであり、InViS システムがウイルスの崩壊に関する（半）定量的なデータを提供できることを示しています。

一部の NP は抗ウイルス特性を持つ可能性があるため、新規の抗菌材料およびコーティングの開発のために広く研究されています 16、23、39。 そこで、Ag、Au、CuO、ZnO、TiO2、酸化グラフェンの NP が InViS を崩壊できるかどうかを調査しました。 調査した NP タイプについては抗ウイルス効果が報告されていますが、試験した NP はいずれも、最大 24 時間の長時間曝露でもウイルスエンベロープの崩壊を誘発しませんでした。 NP 濃度の増加に伴って蛍光シグナルがわずかに減少することさえ観察されました。これは、ウイルスカプセル表面への粒子の吸着および/または浸透、およびその後の遠心分離ステップ中の液体サンプルからの除去による可能性があります。 これは、遠心分離中の Au NP とインフルエンザ A ウイルスの共沈が報告された Kim らによって発表された結果と一致すると考えられます 24。

NP に関するこれらの結果は、ほとんどの NP の抗ウイルス活性がカプセルの崩壊以外の効果に依存しているようであることを示唆する既存の文献と一致しています。 例えば、Ag NP は、ウイルスのキャプシドタンパク質に結合または変性するか、ウイルスの細胞受容体への結合を阻害するため、ウイルスの宿主細胞への侵入を防ぐことが示されています 23。 Cu を含む NP は、フェントンまたはフェントン様反応を介してラジカルの生成を触媒し、カプシドタンパク質を酸化し、その結果、初期段階でウイルス感染をブロックする可能性があります 23。 AuNP は、ウイルス表面の赤血球凝集素糖タンパク質のジスルフィド結合を酸化し、その不活化を引き起こし、ウイルスと宿主細胞の膜融合を妨げることが示されています 23。 TiO2 NP はウイルスエンベロープ内の脂質と糖タンパク質を損傷する可能性があります40。 グラフェンナノシートは疎水性のタンパク質間相互作用を遮断することができ、酸化グラフェンはウイルス粒子を吸着することができるため、細胞膜との相互作用を防ぐことができます。

この知識により、当社の InViS システムの最大の限界が明らかになります。膜溶解が唯一の不活化方法ではないため、InViS を使用してすべての抗ウイルス材料を特性評価できるわけではありません。 それにもかかわらず、多くの抗ウイルス材料はウイルスエンベロープの分解に依存しています。 InViS の目的は、既存の承認された ISO テストを置き換えることではありません。 むしろ、研究開発の初期段階でウイルスの崩壊（潜在的な耐性の発現を防ぐ）を評価するための、シンプルで安価かつ安全な代替手段を提供するように設計されました。 このシステムは、脂質エンベロープを分解するように設計された材料の有効性を評価したい研究者や製造業者にとって特に興味深いものです。 この研究では、このような抗ウイルス コーティング ソリューション (特許番号 PCT/EP2021/06058030) を InViS で評価しました。 我々は、蛍光の強い増加を報告し、コーティング溶液が実際にウイルスの崩壊をもたらしたことを確認した。 このような迅速な試験は、抗ウイルス液やコーティングの開発に非常に有益です。 たとえば、多数の異なる物質、組成、濃度をスクリーニングして、さらなる開発に最も有望なソリューションを特定することができます。

さらに、InViS を使用して、多層構造、織物、フェイスマスク内の NP の運命と局在を検出することができます。 InViS を濾過効率システムに導入し、さまざまなタイプのフェイスマスクの性能を評価しました。 これにより、塩や油などの規格で規定された物質の代わりに、生物学的に関連したウイルス粒子を含むエアロゾルの使用が可能になった。 塩の結晶とウイルス粒子が混在しているため、粒子分析装置を使用してウイルスエアロゾルからの濾過効率を直接測定することはできませんでした。 それにもかかわらず、さまざまなマスク層におけるウイルス粒子の蓄積と、ウイルス粒子のモデルとして NaCl 粒子を使用することの関連性に関する重要な情報が得られました。 異なる層をSEMで画像化したところ、塩粒子とウイルス粒子の両方が内側のメルトブローン層に優先的に蓄積していることが明らかになり、サイズや形状の特徴が異なるにもかかわらず、NaClエアロゾルがウイルス粒子の代表である可能性があることが示唆された。 それにもかかわらず、濾過効率ベンチの適応を実装して、InViS で濾過効率テストを実施することができます。 たとえば、残りのウイルス粒子を溶液中に収集できるバブラーを使用して、テストしたフェイスマスクとフィルターを通過した残留ウイルス粒子を収集することによって濾過効率を定量化することは興味深いでしょう。 マスクサンプルの残留蛍光をブランクサンプルと比較することにより、濾過効率の変動を検出できる可能性があります。 これにより、ウイルス粒子を使用したフェイスマスクの濾過効率の評価が可能になり、より適切な暴露シナリオにおける実際のウイルスに対する医療および技術濾過システムの濾過特性の決定に一歩近づくことができます。

結論として、我々は、簡単な蛍光測定によるウイルス崩壊の迅速かつ安価かつ安全な評価のために、不活化ウイルスシステム（InViS）を用いて潜在的な抗ウイルス化合物および表面を評価する新しい方法の開発を報告する。 InViS はさらに、工業用および医療用繊維などの非多孔性材料および多孔性材料上のウイルス粒子の運命と局在を研究するために使用でき、新しい抗ウイルス材料、コーティング、フェイスマスクの開発をサポートする貴重なツールになります。

GMP グレードで化学的に不活化および精製された一価インフルエンザ ウイルス A/ブリスベン/59/2007 (H1N1) 溶液を Seqirus (オーストラリア、メルボルン) から入手し、シングルラジアル免疫拡散アッセイ (SRID) によって測定されたヘマグルチニン (HA) (1.6 mg mL-1) を測定しました。 ローダミン B オクタデシル エステル過塩素酸塩 (R18) は Merck KGaA (オランダ) から購入し、最終濃度 10 mM で HLPC グレードの無水エタノールに溶解しました。 R18 溶液 (40 μL) を、200 rpm で 15 分間連続撹拌しながら、室温 (RT) でインフルエンザ溶液 (1 mL) に滴下添加しました。 取り込まれなかったＲ１８を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０カラム（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）での分離により除去した。 空隙容積画分が収集され、さらに特徴付けられました。

粒子サイズ、サイズ分布および濃度は、Malvern NanoSight LM10 機器のナノ粒子追跡分析によって分析されました。 サンプルを HNE バッファー (HEPES (10 mM) pH 7.4、NaCl (142.5 mM)、EDTA (5 mM)、使用前に 0.1 µm シリンジフィルターでろ過) で 1:10,000 に希釈し、405 の分析チャンバーに注入しました。 25 °C の制御温度および 0.975 ～ 0976 Cp の粘度設定で 70 ユニットの定流量を備えた nm レーザー モジュール。 5 回のキャプチャが実行され、各キャプチャの持続時間は 60 秒でした。 カメラ設定はレベル 15、検出閾値 3 でした。R18 蛍光および融合活性を測定して、蛍光消光およびウイルス表面上の HA の存在を確認しました 20,41。 インフルエンザウイロソームと赤血球ゴーストの融合のために、培地をpH 4.5に酸性化しました。 R18 蛍光は、それぞれ 560 nm と 590 nm の励起波長と発光波長で連続的に測定されました。 融合実験における蛍光スケールの校正のために、標識膜の初期蛍光をゼロに設定し、無限プローブ希釈での蛍光を 100% に設定しました。 後者の値は、OEG (Merck KGaA、オランダ、最終濃度 1 mM) の添加後に得られました。 出荷後にウイルスが無傷のままであることを確認するために、DLS 測定を実行して、OEG (Zetasizer Nanoseries、Nano-ZS90、Malvern、Worcestershire、UK) の添加前後の PBS 中でのウイルス粒子の流体力学的直径とその多分散指数を決定しました。 、1.25 mg mL−1）。 さらに、OEGの有無にかかわらず段階希釈したウイルスの蛍光測定（1.25 mg mL-1、インキュベーション時間5分）をHoriba FluoroMax Spectra蛍光計で実行し、検出限界を確立しました。

70% エタノール (CAS 64-17-5) およびクエン酸 (1 M; CAS: 77-92-9) を InVis (0.4% v/v) とインキュベートしました。 サンプルをボルテックスミキサーでホモジナイズし、室温で5分間インキュベートしました。 蛍光測定は、Horiba FluoroMax SpectraFluorometer を使用して実行されました。 励起波長は 560 nm で、発光スペクトルは 580 ～ 650 nm で測定されました。 ＰＢＳ中のＩｎＶｉＳ溶液（０．４％ｖ／ｖ）を陰性対照として使用して、無傷のウイルスの蛍光強度を提供した。 陽性対照として、OEG (CAS: 3055-98-9; 2.5% v/v) を添加してウイルスを分解し、対応する蛍光強度を示しました。

NP の潜在的な抗ウイルス効果を研究するために、以前の研究で使用され、完全に特徴付けられた粒子を使用しました。 粒子の最も関連する特性を表 1 にまとめます。

懸濁液として入手可能な粒子 (Ag-COONa、Au-5-COONa) を超純水で 1 mg mL-1 のストック懸濁液に希釈し、ボルテックスミキサー (1 分間) を使用して均質化しました。 粉末として入手可能な粒子 (CuO、酸化グラフェン、TiO2、ZnO) を、230 V/50 Hz で動作するプローブ超音波処理装置 (Branson Sonifier 250、Branson Ultrasonic Co.、米国コネチカット州ダンベリー、プローブ直径 6.5 mm、最大ピークツーピーク振幅 247 μm）、13 W で 5 分間。

異なる粒子濃度 (0.1、1、10、および 100 μg mL-1) を PBS 中の InViS 溶液 (0.4% v/v; InVis のストック濃度: 1.5 * 1013 粒子 mL-1) と 2 時間および 24 時間インキュベートしました。 。 インキュベーションは、室温、暗所で継続的に振盪しながら実施した。 懸濁液を4500×gで10分間遠心分離してNPを除去した。 上清の蛍光をHoriba FluoroMax Spectra蛍光計で測定しました。 抗ウイルス効果を定量化するために、蛍光を、PBS中のウイルス懸濁液（陰性対照）およびOEGで処理したウイルス懸濁液（1.25 mg mL-1; すべてのローダミンが放出されるはずの陽性対照）の蛍光と比較しました。 NP の自己蛍光または蛍光消光を除外するために、純粋な NP 懸濁液 (ウイルスを含まない) の蛍光、およびウイルスおよび界面活性剤とともにインキュベートした NP の蛍光も測定しました。

抗ウイルス溶液 [特許番号: PCT/EP2021/06058030] を使用して、抗ウイルスコーティングを作成しました。 まず、液体形態の抗ウイルス特性を、InViS 溶液 (0.4% v/v) との 5 分間のインキュベーションおよび蛍光測定によって特徴付けました。 コーティングされたフォームの特性を特徴付けるために、0.5 mL の量を使い捨てペトリ皿に均等に広げ、室温で 24 時間インキュベートしました。 非多孔質材料の抗ウイルス特性評価を対象とする ISO 規格 21,702 が、サンプル調製のガイドラインとして使用されました。 ウイルス接種材料 (各サンプルあたり 0.4 mL) は、PBS 中の 20% v/v InViS ストック溶液で構成されました。 PBS中のInViS（20％v/v）を含む接種材料、および空のペトリ皿中のPBS（20％v/v）およびOEG（62.5mg mL-1）中のInViSを含む接種材料を、それぞれ陰性および陽性対照として使用した。 。 不活性ポリマー（低密度ポリエチレン（LDPE））フィルム（40 mm × 40 mm）を使用して接種材料を覆った。 フィルムを優しく押し下げてサンドイッチ構造を形成し、不活性フィルムの端を越える漏れを防ぎながら、接種材料と抗ウイルスサンプルの間の接触表面積を最大化しました。 サンプルは室温の暗所で 24 時間保管されました。 ２０ｍＬのＰＢＳをペトリ皿に加え、皿を撹拌して、新たに加えたＰＢＳと残りの接種材料の均質化を確実にした。 混合後、2 mL の洗い流し液を収集し、透明なキュベットにピペットで移しました。 ウォッシュアウトの発光蛍光スペクトルは、Horiba FluoroMax Spectra蛍光計を使用して特性評価されました。 励起波長は560 nmに設定され、発光強度は580と650 nmの間で測定されました。 各サンプルについて、2 つの複製を分析しました。

フェイスマスク内の InViS と塩粒子の運命と局在を評価するために、図 8 に示す濾過効率の設定が使用されました。 ポンプシステムの使用により、最終エアロゾルの相対湿度を 30 に維持しながら、軽い身体運動時の人間の呼吸量を模倣して、8 L min-1 の一定の空気流が試験片を通して生成されました (EN13274-7 に基づく)。室温では –40%。 フェイスマスクの円形部分が小さな封じ込めチャンバー内のサンプルホルダーに取り付けられ、粒子分析装置 (Cambustion DMS500) を使用して、標本を通って拡散する粒子がリアルタイムで定量化されました。 InViS の超純水溶液 (1011 粒子 mL-1) または NaCl [2 g mL-1、エアロゾル濃度 4 ～ 12 mgm-3、中央粒子サイズ 60 ～ 100 nm] をエアロゾル発生器 (AGK) に供給しました。 2000パラ）。 ウイルスストック溶液は PBS 中のウイルスで構成されていたため、エアロゾル溶液には 1% v/v の PBS が含まれていました。 したがって、エアロゾル中には InViS だけでなく PBS 残留物も存在していました。

濾過効率ベンチの概略図。 ウイルスまたは NaCl 溶液をエアロゾル発生器に入れました。 ウイルスまたは塩の粒子を含む一定の空気流が、DIN 14683 に基づいて試験片を通して生成されました。粒子サイズ分布は粒子分析装置で測定されました。

濾過効率の実験後、マスク層を剥がして個別に分析し、InViS 粒子の位置を特定しました。 まず、内層と外層の走査型電子顕微鏡 (SEM) 画像により、マスク繊維上の粒子の存在を定性的に分析できました。 このために、Hitachi S-4800 (Hitachi High-Technologies、カナダ) SEM が使用されました。 イメージングの前に、マスク層を導電性両面カーボンテープで SEM スタブに取り付け、電子帯電効果を低減するために 7 nm の金/パラジウム (LEICA EM ACE600) でスパッタ コーティングしました。 SEM イメージングの設定は、加速電圧 2 kV、電流 10 μA でした。 次に、各層上のウイルスの量を蛍光測定によって評価しました。 このために、異なるマスク層を 8 mL の 70% エタノールに 2 時間入れました。 その後、溶液 2 mL を透明なキュベットにピペットで移し、Horiba FluoroMax Spectra蛍光計で蛍光測定を実施しました (励起波長 560 nm、発光スペクトル 580 ～ 650 nm)。

R は数値と統計計算に使用されました。 統計的差異はスチューデントの t 検定を使用して評価され、次の記号は対応する p 値を表します: *p < 0.05、$p < 0.01、£p < 0.001、および #p < 0.0001。

この研究を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者に提供されます。

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Empa、スイス連邦材料科学研究所、粒子生物学相互作用研究所、9014、ザンクトガレン、スイス

リー・A・フューラー、ピエトロ・クレメント、ティナ・ビュルキ＝トゥルンヘル、ピーター・ウィック

Empa、スイス連邦材料科学研究所、生体模倣膜および繊維研究所、9014、ザンクトガレン、スイス

ゴードン・ハーウィグ & ルネ・M・ロッシ

Mymetics BV、2333 CH、ライデン、オランダ

ファリアン・ボーラン & トゥーン・ステグマン

Mymetics SA, 1066, エパリンジュ, スイス

マリオ・アマッカー

ベルン大学病院呼吸器内科、ベルン大学、3012、ベルン、スイス

トゥーン・ステグマン

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LAF: 概念化、調査、検証、実験計画、執筆 - 原案、レビュー、編集。 PC: 概念化、検証、実験計画、執筆 - 原案、図、データ分析。 GH: 調査、検証、執筆 - レビューと編集。 RMR: リソースと資金の獲得、執筆 - レビューと編集。 FB: リソースと材料。 TS: リソース、概念化、執筆 - レビューと編集。 MA: リソース、概念化、執筆 - レビューと編集。 TB: 調査、概念化、検証、執筆 - レビューと編集、図。 PW: リソースと資金の獲得、概念化、検証、執筆 - レビューと編集。 著者全員がこの研究論文に貢献しました。

ピーター・ウィックへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Furer, LA、Clement, P.、Herwig, G. 他。 ウイルス崩壊を迅速かつ安価に評価するための新しい不活化ウイルス システム (InViS)。 Sci Rep 12、11583 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-15471-5

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受信日: 2022 年 4 月 25 日

受理日: 2022 年 6 月 24 日

公開日: 2022 年 7 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-15471-5

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