シトラコン酸塩は、ACOD1 (IRG1) 触媒作用を阻害し、インターフェロン反応と酸化ストレスを軽減し、炎症と細胞代謝を調節します。

Oct 22, 2023

Nature Metabolism volume 4、pages 534–546 (2022)この記事を引用

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メトリクスの詳細

イタコン酸の免疫調節特性と細胞保護特性は広く研究されていますが、その天然異性体であるメサコン酸とシトラコン酸が同様の特性を持っているかどうかは不明です。今回我々は、イタコン酸が細胞内で部分的にメサコン酸に変換され、マクロファージ活性化におけるメサコン酸の蓄積が事前のイタコン酸合成に依存することを示す。超生理学的濃度でヒト細胞に添加すると、3 つの異性体すべてが乳酸レベルを低下させますが、イタコン酸は最も強力なコハク酸デヒドロゲナーゼ (SDH) 阻害剤です。 A型インフルエンザウイルス（IAV）に感染した細胞では、3つの異性体すべてがアミノ酸代謝を大きく変化させ、サイトカイン/ケモカイン放出を調節し、インターフェロンシグナル伝達、酸化ストレス、ウイルス粒子の放出を減少させます。 3 つの異性体のうち、シトラコン酸は最も強力な求電子剤であり、核因子・赤血球 2 関連因子 2 (NRF2) アゴニストです。シトラコン酸のみが、おそらく基質結合部位への競合結合により、シス-アコニ酸デカルボキシラーゼ (ACOD1) によるイタコン酸の触媒作用を阻害します。これらの結果は、メサコン酸塩とシトラコン酸塩が免疫調節性、抗酸化性、抗ウイルス性化合物であり、シトラコン酸塩が最初の天然に存在する ACOD1 阻害剤であることを明らかにしています。

小さな不飽和ジカルボン酸であるイタコン酸、メサコン酸、およびシトラコン酸は、二重結合の位置のみが異なる天然に存在する異性体です (図 1)。イタコン酸は活性化マクロファージの重要な代謝産物であり、ミトコンドリア酵素 ACOD11,2 の生成物です。代謝と免疫の関連性として熱心に研究されており、免疫調節特性を持ち（参考文献3、4で概説）、さまざまな炎症性疾患や感染症のヒトの体液、細胞、組織、および齧歯動物モデルでも検出されています。ヒトの病気の研究 (参考文献 5 に要約)。真核生物におけるメサコン酸とシトラコン酸の起源と異化に関する情報は少ない。それらの高い構造類似性を考慮すると、例えば内因性イソメラーゼを介した 3 つの異性体間の相互変換が考えられます。単離された肝臓ミトコンドリアを使用したイタコン酸代謝に関する研究 6 に基づいて、Nemeth et al. は、メサコン酸がイタコニル-CoA7を介したイタコン酸異化の産物である可能性があることを示唆しました。高等生物におけるシトラコン酸の生合成機構を示唆する唯一の研究は、メチルマロン酸血症患者の代謝物プロファイリングに基づいており、シトラコン酸は分岐鎖アミノ酸 (BCAA) イソロイシンの異化産物であると仮定されています8。メサコン酸またはシトラコン酸のレベルの増加がヒトの代謝性疾患に関連している可能性があるという証拠が増えています（参考文献5に要約）。しかし、これらの濃度の増加が病態生理学的に関連しているのか、それとも単に代謝異常の付随現象を表しているだけなのかはまだ解明されていない。ヒトでは、メサコン酸塩またはシトラコン酸塩の組織分布に関する情報はありません。しかし、我々は最近、健康なマウスの臓器のスクリーニングで、メサコン酸がリンパ節で、シトラコン酸がリンパ節と脾臓で発生することを示し、免疫において何らかの機能を果たしている可能性を高めています5。

拡張データ図 1 に示すイタコン酸異性体取り込み実験において、選択した TCA 中間体と乳酸塩を 6 時間および 24 時間で HPLC-MS/MS によって測定しました。濃度は計算された細胞体積に基づいて表されています。 a、PCAは、6時間の時点では3つの異性体すべてによる強い変化が示されているが、24時間までにはメサコン酸塩およびシトラコン酸塩の効果が相対的に正規化されている。 b〜d、測定された異性体は各グラフの上に示され、追加された異性体はx軸の下に示されます。ｅ、異性体の添加６時間後の乳酸塩および選択されたＴＣＡ中間体の濃度（濃度はｙ軸上に示される）をｘ軸の下に示す。 3 つの異性体はすべて乳酸レベルを低下させますが (解糖系の阻害と一致)、コハク酸レベルを上昇させるのはイタコン酸のみであり、SDH の阻害が示唆されています。シトラ、シトラコン酸; イタ、イタコン酸。メサ、メサコン酸。 n = 3 生物学的複製、平均 ± SD 対応のない t 検定。 *P ≤ 0.05、**P ≤ 0.01、***P ≤ 0.001、****P ≤ 0.0001; NS、重要ではありません。

イタコン酸塩およびイタコン酸ジメチルおよびイタコン酸 4-オクチル (4-OI) などの化学修飾誘導体の免疫調節特性および細胞保護特性は、炎症性疾患や変性疾患 3,4 およびウイルス感染症 9,10 の治療介入を生み出すために熱心に研究されています。対照的に、外因的に適用されたメサコン酸またはシトラコン酸が細胞に取り込まれるかどうか、またそれらがイタコン酸と同様の免疫調節効果、抗酸化効果、または抗感染効果を発揮するかどうかは不明です。免疫代謝におけるイタコン酸の役割は十分に文書化されているだけでなく、ACOD1によるイタコン酸の異常合成が発がんに関与していると考えられています。腹膜マクロファージから放出されるイタコン酸は、腹腔内に広がった腫瘍の増殖因子として機能する可能性があり 11、ACOD1 の腫瘍形成促進の役割が神経膠腫でも報告されています 12,13。したがって、ACOD1阻害剤には抗腫瘍特性がある可能性がありますが、ACOD1活性を阻害する内因性分子が存在するかどうかは不明です。これらの未解決の疑問を考慮して、我々は、無細胞アッセイ、細胞モデル、IAV 感染モデル、およびリポ多糖 (LPS) 誘発炎症のマウスモデルを組み合わせて次のことを行いました。(1) 3 つの異性体間に相互変換があるかどうかをテストします。（２）細胞代謝、炎症、酸化ストレスおよびＩＡＶの感染力に対するメサコン酸およびシトラコン酸の影響を評価する。 (3) 3 つの異性体のいずれかが ACOD1 活性を阻害するかどうかをテストします。

メサコン酸とシトラコン酸の起源を探索するために、我々はまず、3 つの異性体間に自発的な相互変換があるかどうか、また ACOD1 がメサコン酸またはシトラコン酸の合成も触媒できるかどうかをテストしました。無細胞ACOD1酵素アッセイではメサコン酸またはシトラコン酸合成の証拠はなく2（補足図1b）、純粋な化合物をRPMI培地中で最大24時間インキュベートしても自発的相互変換はありませんでした（補足図1c〜e）。。ただし、生物学的に無関係な低汚染濃度の各異性体が、それぞれ他の異性体の純粋ストックで検出されました（補足図1g）。

コードスら。らは、外因的に添加されたイタコン酸塩 (25 mM) が、休止中のマウス RAW 264.7 細胞において 14 mM の細胞内濃度をもたらす可能性があることを示しました 14。異性体の無毒性濃度を決定した後（補足図1h）、分化したヒトマクロファージ様細胞（dTHP1）へのそれらの取り込みをテストしました。実際、3 つの異性体はすべて効率的に取り込まれ (拡張データ図 1a ～ f)、シトラコン酸またはイタコン酸の新規合成の証拠はありませんでした。しかし、イタコン酸塩を培地に添加すると、メサコン酸塩が細胞内に出現しました。細胞内イタコン酸に対するメサコン酸の濃度は1.7％から8.0％の範囲であり、細胞内イタコン酸濃度と逆相関していました（拡張データ図1d）。

注目すべきことに、細胞内で生成されたメサコン酸の分泌と一致して、イタコン酸の添加後24時間で少量のメサコン酸も上清中に出現しました（拡張データ図1g）。したがって、我々は、内因的に合成されたイタコン酸もメサコン酸の蓄積を引き起こすかどうかをテストしました。実際、dTHP1細胞のLPS/インターフェロン-γ（IFN-γ）刺激は、イタコン酸の後にピークとなるメサコン酸の蓄積を引き起こしました（拡張データ図2a〜d）が、ACOD1-/- dTHP1細胞で刺激されたACOD1-/- dTHP1細胞ではイタコン酸もメサコン酸も検出できませんでした。 LPS/IFN-γ。シトラコン酸塩はどちらの細胞タイプでも検出されませんでした。イタコン酸からメサコン酸への明らかな変換は、LPS誘発全身性炎症の72時間の時間経過中にマウスの脾臓でも検出されました（拡張データ図2e-h）。しかし、イタコン酸からメサコン酸への部分的な変換はわずか約 4% であり、これは dTHP1 細胞よりもはるかに低かったです。イタコン酸からメサコン酸への変換が生理学的にACOD1を発現していない細胞でも起こるかどうかをテストするために、ヒトACOD1（hACOD1）またはマウスACOD1（mACOD1;拡張データ）を構成的に発現するベクターで呼吸上皮細胞株A549をトランスフェクトしました。 l）。 dTHP1 細胞で観察された遅延とは対照的に、イタコン酸とメサコン酸は並行して増加し、イタコン酸に対してメサコン酸は 4% ～ 5% (hACOD1)、2.5% ～ 2.7% (mACOD1) に達しましたが、メサコン酸の絶対濃度は減少しました。 mACOD1を発現する細胞では、ヒト酵素よりもはるかに高いレベルのイタコン酸を生成する2（拡張データ図2j、k）。シトラコン酸は検出されなかった。イタコン酸塩は SDH を阻害し、それによってコハク酸塩レベルを上昇させる可能性があります 15。実際、コハク酸は、mACOD1を発現する細胞において顕著に蓄積した(拡張データ図2i)。 hACOD1 トランスフェクト細胞ではコハク酸のより小さな増加が観察されましたが、それはベースラインのコハク酸レベルよりも高いイタコン酸濃度の場合のみでした。まとめると、結果は拡張データ図に示されています。図１および２は、シトラコン酸がイタコン酸とは独立した起源を有するのに対し、メサコン酸は、少なくとも脾臓およびマクロファージにおいて生理学的に起こるが、厳密には細胞型依存性ではない、酵素媒介プロセスを介してイタコン酸に由来することを示唆している。

SDH の阻害に加えて、イタコン酸はグルコース代謝の中心を好気性解糖系からペントース - リン酸シャントに移行させることができます 16。したがって、我々は、乳酸塩、コハク酸塩、およびその他の選択されたトリカルボン酸 (TCA) サイクル中間体に対する 3 つの異性体の濃度を増加させた場合の添加の影響を評価しました。図 1a の主成分分析 (PCA) プロットに示されているように、異性体の効果は添加から 6 時間後に著しく異なり、イタコン酸塩で最大でした。注目すべきことに、24時間までに、イタコン酸による変化はさらに増加しましたが、メサコン酸およびシトラコン酸による変化は正常化し始めました（図1a）。 3つの異性体はすべて、6時間で乳酸濃度を顕著に減少させましたが（図1e）、その効果は24時間までに弱まりました（拡張データ図3a）。注目すべきことに、イタコン酸の添加後の両方の時点で、SDH阻害と一致してコハク酸の独特の用量依存的増加があったのに対し、メサコン酸またはシトラコン酸の添加後は、コハク酸レベルは24時間までにわずかに増加しただけであった。しかし、SDH阻害の尺度としてコハク酸/フマル酸比を使用すると、6時間の高用量のメサコン酸でも弱い阻害が明らかであり(拡張データ図3h)、非常に弱い阻害(イタコン酸による阻害の約2%)であった。 24時間のメサコン酸塩とシトラコン酸塩。イタコン酸の添加によるコハク酸のはるかに多くの蓄積は、IAV感染細胞を使用した2つの実験でも検証されました（拡張データ図3i、j）。

イタコン酸塩は活性部位 (SDHA) の SH 基を共有結合的にアルキル化することで SDH を阻害すると主張されています 17。ただし、グルタチオンによるマイケル付加物の形成（拡張データ図4a〜c）は、実際にはシトラコン酸（SDHを阻害しない）を使用した場合に最も効率的であり、イタコン酸およびメサコン酸と比較して、それぞれ8倍および48倍高かった（補足図4）。 . 2a ～ d および補足表 1)。実際、最低空分子軌道と求電子性指数 (ω)18 の計算により、シトラコン酸が最も強い求電子剤として、メサコン酸が最も弱い求電子剤として特定されました (拡張データ図 4d および補足表 1)。

化合物の求電子性 (SH アルキル化能力) と SDH 阻害活性の間の矛盾を考慮して、構造モデリングを使用して代替結合モードをテストしました。実際、ヒトとブタの両方のSDHAにおいて、主要な阻害様式としての最も近いシステイン残基への共有結合は、イタコン酸塩ではあり得ないと考えられていた（補足図2e、f）。イタコン酸塩とコハク酸塩およびオキサロ酢酸などの基質様阻害剤との構造的類似性を考慮すると、イタコン酸塩は競合機構を介してコハク酸塩結合部位を標的とする可能性がある。ヒトおよびブタのSDHAの活性部位への3つの異性体のドッキングにより、イタコン酸塩は、オキサロ酢酸塩と同様の好ましい結合エネルギーによる静電相互作用を介してコハク酸結合部位に結合すると予測されることが明らかになった（拡張データ図4e、fおよび補足図2h）。）。メサコン酸塩とシトラコン酸塩は、拡張された共役によってもたらされる剛性と平面性により、ほとんど接触を示しません。注目すべきことに、メサコン酸塩はコハク酸酸化生成物であるフマル酸塩の類似体であり、SDHAとの相互作用に関与する可能性が考えられます（拡張データ図4g、hおよび補足図2i）。一方、シトラコン酸塩のシス配置は好ましくないと思われます。バインディング用（補足図2j）。ウシミトコンドリア（その活性部位はヒトSDHで100％保存されている）を用いたin vitro SDH活性アッセイでは、イタコン酸による強いSDH阻害が確認され、シトラコン酸による本質的に阻害は確認されなかったが、メサコン酸による中程度の阻害が明らかになった（拡張データ図4i）。）。最近の生化学的証拠 19 と一致して、これらの結果は、イタコン酸塩が活性中心との直接の非共有結合相互作用を介して SDHA を阻害することを示唆しています。私たちの細胞ベースの実験におけるメサコン酸塩によるSDH阻害の程度が低いのは、細胞質へのミトコンドリアへの侵入が低いため、またはその阻害の強さが定常状態条件下で顕著な差を引き起こすには不十分であるためである可能性があります。

イタコン酸誘導体は、抗ウイルス化合物およびウイルス感染における宿主反応を改変する補助治療法として研究されています9,10。したがって、我々は、dTHP1 細胞と A549 細胞を IAV で感染させ、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド (MTT) アッセイで測定されるように、毒性のない濃度の 3 つの異性体で処理しました (補足図1h）。分析は、感染に対する細胞内反応が最大になった時点、つまり感染後 12 時間後 (pi) (dTHP1) および感染後 24 時間 (A549) に実施しました 20。初代ヒトマクロファージと同様に、dTHP1 細胞は、ウイルス RNA 複製と強力な細胞内応答を特徴とする非生産性 IAV 感染をサポートしますが、子孫ビリオンの放出はサポートしません。この細胞タイプでは、処理はウイルスの赤血球凝集素（HA）メッセンジャーRNA（mRNA）合成の顕著な減少にはつながりませんでした（拡張データ図5a）。対照的に、A549 細胞は、新しいビリオンの放出による生産的感染をサポートします。予想通り、感染後 24 時間では、培養上清中の HA mRNA の細胞レベルが高く、IAV 力価も高かった。異性体の添加はHA mRNAレベルに影響を与えませんでしたが、驚くべきことに、3つすべての上清中のウイルス力価が大幅に減少しました（イタコン酸、30倍、メサコン酸、36倍、シトラコン酸、53倍）（拡張データ図5b、c））。したがって、3 つの異性体はすべて、おそらく転写後のプロセスを妨害することによって、新しいウイルス粒子の生成または放出を明らかに妨害する抗 IAV 特性を持っています。

それらの抗ウイルス効果の代謝相関を探索し、細胞代謝に対する 3 つの異性体の共通かつ固有の効果についてより広い視野を得るために、この IAV 感染モデルをアミノ酸および関連代謝産物の標的分析に採用しました。アミノ酸代謝に対する IAV の影響は dTHP1 細胞では弱かったが、3 つの異性体すべてが感染細胞のアミノ酸代謝に顕著な変化をもたらし、これは 4-OI (比較のために適用した) による変化とは異なり、また、異性体間で異なります（拡張データ図5d）。 A549細胞では、感染の影響ははるかに強かったが、異性体はアミノ酸関連代謝産物集団にさらなる変化をもたらした（拡張データ図5e）。 A549細胞におけるアミノ酸代謝に対する感染のより大きな影響は、THP1細胞では1つの分析物（Cys）のみが有意に変化したのに対し、21の分析物が差次的に豊富であった（そのうち17つが減少）という点で明らかでした（拡張データ図5f）。同様に、感染によりA549細胞では12の代謝産物指標の値が変化しましたが、dTHP1細胞では2つのみでした（拡張データ図5g）。 IAVに感染したdTHP1細胞を異性体で処理すると、24個の分析物が大きく変化し、そのうち19個が減少しました（補足図3a、b）。一部の効果は 1 つの異性体に固有に関連付けられていましたが、他の効果は 2 つまたは 3 つすべてに共有されました。たとえば、3 つの異性体すべてが予測プロリルヒドロキシラーゼ活性 (低酸素誘導性因子 1α [HIF-1α] の不安定化に重要な酵素活性) を増加させましたが、イタコン酸塩とシトラコン酸塩がプロリンおよびトランス-4-ヒドロキシプロリンのレベルに最も大きな影響を及ぼしました (補足図) .4j–l）。メサコネートは最も多くの重大な変化に影響を与えました。特に、アミノ酸レベルが広範囲に減少し、これはすべてのアミノ酸サブクラスで明らかでした（補足図3cおよび4b、c）。 A549 細胞では、おそらく感染の影響がより強かったため、処理により重大な変化はほとんど起こりませんでした（補足図 3e-h）。これは、Arg、His、Lys、および Trp という 4 つのアミノ酸によって例示されます。これらのアミノ酸は、インフルエンザウイルスの複製に重要であり、通常、増殖性インフルエンザウイルス感染では減少します 21。これらはすべて、感染したA549細胞では大幅に減少しましたが、（dTHP1細胞とは対照的に）処理は顕著なさらなる減少にはつながりませんでした（補足図4d–g）。それにもかかわらず、A549 細胞では、異性体の異なる共通の効果が明らかでした。たとえば、3 つの異性体すべてがキヌレニン (Kyn) のレベルを増加させ、Trp から Kyn への変換と、Trp-Kyn-NAD+ 経路の最終産物としての NAD+ の生成に関与する潜在的な免疫抑制酵素である IDO1 の活性を予測しました (補足)図4h、i）、一方、イタコン酸はThr、Ala、Ser、Aspおよび非対称ジメチルアルギニンレベルを優先的に増加させました（補足図4m–q）。ポリアミンは、ウイルスと宿主の相互作用において、主に転写後の複数のステップで重要な役割を果たします22。測定された 3 つのポリアミンはスペルミジン/スペルミン N1 アセチルトランスフェラーゼ経路の中間体であり、それらの枯渇により RNA ウイルスの複製が阻害される可能性があります 23。実際、3つの異性体すべてが感染したA549細胞のポリアミンレベルを低下させる傾向がありましたが、 P < 0.05での有意性は前駆体オルニチンの場合にのみ達成されました（補足図4t-y）。総合すると、これらの結果は、イタコン酸異性体の超生理学的濃度（薬理学的適用を模倣）が、IAV感染細胞のアミノ酸代謝に重大な影響を及ぼし、異性体、細胞型、感染の種類（増殖性対非増殖性）によって大きく異なる可能性があることを実証しています。生産的）、ポリアミン経路などの抗ウイルスネットワークに機能的に関連している可能性があります。

シトラコン酸塩が 3 つの異性体の中で最も強い求電子剤であることを考慮して、KEAP1-NRF2 シグナル伝達経路を活性化する異性体の能力を比較しました 24。シトラコン酸は、HaCaT ケラチノサイトの NRF2 に対して最も強力な安定化効果を発揮し、アルドケト還元酵素ファミリー 1 メンバー B10 (AKR1B10、NRF2 によって誘導される下流因子) をコードする mRNA を最も強く誘導しました (図 2a-c)。 NRF2-/- HaCaT 細胞では、AKR1B10 mRNA 発現はベースラインで低く、シトラコン酸濃度が高い場合にのみ有意な誘導があり、野生型細胞よりも変化倍数が低かった（図 2d）。 NRF2 によって調節される可能性のある 14 個の遺伝子 25 をアッセイした場合、シトラコン酸塩は野生型細胞において全体的に最も強い誘導をもたらしましたが、ベースラインおよび刺激後のほとんどの標的の発現は NRF2 –/– 細胞では低かった（拡張データ図 6a、b）。。野生型HaCaT細胞のIFN-γ刺激はSLC7A11 mRNAの顕著なダウンレギュレーションを引き起こし、野生型ではシトラコン酸によって回復されましたが、NRF2-/-細胞では回復されませんでした（図2e）。同様に、IAV感染dTPH1細胞では、シトラコン酸の適用によりSLC7A11、GCLMおよびME1 mRNAの発現が増加しましたが、メサコン酸は効果がありませんでした（拡張データ図6c〜e）。これらの誘導効果は控えめであり、中程度の求電子試薬としての異性体の分類と一致しました (補足表 1)。イタコネートは活性酸素種 (ROS) レベルを減らすことができます14。 IAV感染dTHP1細胞における3つの異性体の抗ROS活性を比較しました。感染によりミトコンドリアROS陽性細胞の数が大幅に増加しましたが、これはイタコン酸とシトラコン酸によって大幅に逆転しましたが、メサコン酸によるROSの減少はわずかに有意でした（図2f）。

a-d、シトラコン酸塩は最も強力な NRF2 アゴニストです。 a、b、野生型細胞におけるNRF2タンパク質の安定化。 2 つの独立した実験のウェスタンブロット (刺激から 3 時間後) (a)、および NRF2 に対応する 110 ～ 120 kDa のバンドの濃度測定測定を組み合わせたもの (b) (n = 2)。 c、d、刺激から16時間後の野生型およびNRF2-/-細胞におけるNRF2誘導性AKR1B10 mRNAの発現。細胞をイタコン酸異性体で6時間前処理するか、または未処理のままにしてから、異性体の存在下または非存在下でIFN-γ（300 U ml-1）で10時間刺激しました（n = 6、平均±sd）。 e、シトラコン酸は、野生型細胞における IFN-γ による SLC7A11 mRNA 抑制を救済しますが、NRF2-/- HaCaT 細胞では救済しません（RT-qPCR）。 f、シトラコン酸塩はイタコン酸塩と同様の抗酸化作用を発揮します。 dTHP1 細胞を IAV に感染させ、感染後 12 時間後に ROS を測定しました (イタコン酸異性体 = 25 mM、4-OI = 125 μM)。 g-n、異性体と 4-OI の共通かつ異なる免疫調節効果。 dTHP1 細胞を、イタコン酸、メサコン酸、シトラコン酸 (さまざまな濃度) または 4-OI (125 μM) の非存在下または存在下で IAV に感染させ、炎症関連分子を 12 時間後に測定しました。細胞ペレットと上清中のCXCL10タンパク質。 i、細胞培養上清中の炎症関連ポリペプチドに対する異なる効果 (27 プレックスアッセイ; g、h とは別の実験; 異性体濃度 = 20 mM、4-OI = 125 μM。) 品質に合格した 25 のターゲットの濃度に基づく PCA評価。 c–i、n = 3 生物学的複製、平均 ± sd j,k、イタコン酸異性体は STAT1 リン酸化を減少させます。 A549 細胞および dTHP1 細胞 (2 つのレプリカのうちの 1 つの代表的なブロット) をイタコン酸異性体 (25 mM) または 4-OI で前処理し、IAV で 2 時間感染させ、10 時間 (dTHP1) および 22 時間 (A549) 処理しました (抗 P -STAT1免疫ブロット)。 1-n、シトラコン酸はヒト肺組織における IAV 誘発 IFN 応答を軽減します。肺外植片を、示された濃度（mM）のイタコン酸塩、シトラコン酸塩および4-OIの存在下または非存在下でIAV（2×105 FFU ml-1）に感染させた。標的 mRNA の発現を感染後 24 時間で測定しました (5 つの外植片、外植片あたり 3 片、合計 n = 15、中央値、四分位範囲)。 Citra、シトラコン酸; イタ、イタコン酸。メサ、メサコン酸。 *P ≤ 0.05、**P ≤ 0.01、***P ≤ 0.001、****P ≤ 0.0001; l-n (ボンフェローニ補正を伴う両側マン-ホイットニー U 検定) を除く、ダネットの多重比較検定を使用した一元配置分散分析。

ソースデータ

イタコン酸には強力な免疫調節特性がある 3,4 ため、メサコン酸とシトラコン酸も炎症反応を修飾するかどうかをテストしました。 IAV感染dTHP1細胞では、3つの異性体すべてがCXCモチーフケモカインリガンド10（CXCL10）をコードするmRNAを減少させましたが、細胞上清中のCXCL10タンパク質の減少はイタコン酸およびシトラコン酸により大きかった（図2g、h）。イタコン酸塩とシトラコン酸塩はインターロイキン 6 (IL-6) mRNA を減少させましたが、どれも IL-1β 転写に影響を与えず、メサコン酸塩とシトラコン酸塩のみが腫瘍壊死因子 α (TNFα) mRNA を減少させました (拡張データ図 6f–h)。独立した実験では、IAV感染により上清中のサイトカイン/ケモカイン集団の実質的な再プログラミングが引き起こされ、これは4-OIの添加によって強く調節されましたが、3つの異性体によってはあまり調節されませんでした（図2i）。それにもかかわらず、3 つの異性体の共通かつ固有の効果が見られました (拡張データ図 6i ～ q)。繰り返しになりますが、CXCL10タンパク質レベルを有意に低下させたのはイタコン酸塩とシトラコン酸塩だけでした。 3 つの異性体すべてが IL-1β およびマクロファージ炎症性タンパク質 1β (CCL4) 濃度を減少させたのに対し、メサコン酸塩のみが IL-2 および腫瘍壊死因子 α を減少させました。注目すべきことに、3 つの異性体すべてがケモカイン CCL5 (RANTES) の濃度を増加させたのに対し、IL-8 濃度を顕著に増加させたのはイタコン酸塩とシトラコン酸塩だけでした。この分析により、(1) 4-OI は、感染した dTHP1 細胞からのサイトカイン/ケモカイン放出に対して最も強い「正常化」効果を発揮したことが明らかになりました。（２）外因的に適用されるメサコン酸塩およびシトラコン酸塩は、共通かつ独特の免疫調節特性を有する（その一部はイタコン酸塩と共有される）。 (3) 潜在的な機能的影響は、追加の炎症細胞の動員の違いに部分的に関係している可能性があります。観察されたCXCL10 mRNAおよびタンパク質レベルの減少が標準的なI型IFNシグナル伝達の減少によるものであるかどうかをテストするために、dTHP1およびA549細胞におけるシグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子1（STAT1）のリン酸化に対する異性体の影響を評価しました。 IAV感染は、非リン酸化およびリン酸化STAT1のレベルを大幅に増加させ、3つの異性体すべてがリン酸化STAT1のレベルを減少させましたが、非リン酸化STAT1のレベルは減少させませんでした（図2j、k）。メサコン酸塩は dTHP1 細胞に対して若干弱い効果を示しましたが、4-OI は両方の細胞型において最も強力でした。シトラコン酸塩の抗 IFN 潜在能力は、ex vivo で培養したヒト肺組織でも検証されました。 IAV 感染により、ウイルス HA、IFIT1、および CXCL10 mRNA が予想どおり増加しました。ウイルスの HA RNA レベルには有意な減少はありませんでしたが、シトラコン酸塩は IFIT1 と CXCL10 の両方の発現を有意に減少させました (図 2l-n)。

cis-アコニテートに類似したいくつかの化合物のうち、ACOD1阻害剤であることが証明されたのはシトラコン酸のみでした。注目すべきことに、アスペルギルス ACOD1 の活性には影響しませんでしたが、10 mM シトラコン酸はヒトおよびマウスの ACOD1 活性を約 90% 減少させました (図 3a-c および拡張データ図 7a、b)。シトラコン酸塩による ACOD1 阻害は、ACOD1 発現 A549 細胞でも確認されました。実際、シトラコン酸の存在下では、用量依存的にイタコン酸の蓄積が減少しました（図3d）。 mRNAレベルは影響を受けなかったため、これはACOD1の発現減少によるものではありませんでした（図3e）。 ACOD1活性の最大半分の阻害（IC50）をもたらした培地中のシトラコン酸の濃度は、50μMであることが判明した（補足図5d、e）。 3 つのイタコン酸異性体のファーマコフォアフィンガープリントを cis-アコニテートのファーマコフォアフィンガープリントと比較すると、シトラコン酸が最も高いタニモト係数、つまり cis-アコニテートとの類似性が最も高いことが示されました (拡張データ図 7c)。これは、ACOD1の活性部位に結合し、基質類似体として機能することを示唆しました。実際、構造モデリングは、それがシス-アコニテートと同様のモードでヒトACOD12およびマウスホモログ2の活性部位に有利に結合することを予測しました（図3f〜hおよび拡張データ図7d、e）。一方、非平面状イタコン酸はまた、トランス異性体のメサコン酸塩は結合エネルギーが低く、あまり最適に適合しません（拡張データ図 7f）。

a〜c、無細胞アッセイ。組換え hACOD1 を基質 (cis-アコニテート) および阻害剤 (シトラコン酸) の濃度を増加させながらインキュベートし、イタコン酸の蓄積を HPLC で測定しました。 n = 3 の独立したアッセイ、平均 ± sd 線は、競合阻害剤を使用した場合のミカエリス・メンテン方程式に適合する曲線を表します。 b、aに示すデータのラインウィーバー・バークプロット（平均値±標準偏差）。ｃ、ａ（ｈＡＣＯＤ１）および拡張データ図７ａ、ｂに示されるデータ（ｍＡＣＯＤ１）に基づく酵素および阻害動態の概要。 d、e、細胞ベースのアッセイ。 A549細胞にhACOD1を過剰発現するプラスミドをトランスフェクトし、シトラコン酸濃度を増加させながらインキュベートしました。細胞内のシトラコン酸およびイタコン酸濃度は、HPLC-MS/MS によって測定されました。シトラコン酸を添加すると、用量依存的にイタコン酸の蓄積が減少します(d)が、これはhACOD1転写の減少によるものではありません(e)。 n = 3の生物学的複製（d）、n = 6の生物学的複製（e）、平均±sd f-g、hACOD1の活性部位におけるシトラコン酸塩（黄色）の推定結合モード（PDB ID：6R6U）2。 f、シトラコン酸塩のC1-およびC4-カルボキシル基は、静電引力のネットワークを通じて活性部位に最適に固定されています。つまり、残基 His159、Lys207、Lys272、および Leu278 との水素結合および塩橋 (破線) です。活性部位の静電タンパク質表面: ポジティブ (青)、ネガティブ (赤)、中性 (白)。 g、二次元リガンド相互作用。 h. cis-アコニテート（マゼンタ）と比較したイタコン酸（黄色）の分子モデリングは、主にその非平面的で柔軟な構造により、イタコン酸の2つのカルボキシル基とhACOD1活性部位の塩基性残基の間の相互作用が少ないことを明らかにしています。 CI、信頼区間。シトラ、シトラコン酸塩。

マクロファージ活性化の古典的なモデルにおける ACOD1 阻害の効果の細胞動態を研究するために、2 つの異なる濃度のシトラコン酸塩の存在下で dTHP1 細胞の LPS/IFN-γ 活性化の 36 時間の経時的実験を実施しました。 TCA中間体、イタコン酸塩とメサコン酸塩の合成。 PCAは、未刺激の細胞に対するシトラコン酸による6時間の前処理の比較的穏やかな効果を示しましたが、LPS / IFN-γ刺激中に進行性のTCA再プログラミングを示しました（図4a）。注目すべきことに、シトラコン酸塩処理は、LPS/IFN-γによって引き起こされる変化を逆転させる傾向があり、これは主に（ただしそれだけではない）イタコン酸塩およびメサコン酸塩の蓄積の防止によるものでした。具体的には、未処理の刺激細胞では、イタコン酸は急速に蓄積し、12時間でピークに達しましたが、1 mM シトラコン酸は本質的にイタコン酸を防止し、メサコン酸の蓄積を大幅に減少させました（図4b、c）。シトラコン酸塩の阻害効果は 36 時間持続し、これは時間経過全体を通じて細胞内シトラコン酸塩の安定したレベルと一致しました（図 4d）。予想外なことに、イタコン酸合成の欠如は、初期の時点でのシス-アコニ酸レベルの増加を伴わなかった。これは、その前駆体であるクエン酸の利用可能性の低下による可能性がある（図4g、i）。どちらのシトラコン酸濃度でも乳酸レベルが減少しました。特に、0.1 mM 濃度ではコハク酸レベルおよびコハク酸/フマル酸比が適度に減少し、内因性イタコン酸による SDH 阻害の緩和による SDH 活性の適度な増加が示唆されました。 ACOD1触媒作用に対する細胞内シトラコン酸の測定されたIC50値（補足図5a〜c）は、無細胞アッセイで測定された値（図3c）とよく一致しました。

dTHP1細胞を、0.1、1、5、10および25mMシトラコン酸塩の非存在下または存在下で、LPS（200ng ml-1）およびIFN-γ（400U ml-1）で示された時間刺激した。 6時間処理した未刺激のdTHP1細胞を追加の対照として使用した。イタコン酸異性体、乳酸、および図 1 と同じ TCA 中間体を LC-MS/MS で測定しました。培地中の濃度 0.1 および 1 mM のシトラコン酸は、生理学的に妥当な細胞内シトラコン酸濃度で強力な ACOD1 阻害をもたらしたため、a ～ l に示す分析に使用されました。 5 ～ 25 mM の濃度で得られたデータをさらに使用して、IC50 値を計算しました。 a、シトラコン酸塩を除くすべての分析物に基づく PCA。 b – e、イタコン酸（b）、メサコン酸（c）、シトラコン酸（d）濃度およびコハク酸/フマル酸比（e）の時間経過。 f-l、乳酸塩と選択された TCA 中間体の濃度。そうですね、シトラコン酸塩による ACOD1 阻害は、LPS-IFN-γ によって活性化される dTHP1 細胞の炎症には強い効果がありません。実験設定は a ～ l と同じ。示された mRNA のレベルは、刺激の 12 時間後に RT-qPCR によって測定されました。 m、CXCL10 mRNA。 n、IL-6 mRNA。 o、IL-1β mRNA。 Citra、シトラコン酸; イタ、イタコン酸。 b–o、n = 3 生物学的反復、平均 ± SD *P ≤ 0.05、**P ≤ 0.01、***P ≤ 0.001、****P ≤ 0.0001。ダネットの多重比較検定を使用した一元配置分散分析。

ACOD1阻害が免疫調節効果よりも大幅に低いシトラコン酸濃度（0.03～1 mM対10～25 mM）に起因することを考慮して、次に、より低い濃度で炎症関連の表現型が生じるかどうかをテストしました。これはおそらく薬理学的無効によるものと考えられます。内因性イタコン酸合成の研究。この目的を達成するために、LPS/IFN-γ で dTHP1 細胞を活性化しました。これにより、最大の活性化と、IAV などのウイルスによる感染よりもはるかに高い ACOD1 発現が得られます。 LPS/IFN-γ刺激はIL-1β、IL-6、およびCXCL10 mRNAの活発な上方制御をもたらしましたが、1 mM シトラコン酸または1 mM イタコン酸（ACOD1を阻害しない対照として使用）による処理はCXCL10およびILに影響を与えませんでした。 -1β mRNA が注目すべき程度に増加しました。対照的に、濃度 25 mM のどちらの異性体でも IL-6 mRNA レベルが減少しました（図 4m-o）。したがって、低用量のシトラコン酸塩による内因性イタコン酸合成の薬理学的阻害は、最大限に活性化されたdTHP1細胞の炎症表現型に大きな影響を与えなかったが、IL-6 mRNAの減少はより高い（免疫調節）濃度で観察された。次に、別の実験で、2 つの異性体の低濃度/高濃度がミトコンドリア呼吸に影響を与えるかどうかをテストしました。 25 mM のイタコン酸塩は、シトラコン酸塩ではなく、未刺激の dTHP1 細胞または LPS/IFN-γ で刺激された dTHP1 細胞の最大呼吸量と予備容量を減少させました (拡張データ図 8)。これは、これは、シトラコン酸塩が SDH を阻害しないという我々の観察とよく一致しました (拡張データ図 4)。 LPS/IFN-γ刺激は基礎呼吸量、最大呼吸量、予備呼吸量を減少させ、1 mM シトラコン酸塩は最大呼吸量と予備呼吸量を正常化する傾向があったのに対し、25 mM シトラコン酸塩は予備呼吸量のみを正常化する傾向があった。低用量のシトラコン酸塩の効果は、ACOD1 阻害により内因性イタコン酸塩の蓄積が減少し、その結果、イタコン酸塩による SDH 阻害が緩和されて電子束が増加するというモデルで説明できます。

まとめると、我々の結果は、メサコン酸とシトラコン酸が、代謝、炎症、ウイルス感染に対して生物学的に関連する独特で共通の効果を発揮する、これまで過小評価されていたイタコン酸の近縁種であることを明らかにした。グラフの要約および拡張データ表 1 は、3 つの異性体の主な特徴を要約および比較しています。観察された効果の違いは、おそらく静電相互作用、立体特性、および求電子性の違いによるものであり、これらは潜在的にパートナーとなるマイケル供与体の求核性の影響を受ける可能性があります。 ACOD1 (シトラコン酸) または SDH (イタコン酸) の阻害における 3 つの異性体間の顕著な差異は、静電的および立体的差異の影響を例示しており、シトラコン酸の NRF2 誘導能力がより優れているのは、おそらくそのより強い求電子性によるものと考えられます。後者は、A549 細胞からの IAV 産生に対するその効果がより大きいことも説明できるかもしれない。なぜなら、イタコン酸骨格に基づく化合物によるエクスプチン 1 経路を介した阻害は、重要な Cys 残基の SH アルキル化によるウイルスのリボ核タンパク質の細胞質への輸送を阻害することが示されているからである9 。したがって、シトラコン酸塩は、この残基をアルキル化する能力がより優れているため、A549 細胞における IAV 複製の最も強力な減少に影響を与える可能性があります。イタコン酸塩はSDH26を阻害することによって抗ウイルス効果を発揮すると提案されているが、シトラコン酸塩（SDHを阻害しない）がIAV複製を最も効率的に阻害したため、SDH阻害が3つの異性体の抗インフルエンザ効果に役割を果たす可能性は低いと考えられる。。

我々はシトラコン酸を最初の内因性ACOD1阻害剤として同定したが、生物レベルでの生理学的影響は不明のままである。我々は以前、健康なマウスではリンパ節で最も高いシトラコン酸レベルが存在することを発見しました5。シトラコン酸を保持する細胞の種類は依然として不明ですが、ACOD1 を阻害することによってリンパ節の免疫プロセスを調節する可能性があると推測したくなります。骨髄細胞でシトラコン酸が発生するという証拠はないため、このような ACOD1 阻害はおそらくパラクリン方式で発生する必要があるでしょう。内因性NRF2アゴニストとしてのその役割も、特にin vivoでシトラコン酸を保有する細胞タイプが不明であるため、さらなる調査が必要である。シトラコン酸塩が活性化された dTHP1 細胞では検出されなかったことを考慮すると、シトラコン酸塩がマクロファージの NRF2 シグナル伝達においてイタコン酸塩よりも顕著な役割を果たす可能性は低いと考えられます。私たちの結果は、メサコン酸塩がイタコン酸塩に由来するという以前に定式化されたモデルを実証しています6,7 (He et al. による添付論文も参照 27) が、ヒトにおけるシトラコン酸塩の生理学的起源については推測することしかできません。我々は、それがイタコン酸塩またはメサコン酸塩に由来しないことを示します。メチルマロン酸尿症患者の研究に基づいて、メチルマロン酸尿はチグリル-CoA8 を介した BCAA イソロイシンの誘導体であることが提案されています。 BCAA代謝はエネルギーと免疫恒常性の重要な要素であるため、シトラコン酸塩はBCAA代謝を制御する制御ネットワークの一部を構成している可能性があります。全体として、シトラコン酸はトランスレーショナル医薬品開発の可能性がより高い異性体であると考えられます。抗炎症、抗酸化、抗ウイルス特性などの多面的な特徴により、炎症、ウイルス感染、またはその両方によって引き起こされる疾患を治療するために薬理学的に最適化された薬剤の開発にとって特に魅力的なバックボーンとなっています。シトラコン酸塩による ACOD1 阻害の薬理学的関連性は、生体内でまだ研究されていません。低用量（1 mM）シトラコン酸塩を用いた我々の研究は、少なくともCXCL10、IL-6、およびIL-1β mRNAに関しては、内因性イタコン酸塩合成の抑制がヒトマクロファージの最大活性化に強い影響を及ぼさない可能性があることを示唆しています。内因性イタコン酸の役割に関するほとんどの研究はマウスで行われており、ACOD1-/- マウスの骨髄由来マクロファージの高炎症性表現型と低炎症性表現型の両方が報告されています 28,29。さらに、マウスの ACOD1 はヒトの酵素よりもはるかに活性が高く、その結果、ヒトと比較して活性化マクロファージのイタコン酸レベルが 5 ～ 10 倍高くなります 1,2。したがって、ヒトでは炎症の調節においてACOD1がマウスほど顕著ではない役割を果たしている可能性がある。さらに、ACOD1阻害の影響は生物レベルでのみ完全に現れる可能性があり、細胞モデルでは明らかではない可能性があります。実際、我々は最近、IAV に感染した骨髄由来マクロファージにおける CXCL10 の発現は野生型マウスと ACOD1-/- マウスの間で差がなかったのに対し、組織学的に評価された肺炎症は ACOD1-/- マウスの方が有意に高かったことを発見しました10。炎症とは対照的に、低用量のシトラコン酸塩は TCA サイクル中間体に顕著な効果をもたらし、LPS/IFN-γ で刺激された dTHP1 細胞のミトコンドリア呼吸を改善する傾向がありました。興味深いことに、イタコン酸の蓄積は、例えば敗血症で見られるように、免疫麻痺と相関することが示されています 30。したがって、シトラコン酸誘導体は、末期敗血症または自然免疫の枯渇を特徴とするその他のシナリオの患者の治療に有益であることが証明される可能性がある。さらに、ACOD1 の腫瘍形成促進効果を考慮すると、シトラコン酸塩は癌治療用の ACOD1 阻害剤開発の足場として有用であることが判明する可能性があります。

メサコン酸塩に関する我々の結果は、He et al.27 による添付の論文で報告された結果を補完します。著者らは、安定同位体を利用した代謝フラックス分析を用いて、メサコン酸塩が実際にイタコン酸塩の異化産物であることを実証している。彼らは、主にNrf2非依存性であると思われるマウスマクロファージにおけるメサコン酸の免疫調節効果を報告し、LPS誘発敗血症のマウスモデルにおけるメサコン酸の有益な効果を示しています。さらに、彼らはイタコン酸塩がメサコン酸塩よりもはるかに強力な SDH 阻害剤であることを示しています。ただし、細胞全体を分析すると、メサコン酸による SDH 阻害がある程度見られるという点で、彼らの結果は私たちの結果とは異なります。 He らによる観察の違いは次のとおりです。また、私たちが判断したのは、使用した種やアッセイの違いによるものである可能性があります。それにもかかわらず、両方の論文の結果を総合すると、メサコン酸による SDH 阻害が強い生物学的影響を与える可能性は低いことが示唆されます。

hACOD1 (アミノ酸 4 ～ 461) および mACOD1 (アミノ酸 4 ～ 462) は大腸菌で生成され、前述のとおり 2 に精製され、GF 緩衝液 (10 mM HEPES、pH 7.4、10% v/v グリセロール、150 mM NaCl) に保存されました。）。アッセイは三連で実施した。 46.6 μl の GF 緩衝液中の酵素（30 μg mACOD1 または 90 μg hACOD1）、または酵素を含まない 46.6 μl の GF 緩衝液を 3.3 μl の 15 または 150 mM シス-アコニテート（pH 6.5）と混合し、最終シス-アコニテート濃度は1または10mM。アッセイ (50 μL) を 37 °C で 2 時間インキュベートし、氷上に置きました。有機酸を抽出するために、800 μl の抽出溶媒 (アセトニトリル/メタノール 1:1) を反応液に加え、得られた量を新しいチューブに移しました。空になった反応チューブを水 (150 μl) ですすぎ、続いて抽出溶媒中の活性アッセイを含むチューブに加え、最終容量 1000 μl になりました。サンプルは 30 秒間混合され、-80 °C で保存されました。

一連のカルボン酸 (ピルビン酸、コハク酸、クエン酸、シトラコン酸、(2E)-2-エチルブト-2-エン二酸 (EN300-234639、エナミン)、dl-イソクエン酸、トランス-アコニット酸) がスクリーニングされました。潜在的な阻害剤として。酸を水に溶解し、中和した。酵素アッセイは、2 mM cis-アコニテートおよび 10 mM の潜在的阻害剤を含むリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4 中で実施されました。基質の約半分を脱炭酸する酵素の量を 150 μl アッセイあたりに使用しました (20 μg の Aspergillus ACOD1、アミノ酸 12 ～ 490、24 μg の hACOD1、および 5 μg の mACOD1)。イタコネートは、以下に説明するように、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を使用して定量しました。

ヒト、マウス、およびアスペルギルス ACOD1 を前述のように調製し 2、GF 緩衝液 (10 mM HEPES、pH 7.4、10% v/v グリセロール、150 mM NaCl) 中に保存しました。阻害剤 (シトラコン酸; Acros) と基質 (cis-アコニット酸; Sigma-Aldrich) の溶液 (どちらも pH 6.5 (NaOH)) は、-20 °C で保存されました。アッセイのために、125μlの0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5を、5μlの酵素、10μlのシトラコン酸塩（または10μlの水）および10μlのシス-アコニ酸塩と氷上で混合した。阻害剤の最終濃度は 50、100、および 200 μM でした。以下の酵素量と基質濃度の組み合わせを使用しました: 2 μg の hACOD1 または 0.4 μg の mACOD1 と 0.1、0.2、または 0.5 mM の基質。 1 または 2 mM 基質を含む 3 μg の hACOD1 または 0.6 μg の mACOD1; 5 μg の hACOD1 または 1 μg の mACOD1 と 5 mM または 10 mM 基質。アッセイは３回行った。 37 °C で 10 分間インキュベートした後、すぐに 95 °C で 3 分間酵素を熱不活化しました。タンパク質沈殿物を1時間の遠心分離によりペレット化した。上清を100μlの100mM H3PO4で酸性化した。イタコン酸は、HPLC (Shodex RSpak DE-413 カラム、1 ml min-1 10 mM H3PO4、注入量 10 ～ 20 μl、210 nm で検出) によって測定しました。得られた曲線は、GraphPad Prism を使用して、式 v = kcat[S]/(KM(1 + [I]/Ki) + [S]) (ここで、v = 速度、kcat = 触媒速度定数、KM = Michaelis-メンテン定数、Ki = 阻害剤定数)、独立変数として阻害剤濃度 [I] および基質濃度 [S] を使用します。

SDH 阻害は、MitoCheck Complex II 活性アッセイキット (Cayman) を使用してテストしました。このキットには、ウシ心臓ミトコンドリアの SDH 活性を測定するための試薬が含まれています。イタコン酸、シトラコン酸、およびメサコン酸を NaOH (pH 7.4 ～ 7.7) で中和し、10 mM、3 mM、1 mM、0.25 mM、50 μM、および 10 μM の濃度で試験しました。 SDH 阻害剤のマロン酸二ナトリウムを陽性対照として使用しました。アッセイは、それぞれ 1 μM ロテノン、10 μM アンチマイシン A および 1 mM KCN によるミトコンドリア複合体 I、III および IV の阻害下で、製造業者の指示に従って 96 ウェルプレートで 3 回実施しました。

ヒト急性単球性白血病細胞株 (THP1、DSMZ no. ACC 16) を、10% 熱不活化ウシ胎児血清アドバンスト (FBS-11A; Capricorn Scientific) を添加した RPMI 1640 (Gibco、カタログ番号 31870-025) で培養しました。および 1% GlutaMAX-I (100x; Gibco、カタログ番号 35050-038)、5% CO2、37 °C。 5 × 105 個の細胞を 12 ウェルプレート (Falcon) に播種し、接着マクロファージに分化させました。細胞をRPMI完全培地中で125 ng ml -1 のホルボール12-ミリステート13-アセテート（Sigma-Aldrich、カタログ番号P8139）で48時間刺激し、その後培地を交換した。その後、細胞をさらに 1 日間分化させました。分化は、顕微鏡検査により形態学的に、また CD14 および CD11c の発現についてはフローサイトメトリーにより検証されました。 II 型肺胞上皮細胞に似たヒト腺癌細胞 (A549、ACC107、DSMZ から入手) を、10% FCS および 1% GlutaMAX-I を補充した DMEM 培地中で増殖させました。ヒト角化細胞細胞株 HaCaT は、T. Werfel (ハノーバー医科大学) から提供され 31、10% FCS を補充した RPMI 1640 (Gibco、カタログ番号 21875-034) で 5% CO2、37 °C で培養しました。 NRF2-/- HaCaT セルについては参考文献に記載されています。 32. 従来の PCR 用の Venor GeM Classic マイコプラズマ検出キット (Minerva Biolabs、カタログ番号 11-1100) を使用して、すべての細胞株のマイコプラズマ汚染をテストしました。

dTHP1 細胞を、1 ml の RPMI 中のさまざまな濃度のイタコン酸塩 (0.125、5、10、および 25 mM)、メサコン酸塩またはシトラコン酸塩 (5、10、および 25 mM) とともに 6 または 24 時間インキュベートしました。培地を完全に除去し、細胞とウェル境界を1 mlのPBSで注意深く洗浄（1～3回）した後、細胞を1 mlの氷冷抽出緩衝液（アセトニトリル/メタノール/水、2:2:1）で抽出しました。内部標準を含む溶液を 30 秒間混合し、短期保存の場合は –20 °C、長期保存の場合は –80 °C で保存しました。 LPS/IFN-γ 共刺激実験では、dTHP1 細胞を 200 ng ml-1 LPS (Sigma、カタログ番号 L6511) および 400 U ml-1 ヒト IFN-γ (PeproTech、カタログ番号 300-02) で処理しました。 ) 0、6、12、18、24、30、および 48 時間放置し、その後、前述のように 1 ml の氷冷抽出バッファーで抽出しました 5。

エクソン 4 の一部とエクソン 5 全体にまたがる 2,962 bp フラグメント (7,347 ～ 10,308) を削除しました。THP1 細胞に 2 つの EF1α-Cas9-2A-EGFP/U6-guideRNA 発現プラスミドを一時的にエレクトロポレーションしました (1250 V、50 ms、 1 パルス; 5 × 106 細胞 ml-1、各プラスミド 50 μg ml-1)、Neon Transfection System (ThermoFisher Scientific)33 を使用、ACOD1 エクソン 4 (5'-CCATGGATTTTGATGACACG-3') に対するガイド RNA を含むシステムもう 1 つは、ACOD1 遺伝子座の 3' 非翻訳領域 (5'-CATGAGCCTCAAGGTTTTAG-3') に対するガイド RNA を含みます。 18時間後に緑色蛍光タンパク質の発現が増強されるように細胞を選別し、限界希釈により単一細胞コロニーとして播種しました。増殖後、ゲノム PCR およびサンガー配列決定によって ACOD1-/- 欠損クローンが同定されました。ノックアウトは、免疫ブロットによるACOD1タンパク質の不在（補足図6b）、およびタンデム質量分析計（LC-MS / MS）を備えた液体クロマトグラフィーによるイタコン酸合成の不在を確認することによって検証されました（拡張データ図2a）。

5 × 105 個の dTHP1 細胞を、感染多重度 1 で IVA (H1N1) PR8M 株に感染させました。処理の場合、細胞は、イタコン酸塩、メサコン酸塩、シトラコン酸塩、およびシトラコン酸塩を含む pH 調整された緩衝液で 12 時間プレインキュベートされました。／または図に示される濃度のイタコン酸４－オクチルを加え、次いで新鮮な培地中でウイルスとともに２時間インキュベートして、ウイルスの結合および細胞への侵入を可能にした。続いて、感染培地を、示された濃度の処理化合物を含む新鮮なｐＨ調整培地と交換した。感染の12時間後、細胞を緩衝液で洗浄し、ペレット化し、補足表2にリストされているプライマー配列を使用して、逆転写を伴う定量的PCR（RT-qPCR）によるmRNA発現のその後の分析のためにRNAを抽出しました。細胞上清中のCXCL10濃度は、 Human CXCL10 Standard ABTS ELISA Development Kit (PeproTech、カタログ番号 900-K39) を使用して測定しました。上清中のサイトカイン/ケモカイン濃度は、参考文献に記載されているように、ヒト 27 プレックスサイトカインパネル (Bio-Rad、カタログ番号 171-A1112) を使用して測定しました。そこから次のテキストが使用されました: 「標準曲線は、32 ng/mL から開始して 8 つの 2 倍連続希釈で作成しました。100 μL のアッセイ緩衝液を精密濾過プレートの各ウェルに添加し、続いて 50 μL を添加しましたビーズをアッセイバッファーで洗浄した後、50 μL の標準またはサンプル (上清) を各ウェルに添加し、穏やかに振盪しながら室温 (RT) で 30 分間インキュベートしました。を各ウェルに添加し、穏やかに振盪しながら室温で30分間インキュベートし、各ウェルにアッセイバッファー50μLを使用して3回の洗浄ステップを実行し、続いてストレプトアビジン溶液で振盪しながら室温で10分間洗浄した。アッセイバッファーの定量は、BIO-PLEX Manager ソフトウェアバージョン 4 を使用して定量化前に実行されました。」 IL-7 および IL-13 は、ほとんどのサンプルで濃度が検出限界を下回っていたため、さらなる分析から除外されました。

前述のように 34、MDCK-II 細胞 (American Tissue Culture Collection、カタログ番号 CRL-2936) を 96 ウェルプレートで培養し、加湿 5% CO2 インキュベーター内で 37 °C で一晩増殖させました。 90％コンフルエントの細胞をPBS++（Ca2+、Mg2+、0.3％BSA（Sigma）およびペニシリン-ストレプトマイシン（Invitrogen）を含む1×PBS）で1回洗浄し、細胞をウイルスサンプルの10倍段階希釈液で感染させ、室温でインキュベートした。温度を1時間維持します。ウイルス接種材料を吸引し、1 ml あたり 1 μg の Np-トシル-L-フェニルアラニルクロロメチルケトン処理トリプシンを含む 1.25% アビセル 150 μl を各ウェルに添加し、37 °C、5% CO2 で 24 時間インキュベートしました。次いで細胞を、3.7%ホルムアルデヒドおよび1% Triton X-100を含むPBS++を用いて室温で1時間固定した。細胞をＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ－２０（０．０５％）で３回洗浄し、次いで一次抗体（抗ＩＡＶ－ＮＰマウスモノクローナルＩｇＧ、ハイブリドーマ上清を１：１００に希釈；ミュンスター大学のＳ．Ｌｕｄｗｉｇより提供）とともにインキュベートした。室温で1時間。次に細胞を 3 回洗浄し、ヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 結合 IgG (Invitrogen A16072) とともに室温で 1 時間インキュベートしました。 3-アミノ-9-エチルカルバゾール (Sigma) を免疫染色の基質として使用し、室温で 30 ～ 60 分間インキュベートしました。赤く染まった病巣がはっきりと発達した後、式 FFU ml−1 (ストック) = (1/ウイルス希釈) × (病巣の数) × を使用して病巣形成単位 (FFU) でウイルス力価を決定するためにカウントされました。（希釈率）。

ヒト組織の使用はハノーバー医科大学の倫理委員会によって承認され（ファイル番号 2923-2015）、すべてのドナーは研究目的での組織の使用についてインフォームドコンセントを与えました。肺移植の臨床適応がある患者から外植された肺組織は、約 30 mg の断片に分割され、基本的に参考文献に記載されているように培養および感染されました。 10. 組織は、実験開始前に最大 20 時間 RPMI バッファー中に保存されました。組織片を、化合物または緩衝液のみを含むpH調整緩衝液で14〜19時間前処理し、その後、IAV（2×105 FFU ml-1）および化合物または緩衝液のみを含むRPMI感染培地中でさらに24時間インキュベートしました。 5 人のドナー (肺気腫 3 人、特発性肺線維症 3 人、男性 2 人、女性 3 人、年齢 58 ～ 66 歳) からの 3 片をそれぞれ使用しました。

細胞を氷冷したPBSで1回洗浄し、氷冷したRIPA緩衝液(プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む)で溶解した。ブラッドフォードアッセイによるタンパク質の定量化の際、等量の2×Laemmliサンプルバッファーを添加した。サンプルを 95 °C で 10 分間熱変性させました。タンパク質抽出物をゲル電気泳動によって分離し、0.2 μm NC ニトロセルロースブロッティングメンブレン (GE Healthcare、カタログ番号 10600004) に転写しました。非特異的結合は 5% 脱脂粉乳でブロックし、STAT1 (Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号 sc-345、1:500 希釈) に特異的な一次抗体を用いた増強された化学発光によってバンドを視覚化しました。 Cell Signaling、カタログ番号 9167S; 1:1,000 希釈)、NRF2 (Cell Signalling、カタログ番号 12721S; 1:1,000 希釈)、続いてヤギ抗ウサギ IgG-HRP (Southern Biotech、カタログ番号 4030-) とインキュベート05）。 β-アクチンは、HRP結合抗β-アクチン抗体（Abcam、カタログ番号ab49900）またはβ-アクチン抗体（C4）マウスモノクローナル抗体IgG1（Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号sc-47778）を使用して視覚化しました。メンブレンは、Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare、カタログ番号 RPN2232) を使用して開発されました。 iNTAS ウェスタンブロットイメージャー (iNTAS Science Imaging) を膜のイメージングに使用しました。

dTHP1 細胞を 12 ウェルプレートに 1 ウェルあたり 5 × 105 細胞の密度で播種しました。細胞を処理剤とともに12時間プレインキュベートし、IAV（感染多重度1）に感染させ、処理剤を含む新鮮な培地とともにインキュベートしました。ミトコンドリア ROS レベルを感染の 12 時間後に測定しました。細胞を、５μＭのＭｉｔｏＳｏｘＲｅｄ（ミトコンドリアスーパーオキシド指示薬；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｍ３６００８）を含む培地で５分間インキュベートし、その後、ＰＢＳで洗浄した。次いで、細胞を冷PBSに再懸濁し、BD LSR-IIフローサイトメーターを使用してフィコエリトリンチャネルを介してミトコンドリアROSレベルを測定しました。

HaCaT 細胞 (1.5 × 105) を 12 ウェルプレートに一晩播種し、次に指定濃度のイタコン酸、メサコン酸、およびシトラコン酸で 16 または 17.5 時間処理しました。次に、細胞を緩衝液で洗浄し、ペレット化し、補足表2にリストされているプライマー配列を使用したRT-qPCRによるmRNA測定のためにRNAを抽出しました。NRF2の安定化は免疫ブロットによって評価されました（上記を参照）。

一部の 2.5 × 104 THP1 細胞を 96 ウェルプレート (Falcon) に播種し、接着マクロファージに分化させました。アッセイを開始する前に、細胞は 80% ～ 100% コンフルエントである必要があります。 MTT 試薬ストック (Life Technologies、カタログ番号 M6494、PBS 中 5 mg ml-1) を 37 °C RPMI 複合培地で 1:10 に希釈しました。上清を除去した後、調製した希釈液 50 μl を細胞に添加し、細胞内の色を定期的に観察しながら 37 °C で 20 ～ 60 分間インキュベートしました。染色が完了したら試薬を除去し、50μlのジメチルスルホキシド(Merck)を添加した。シェーカー上で 5 ～ 15 分間 (溶液が均一になるまで) 混合した後、測定波長として 540/570 nm、測定波長として 630 nm を使用して、酵素免疫吸着アッセイリーダー (BioTek Synergy 2) によって色の変化を定量化しました。基準波長。

マウスモデルは基本的に参考文献に記載されているように実行されました。「すべての動物実験は、ルクセンブルク大学動物実験倫理委員会および適切な政府機関によって承認されました。本研究の動物実験は、ARRIVE に従って実施および報告されました。」 (動物研究: in vivo 実験の報告) 動物を使用した研究のデザイン、分析、報告を改善し、公開される情報を最大化し、不必要な研究を最小限に抑えるためのガイドライン生後 3 ～ 4 か月の C57BL/6N 雄および雌マウスを入手Charles River Laboratories (フランス) からのマウスを 12 時間の明暗サイクルで飼育し、無菌の餌と水を自由に摂取させました。マウスは特定の病原体に感染せず、個別に換気されたケージに 1 ケージあたり最大 5 匹ずつ飼育され、一定の温度で維持されました。温度 22 °C、相対湿度 55%、オートクレーブ滅菌したトウモロコシの穂軸床の上に飼育し、最低 25 kGy で照射した SAFE 食餌を与え、給水システムは塩素 2 ppm を含む逆浸透水で構成しました。マウスを、ＬＰＳ（４μｇＬＰＳ／体重１ｇ）またはビヒクル対照としてのＰＢＳの単回腹腔内注射で処置した。 LPS注射の0、12、24、および48時間後に、マウスにケタミン（100 mg/mL; Nimatek Vet）とドルベン（塩酸メデトミジン; 1 mg/mL; Dorbene Vet）の組み合わせで深く麻酔をかけました。氷冷 PBS による経心臓灌流後に脾臓を解剖し、1 M HEPES (Gibco/Life Technologies) および 0.5% D-(+)-グルコース (Sigma-Aldrich) を含む氷冷 HBSS (Gibco/Life Technologies) に収集しました。その後、液体窒素の中で保管されます。」

測定は、当社が検証した高速液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析 (HPLC-MS/MS) アッセイに従って行われました5。簡単に説明すると、サンプルを 1,000 μl の抽出試薬 (最終比 2:2:1 v/v/v のメタノール/アセトニトリル/水、0.1 μM 13C2-クエン酸塩および 13C5-イタコン酸塩、0.2 μM 13C6-cis を添加) で抽出しました。 -アコニテートおよび13C4-コハク酸、および内部標準として1μMの13C3-乳酸）。懸濁液を 2 ml セーフロック反応チューブ (Eppendorf、カタログ番号 0030120094) に移し、30 秒間ボルテックスし、-20 °C で一晩凍結してタンパク質の沈殿を完了させました。その後のサンプル前処理と、QTRAP5500 トリプル四重極/線形イオントラップ質量分析計 (Sciex) に接続された Nexera クロマトグラフィーシステム (島津製作所) 上の Kinetex C18 逆相カラム (Phenomenex、カタログ番号 00D 4462 Y0) を使用した HPLC-MS/MS アッセイ）は基本的に説明どおりに実行されました5。

参考文献に記載されているように細胞代謝物を抽出しました。 36、サンプルあたり 6 × 106 セルを使用します。アミノ酸 (n = 20)、アミノ酸代謝産物 (n = 30)、生体アミン (n = 9)、コハク酸塩および乳酸塩の濃度は、MxP Quant を使用して AB SCIEX 5500 QTrap 質量分析計 (Ab Sciex) で測定されました。 500 キット (Biocrates Life Sciences) を製造元のプロトコル (https://biocrates.com/mxp-quant-500-kit) に従って使用します。分析物（「代謝物インジケーター」）の比率および合計は、MetaboIndicator ソフトウェア（Biocrates）を使用して計算されました。

酸素消費速度は、Seahorse XF-96 アナライザー (Agilent) およびミトストレステストキット (Agilent、カタログ番号 103015-100) を使用して、メーカーのプロトコルに従って測定しました。簡単に説明すると、2.5 × 104 個の THP1 細胞を Agilent Seahorse XF96 細胞培養マイクロプレート (部品番号 101085-004) にプレーティングし、上記のようにホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテートで分化させました。アッセイ当日、細胞培養培地を、10 mM グルコース (Agilent、カタログ番号 103577-100)、1 mM ピルビン酸塩 (Agilent、カタログ) を含む Seahorse XF RPMI 培地 (Agilent、カタログ番号 103576-100) に変更しました。番号 103578-100) および 2 mM グルタミン (Gibco、カタログ番号 35050-038) を添加し、アッセイ前に 37 °C の非 CO2 インキュベーターに 45 ～ 60 分間入れました。 Seahorse XF-96 アナライザーにロードすると、コンポーネントの連続 in situ インキュベーションが次のように実行されました: ベースライン測定 18 分間、1.5 μM オリゴマイシン (Agilent) で 18 分間、1 μM シアン化カルボニル-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン (Agilent) で 18 分間0.5 μM ロテノン/アンチマイシン A (Agilent) で 18 分間。酸素消費速度データは、Wave v.2.2.1 ソフトウェア (Agilent) を使用して分析されました。

イタコン酸、メサコン酸、またはシトラコン酸 (13.0 mg、100 μM) またはオキサロ酢酸 (13.2 mg、100 μM) を、還元型 l-グルタチオン (30.7 mg、100 μM) を含む 4 本の 2 ml エッペンドルフチューブのセットに並行して添加しました。反応混合物をMilli-Q水(1ml)に溶解し、室温で2時間撹拌した。 10 μl のアリコートを、内部標準として Milli-Q 水 (490 μl)、アセトニトリル (495 μl)、および塩酸ジフェンヒドラミン (アセトニトリル中の 10 μM 溶液 5 μl) を含む LC-MS バイアルに移しました。バイアルに蓋をしてボルテックスし、Dionex UltiMate 3000 UHPLC+ 集束/Thermo Scientific Q Exactive Focus Orbitrap LC-MS/MS システム (ThermoFisher Scientific) を使用した超高性能液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析を行いました。このシステムは、Dionex UltiMate 3000 RS ポンプ、RS オートサンプラー、RS カラムコンパートメント、ダイオードアレイ検出器、四重極オービトラップ質量分析計、および操作用の標準ソフトウェア Xcalibur v.4.4.16.14 で構成されています。 RP EC 150/2 NUCLEODUR C18 ピラミッド、3 μm (150 mm × 2 mm) カラム (Macherey-Nagel) を固定相として使用し、二成分溶媒系 A および B (A = 水と 0.1% ギ酸; B = 0.1% ギ酸を含むアセトニトリル) を移動相として使用しました。グラジエント実行では、B のパーセンテージを 0 ～ 2 分間初期濃度 1% で一定に保ち、2 分で 1% から 8.5 分で 60% に増加させ、9.5 分で 95% まで増加させて維持しました。 0.4分間で95%。注入量は 2 μl、流速は 250 μl min-1 に設定しました。カラム温度は 40 °C で、紫外線トレースは 254 nm の波長で取得されました。高分解能質量分析データは、Thermo Scientific Q Exactive Focus Orbitrap システムで記録されました。質量スペクトルは、100 ～ 1000 m/z のポジティブモードで取得しました。加熱エレクトロスプレーイオン化による MS 分析は、スプレー電圧 3800 V、イオン移送管温度 350 °C で実行されました。

すべての計算作業は、分子オペレーティング環境 (MOE)、v.2020.09、Chemical Computing Group ULC、910–1010 Sherbrooke St. W. Montreal、Quebec、H3A 2R7、Canada を使用して実行されました。計算手順は、報告されたプロトコル 37 に若干の変更を加えて適応されました。

イタコン酸、メサコン酸、およびシトラコン酸の二次元構造は、ChemDraw professional 19.0 を使用してスケッチされ、MOE ウィンドウにインポートされました。化合物は、MMFF94x 力場および R 場溶媒和モデルを使用して、0.001 kcal mol−1 Å2 の勾配までエネルギー最小化を受け、その後 mdb ファイルとして保存されました。 pH 7 の水性媒体中の化合物の主なプロトン化状態は、次の計算によって計算されました。分子 | データベースビューアウィンドウで wash コマンドを実行します。補因子オキサロ酢酸と複合体を形成したヒト SDHA (PDB ID: 6VAX)38、オキサロ酢酸を含むブタミトコンドリア呼吸複合体 II (PDB ID: 3SFD)39、ヒト ACOD1 (PDB ID: 6R6U)2 およびマウス ACOD1 の X 線結晶構造(PDB ID: 6R6T)2 は分子ドッキング研究に使用されました。ポテンシャルは、溶媒和のための力場および R 場として Amber10:EHT に設定されました。水素原子の追加、リガンドまたは受容体からの 4.5 Å を超える水分子の除去、ライブラリーエラーの修正、および結合部位のテザーエネルギーの最小化は、QuickPrep モジュールを介して実行されました。

結合部位は、サイトファインダーコマンドによって特定されたダミー原子に設定されました。 SDHAサブユニットの活性部位におけるオキサロ酢酸/コハク酸の結合部位の輪郭を描くアミノ酸残基が選択された。 ACOD1 の場合、結合部位は推定活性部位 2 に従って定義されました。ドッキング配置は、誘導フィット調整オプションを備えた三角形マッチャーでした。最初のスコアリング関数は 1,000 ポーズのアルファ HB で、次に 10 ポーズのリファインメントスコア London dG が続きました。

データベースビューアウィンドウで、計算パネルをアクティブにし、記述子計算オプションを選択することにより、すべてのエントリの分子記述子が計算されました。最低空分子軌道と最高被占分子軌道のエネルギー (eV) は、MOE に含まれる量子化学プログラム MOPAC v.7.0 により、半経験的オースティンモデル 1 (AM1) ハミルトニアンを使用して計算されました。

ジカルボキシレートを含むデータベースでは、すべてのエントリに対して 2 次元フィンガープリント BIT_MACCS (166 個の公開 MDL MACCS 構造キー、ビットパック) が計算されました。サクシネートがクエリ構造として選択され、MOE ウィンドウに送信されました。データベースビューアウィンドウで、[計算] | [計算] を選択して類似性検索を実行しました。指紋 | 検索コマンド。指紋システムは BIT_MACCS に設定され、類似性メトリックとして谷本係数 (TC) が設定されました。 TC 値の範囲は 0 (類似性なし) から 1 (完全な類似性) までです。シス-アコニテートの類似性検索は、piDAPH3 (pi システム、ドナーおよびアクセプターの原子特性を考慮した 3D 立体構造に基づく 3 点ファーマコフォア) をフィンガープリントとして、シス-アコニテートをクエリ構造として使用して、同様の方法で実行されました。

2 つ以上のグループ間の差異の有意性は、一元配置分散分析 (ANOVA) に続いてダネットの多重比較検定を使用して評価されました。対応のない t 検定は、n = 4 または n = 3 の 2 つのグループ間の差異の有意性を評価するために使用され、マン・ホイットニー U 検定は、n ≥ 7 の非正規分布データの中央値の比較に使用されました。図の凡例に示されている仮説。有意性は、*≤0.05、**≤0.01、***≤0.001、および ****≤0.0001 の記号を使用して、P 値または誤検出率 ≤0.05 として定義されました。細胞実験では、n は常に生物学的複製を指します。たとえば、別のウェルで培養されたものの、他の複製と同じ実験操作を受けた同じ系統の細胞です。特に明記しない限り、データは平均値として示され、誤差バーは標準偏差を示し、統計分析はGraphPad Prism v.9.3.1 (GraphPad Software)を使用して実行されました。 PCA の場合、値は log2 変換され、MetaboAnalyst v.5.0 (https://www.metaboanalyst.ca) で分析されました。ベン図は jvenn (http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html) を使用して描画されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

ソースデータはこのペーパーに付属しています。アミノ酸関連分析の基礎となるソースデータは、拡張データ図5および補足図に示されています。図 3 および 4 は、補足データ 1 で利用できます。図 2 に示す多重サイトカイン/ケモカイン分析の基礎となる生データと拡張データ図 6 は、補足データ 2 で利用できます。この論文内の他のプロットおよびその他のプロットをサポートするデータこの研究の結果は、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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専門家の技術支援をしていただいたアネット・ガーブ氏とタレクル・ニシャド・イスラム氏、そして動物の世話を監督していただいたジャリル・クーワー氏に感謝いたします。私たちは、プロジェクト「老化と代謝プログラミング（AMPro）」、ヘルムホルツ協会の個別化医療イニシアチブ（iMed）、ヘルムホルツ協会のイニシアチブおよびネットワーキング基金、およびドイツ連邦科学省を通じたドイツ研究センターヘルムホルツ協会からの支援に感謝します。教育 (BMBF) が COVID-Protect (01KI20143C) を受賞しました (FP に)。追加の支援は、ドイツ感染症研究センター (DZIF) のパートナーサイトであるギーセン (SP に) およびアレクサンダーフォンフンボルト財団 (MS に) によって提供されました。

Helmholtz Center for Infection Research GmbH (HZI) によって提供されるオープンアクセスの資金提供。

WAM Elgaher、M. Winterhoff、K. Büssow の著者も同様に貢献しました。

感染症研究グループバイオマーカー、ヘルムホルツ感染症研究センター、ブラウンシュヴァイク、ドイツ

F. チェン、M. ヴィンターホフ、F.H. ワカス、N. サヒニ、L. チション & F. ペスラー

感染症のバイオマーカー研究グループ、TWINCORE 実験・臨床感染研究センター、ハノーバー、ドイツ

F. チェン、M. ヴィンターホフ、F.H. ワカス、N. サヒニ、L. チション & F. ペスラー

ザールランド州ヘルムホルツ製薬研究研究所 – ヘルムホルツ感染症研究センター、ザールブリュッケン、ドイツ

WAM エルガー & AKH ハーシュ

タンパク質の構造機能部門、ヘルムホルツ感染症研究センター、ブラウンシュヴァイク、ドイツ

K. ブッソー、E. グラナー、W. ブランケンフェルト

LIH ルクセンブルク保健研究所癌研究部神経免疫学グループ、ルクセンブルク、ルクセンブルク

Y. ピレスアフォンソ & A. ミケルーチ

ルクセンブルク大学科学・技術・医学学部、エッシュ・ベルヴァル、ルクセンブルク

Y. ピレスアフォンソ

英国ダンディー、ダンディー大学分子医学部門

L. カサレスペレス & L. デラベガ

フラウンホーファー毒性学および実験医学研究所 (ITEM)、ハノーバー、ドイツ

W. ゾーブル & S. シューハルト

臨床化学および臨床薬理学研究所、ボン大学医療センター、ボン、ドイツ

T.ジリンジャー

免疫学研究所、フィリップス大学マールブルク、マールブルク、ドイツ

T.ジリンジャー

医療ウイルス研究所、ユストゥス・リービッヒ大学ギーセン、ギーセン、ドイツ

M. シェハタ & S. プレシュカ

国立研究センター、ギザ、エジプト

M.シェハタ

ドイツ感染症研究センターパートナーサイトギーセン、ギーセン、ドイツ

S. プレシュカ

研究コアユニットメタボロミクス、ハノーバー医科大学、ハノーバー、ドイツ

H. ベーレ

ハノーバー医科大学、移植免疫学科、ハノーバー、ドイツ

C.フォーク

ルクセンブルクシステム生物医学センター、ルクセンブルク大学、エッシュベルヴァル、ルクセンブルク

A.ミケルーチ

ブラウンシュヴァイク工科大学、ブラウンシュヴァイク、ドイツの生化学、バイオテクノロジー、バイオインフォマティクス研究所

W. ブランケンフェルト

ザールランド大学薬学部、ザールブリュッケン、ドイツ

AKH ハーシュ

個別化感染症医学センター、ハノーバー、ドイツ

F.ペスラー

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FC、MW、WAME、WB、AKHH、KB、FP がこの研究を考案し、設計しました。 FC、MW、FW、LCP、および LdlV は細胞ベースの実験を実行しました。 EG と KB は in vitro アッセイを実施しました。 KBは、シトラコン酸によるACOD1阻害を確認した。 WAME は、リガンドとターゲットのモデリング、親電子性および類似性の計算を実施しました。 FC、NS、およびTZはACOD1-/-細胞を生成した。 MW、FC、HB、WAME、SS が質量分析を実施しました。 YP-A.、FC、AM は LPS マウスモデルを開発しました。 LC は人間の肺モデルを実行しました。 MS および SP はウイルス滴定を実施しました。 CF はサイトカイン/ケモカインアッセイを実施しました。 FC、MW、WAME、KB、WZ がデータを分析しました。 FC、MW、WAME、KB、FPが原稿を執筆しました。著者全員が原稿の最終版を読み、その出版に同意します。

F. ペスラーへの通信。

FP、FC、MW、KB、WB、AKHH、および WAME は、免疫調節、抗酸化、抗ウイルス用途を含むシトラコン酸塩の医療用途をカバーする特許の共同発明者です。医薬品としてのシトラコン酸塩の使用。特許所有者: ヘルムホルツ感染症研究センター。発明者: Pessler F、Chen F、Winterhoff M、Büssow K、Blankenfeldt W、Hirsch AKA、Elgaher WM、PCT/EP2022/060682 (2022 年 4 月 22 日)。

Nature Metabolism は、この研究の査読に貢献してくれた Luke O'Neill、Ping-Chih Ho、Jan Van den Bossche、Xavier Deup に感謝します。主な取り扱い編集者: Isabella Samuelson、Nature Metabolism チームと協力。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

細胞を25 mMの各異性体とともに6時間および24時間インキュベートし、洗浄した細胞の上清および抽出物中の3つの異性体の濃度をHPLC-MS/MSによって測定しました。 a～f、細胞内濃度。絶対濃度を a ～ c に示し、培地に添加した異性体に対する他の 2 つの異性体の割合を d ～ f に示します。イタコン酸を培地に添加すると用量依存的にメサコン酸が増加しますが(g)、イタコン酸濃度が増加するとメサコン酸/イタコン酸画分は減少します(d)。両方の観察は、おそらく酵素による飽和プロセスによる、少数のイタコン酸塩からメサコン酸塩への細胞内変換と一致しています。 g–i、細胞上清中のイタコン酸濃度は安定しています。メサコン酸塩およびシトラコン酸塩中のイタコン酸塩の既知の不純物が再び検出されました（補足図S1c–gも参照）。 n=3 の生物学的複製、意味 ±SD。

a〜h、メサコン酸の蓄積は、LPS誘発炎症におけるイタコン酸の蓄積後にピークに達し、dTHP1細胞における事前のイタコン酸の合成に依存します。 a〜d、dTHP1細胞をLPS/IFNγで刺激し、指定の時点で3つの異性体の細胞内濃度をHPLC-MS/MSで測定しました。シトラコン酸は検出されなかった。 ACOD1-/- dTHP1 細胞ではイタコン酸もメサコン酸も検出されませんでした。 24 時間後の最大イタコン酸濃度は 460 μmol/L でした。 n=3 の生物学的複製、意味 ±SD。 e〜h、腹腔内LPS注射によってC57BL / 6Nマウスで全身性炎症が誘発され、脾臓ホモジネート中の3つの異性体の濃度が示された時点でHPLC-MS / MSによって測定されました。各時点で n=2 匹のマウス。 i-l、ACOD1を過剰発現するA549細胞におけるメサコン酸の蓄積。ヒトまたはマウスの ACOD1 を一過性トランスフェクションによって A549 細胞で発現させ、3 つの異性体および選択された TCA 中間体および乳酸塩の濃度を、指定の時点で HPLC-MS/MS によって測定しました。値

図 1 に示す実験に基づく分析。さらに 24 時間の時点も示しています。 0.125 mM 濃度のイタコン酸を使用して、25 mM メサコン酸で見られるイタコン酸の最大汚染を模倣しました。 a〜g、5、10、または25 mMでの処理から6時間後、および25 mMでの処理から24時間後の表示された分析物の濃度。 h、SDH阻害を示すコハク酸塩とフマル酸塩の比。 n=3、平均±SD。対応のない T 検定。 i、j、IAV感染dTHP1およびA549細胞におけるコハク酸レベル。拡張データ図5d、eに示すのと同じ実験および独立した実験で得られます。イタコン酸塩の添加のみがコハク酸塩レベルを上昇させ、その効果は A549 細胞よりも dTHP1 でより顕著です。 n=4 生物学的複製、平均 ±SD。一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定。 P 値: * ≤0.05、** ≤0.01、*** ≤0.001、**** ≤0.0001。

a ～ c、イタコン酸異性体の GSH 付加物の構造。 d、求電子性に関する 3 つの異性体のランキング。 e-h、SDH の活性部位へのイタコン酸およびメサコン酸の非共有結合の分子モデリング予測。 e、ヒト SDHA のコハク酸結合部位におけるイタコン酸 (黄色) とオキサロ酢酸 (マゼンタ) の 3D 結合モード (PDB ID: 6VAX)2。結合は完全に静電引力のネットワーク、つまり C1 および C4 カルボキシル基と活性部位残基 (Thr308、Arg340、His407、および Arg451) の間の水素結合と塩橋 (破線) を通じて達成されました。活性部位の静電タンパク質表面: ポジティブ (青)、ネガティブ (赤)、中性 (白)。フラビンアデニンジヌクレオチド (FAD、緑色)。 f、イタコン酸の2Dリガンド相互作用。 g、オキサロ酢酸（マゼンタ）と比較したメサコン酸（黄色）の潜在的な結合モード。イタコン酸と同様に、メサコン酸の C1- および C4-カルボキシル基は、水素結合とイオン相互作用による結合を担う唯一の部分です (破線)。しかし、その硬くて平面的な構造は、イタコン酸と比較して部分的な接触しか確立できませんでした。 h、シトラコン酸塩の 2D リガンド相互作用。ｉ、イタコン酸、メサコン酸、およびシトラコン酸によるＳＤＨ阻害の比較（ウシミトコンドリアを使用したインビトロアッセイ）。 SDH活性は、漸増濃度のイタコン酸塩、メサコン酸塩、シトラコン酸塩および対照阻害剤マロン酸塩の存在下で測定した(n=3の独立したアッセイ、平均±SD)。異性体の中で、イタコン酸は最も強力な SDH 阻害剤であり、シトラコン酸による阻害は本質的にありませんでした。

dTHP1 および A549 細胞を未処理のまま放置するか、イタコン酸、メサコン酸、シトラコン酸 (20 mM) またはイタコン酸 4-オクチル (4-OI、125 μM) とインキュベートし、IAV PR8M (MOI=1) に感染させた後、治療法。複製は、dTHP1 細胞では HA mRNA の発現 (RT-qPCR) により感染後 12 時間後に測定し、A549 細胞では HA mRNA (RT-qPCR) およびウイルス力価の測定 (病巣形成アッセイ) により感染後 24 時間後に測定しました。 a、HA mRNA (dTHP1 細胞)。 b、HA mRNA (A549 細胞)。 c、IAV力価（A549細胞）。 n=4 の生物学的複製、意味 ±SD。一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定。 P 値: * ≤0.05、** ≤0.01、*** ≤0.001、**** ≤0.0001。 IAV感染dTHP1およびA549細胞におけるアミノ酸代謝に対するイタコン酸異性体の共通かつ独特な効果。 dg、追加の処理として 4-OI (125 μM) を使用したことを除いて、ac と同じ実験設定。 20 個のアミノ酸、30 個のアミノ酸代謝産物、および 9 個の生体アミンの濃度を、dTHP1 については 12 時間後、A549 については 24 時間後に、HPLC-MS/MS (MxP Quant 500 キット、Biocrates) によって測定しました (グループあたり n=4)。個々の分析物の濃度や代謝産物指標の値などの追加データを補足図S3およびS4に示します。 d、e、59 アミノ酸関連分析物に基づく PCA。 d. dTHP1 細胞では、感染は中程度の変化のみを引き起こしますが、3 つの異性体は同様ではあるが明確に認識できる効果を発揮し、4-OI の影響とは大きく異なります。 e. A549 細胞では、感染はアミノ酸代謝に非常に強い影響を与えます。 f、A549およびdTHP1感染細胞および非感染細胞において、差次的に豊富に存在する分析物(対応のないT検定、FC>1.3、FDR≤0.05)を示すベン図。 g、代謝物インジケーターのベン図 (機能的に関連する分析物の 66 個の合計と比率、Biocrates MetaboIndicatorTM ソフトウェアで計算)。ソースデータ表 1 には、dg に関するソースデータが含まれています。

a、b、イタコン酸異性体（20 mM）の投与17.5時間後のWT細胞およびNRF2-/- HaCaT細胞における14個の潜在的にNRF2誘導性遺伝子の発現。 WT 細胞と KO 細胞における発現の最大の違いは、シトラコン酸塩の投与時に見られます。 c〜e、IAV感染dTHP1細胞におけるSLC7A11、GCLM、およびME1 mRNAの誘導は、メサコン酸ではなくシトラコン酸による。細胞をイタコン酸異性体（20 mM）で12時間前処理し、ウイルス含有培地で2時間インキュベートし（MOI=1）、その後イタコン酸異性体を含む新鮮な培地でさらに10時間インキュベートしました。 f – q、イタコン酸異性体の免疫調節効果。 IAV 感染実験は c ～ e と同一です。 f〜h、細胞内での示されたmRNAの発現（RT-qPCR）。 i-q、培養上清中の指定されたサイトカイン/ケモカインの濃度（マルチプレックスマイクロビーズアッセイ）。ソースデータテーブル S2 には、i ～ q に関する生データが含まれています。 aq、n=3 生物学的複製、意味 ±SD。 P 値: * ≤0.05、** ≤0.01、*** ≤0.001、**** ≤0.0001; ダネットの多重比較検定を使用した一元配置分散分析。

a、b、無細胞アッセイ。組換え mACOD1 を基質 (cis-アコニテート) および阻害剤 (シトラコン酸) の濃度を増加させながらインキュベートし、イタコン酸の蓄積を HPLC で測定しました。 n=3 の独立したアッセイ、平均 ±SD。図 3c にリストされている値に関する動態データ。線は、競合阻害剤を使用したミカエリス・メンテン方程式に当てはめた曲線を表します。 b、aに示したデータのラインウィーバー・バーク・プロット。 c、シス-アコニテートとの類似性（タニモト係数）、およびヒトおよびマウスACOD1に対するイタコン酸異性体の結合エネルギー。 d、マウスACOD1の活性部位におけるシトラコン酸塩（黄色）の推定結合モード（PDB ID: 6R6T）1。シトラコン酸塩の C1- および C4-カルボキシル基は、水素結合およびイオン接触 (破線) を介して活性部位残基 (His103、His159、Lys207、Lys272、および Leu278) に静電気的に結合します。活性部位の静電タンパク質表面: ポジティブ (青)、ネガティブ (赤)、中性 (白)。 e、シトラコン酸塩の 2D リガンド相互作用。 f、ヒトACOD1の活性部位におけるシトラコン酸塩（黄色）、イタコン酸塩（シアン）、およびメサコン酸塩（緑色）の推定結合様式を基質シス-アコニ酸塩（マゼンタ）の結合様式と比較した重ね合わせ図（PDB ID: 6R6U）1。シトラコン酸塩だけがシスアコニテートと同じ結合様式をとることができ、シス配向のカルボキシル基が活性部位残基 (His159、Lys207、Lys272、および Leu278) との相互作用に完全に関与します。対照的に、イタコン酸とメサコン酸のカルボキシル基は部分的に相互作用し、結合親和性が低くなります。

ＬＰＳ／ＩＦＮγ刺激およびシトラコン酸塩またはイタコン酸塩（１ｍＭまたは２５ｍＭ）による処理を、図４ｍ〜ｏのように実施した。ミトコンドリア呼吸は、未刺激の dTHP1 細胞または刺激の 12 時間後にタツノオトシゴアッセイによって測定されました。ａ〜ｃ、基礎呼吸、最大呼吸（ａおよびｂ）、および予備呼吸能力（ｃ）による酸素消費率（ＯＣＲ）を示す棒グラフ。 25 mM イタコン酸塩は、LPS/IFNγ 誘導 dTHP1 細胞の最大呼吸量と予備呼吸能力を有意に減少させましたが、1 mM シトラコン酸塩はこの減少を防ぐ傾向があり (それぞれ p=0.076 および 0.096)、25 mM のイタコン酸塩は最大呼吸量と予備呼吸量を有意に減少させる傾向がありました。イタコン酸は予備呼吸能力を正常化します (p=0.082)。 (生物学的複製) は次のとおりでした: 未処理 = 5。 1 mM シトラ = 4; 25 mM シトラ = 3; 1 mM Ita = 4; 25 mM Ita = 4。bn は次のとおりです。未処理 = 5。 1 mM シトラ = 5; 25 mM シトラ = 3; 1 mM Ita = 4; 25 mM Ita = 4。c の結果は、a および b に示した実験から計算されているため、a および b のそれぞれの処理と同じ n を持ちます。 ±SDを意味します。一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定。 P 値: * ≤0.05、** ≤0.01、*** ≤0.001、**** ≤0.0001。 dh、acに示すグラフの基礎を形成するOCR出力曲線。 d、非刺激細胞対LPS/IFNγ刺激細胞。 e、シトラコン酸処理、未刺激の細胞。 f、シトラコン酸処理、LPS/IFNγ刺激細胞。 g、イタコン酸処理、未刺激の細胞。 h、イタコン酸処理、LPS/IFNγ刺激細胞。 dh の結果は、a および b に示す実験から計算されるため、a および b のそれぞれの処理と同じ n を持ちます。 ±SDを意味します。 P 値: * ≤0.05、** ≤0.01、*** ≤0.001、**** ≤0.0001。ダネットの多重比較検定を使用した一元配置分散分析。略語: FCCP = シアン化カルボニル-4 (トリフルオロメトキシ) フェニルヒドラゾン。オリゴ = オリゴマイシン。腐敗 = ロテノン。 AA = アンチマイシン A。

補足図。 1 ～ 6、表 1 および 2。

拡張データ図5および補足図に係るLC-MS/MSアミノ酸分析のソースデータ。 3と4。

図 2 および拡張データ図 6 に関するマイクロビーズ多重サイトカイン / ケモカイン分析のソースデータ。

補足図6bのソースデータのブロット。

イムノブロットのトリミングされていない膜画像、図 2a、j、k。

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転載と許可

Chen、F.、Elgaher、WAM、Winterhoff、M. 他。シトラコン酸塩は、ACOD1 (IRG1) 触媒作用を阻害し、インターフェロン反応と酸化ストレスを軽減し、炎症と細胞代謝を調節します。 Nat Metab 4、534–546 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42255-022-00577-x

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受信日: 2021 年 5 月 20 日

受理日: 2022 年 4 月 20 日

公開日: 2022 年 6 月 2 日

発行日：2022年5月

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-022-00577-x

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