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Oct 18, 2023

Nature Communications volume 14、記事番号: 294 (2023) この記事を引用

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131 オルトメトリック

メトリクスの詳細

結合は、細菌細胞間のプラスミド DNA の移動のための接触依存メカニズムであり、抗生物質耐性の蔓延に寄与します。 ここでは、生細胞顕微鏡を使用して、大腸菌における F プラスミドの接合伝達の細胞内動態をリアルタイムで視覚化します。 我々は、一本鎖型 (ssDNA) でのプラスミドの転移とその後の二本鎖 DNA (dsDNA) への変換が、特定のタイミングと細胞内局在で起こる高速かつ効率的なプロセスであることを示します。 特に、ssDNA から dsDNA への変換は、プラスミドにコードされたタンパク質生成のタイミングを決定します。 レシピエント細胞に最初に入るリーディング領域は、ssDNA プラスミドの侵入直後にリーディングタンパク質の初期かつ一過性の合成を可能にする一本鎖プロモーターを担持しています。 その後の dsDNA への変換により、主要な遺伝子発現がオフになり、従来の二本鎖プロモーターの制御下で他のプラスミド遺伝子の発現が活性化されます。 この分子戦略により、プラスミドの確立、維持、普及に連続的に関与する因子をタイムリーに生産することが可能になります。

細菌の DNA 結合は、直接接触によってドナーからレシピエント細胞に遺伝情報が伝達される、広く普及している水平遺伝子伝達機構です 1,2,3,4。 接合は、さまざまな代謝特性の種内および種間の伝播に関与しており、細菌の獲得耐性の 80% を占めています5。 F プラスミドは最初に発見された接合エレメント 1,6 であり、大腸菌やその他の腸内細菌科の種に広く分布している接合プラスミドの大きなグループの典型的な代表として現在文書化されており、それらはコリシン、病原性因子、抗生物質の蔓延に関連しています。抵抗7、8、9。 F 様プラスミドは、その基本的かつ臨床的重要性により、結合による転移に関与する分子反応と因子の詳細な理解を提供する広範な研究の焦点となってきました 3,4。

ドナー細胞内では、組込み宿主因子 IHF、プラスミドにコードされたアクセサリータンパク質 TraY、TraM、多機能リラクサーゼ TraI などのリラキソソーム成分が F プラスミドの転移起点 (oriT) に動員されます 10、11、12。 次に、リラキソソーム複合体は、カップリングタンパク質 TraD によって IV 型分泌系 (T4SS) に動員され、開始前複合体が形成されます 13、14、15、16、17。 TraI および TraD タンパク質は、活性な結合機構の確立に必要なサブユニットのコアセットの原型構成要素であり、一般的な命名法ではそれぞれ VirD2 および VirD4 と呼ばれます。 交配ペアの確立は、開始前複合体を活性化するまだ特徴付けられていないシグナルを誘発することが提案されている。 次に、TraI は部位および鎖特異的な DNA 切断 (ニック) をプラスミドの oriT に導入し、5' リン酸末端に共有結合したままになります。 TraI は、T ストランド 18、19、20、21、22、23、24、25、26 と呼ばれる、転移される ssDNA プラスミドを押し出すヘリカーゼとしても機能します。 これらの機能を実行するには 2 つのリラクサーゼが必要であることが当初示唆され、後に確認されました 27,28。 この段階では、T 鎖の 3' OH は、ドナー細胞内で無傷の環状 ssDNA プラスミドを dsDNA に変換するローリング サークル複製 (RCR) を開始する働きをします 3,29,30。一方、5' リン酸は TraI に結合します。は、T4SS 機構を介してレシピエント細胞に移入されます。 T4SS の分子構造は十分に特徴付けられていますが 31、32、33、34、T 複合体 (T 鎖 TraI 核タンパク質) がドナー細胞の膜およびレシピエント細胞の膜を通過する仕組みは不明のままです。

最初に転移されたセグメントは、約 13.5 knt のリーディング領域で、染色体にコードされている必須一本鎖結合タンパク質 Ssb の相同体である SsbF タンパク質をコードする遺伝子、つまり、SOS 阻害を阻害する PsiB タンパク質（プラスミド SOS 阻害）35、36、37、38 を含んでいます。結合中の SOS 誘導39,40、および機能が不明なその他のタンパク質。 注目すべきことに、このリーディング領域は、さまざまな不和合性グループに属するさまざまな腸内細菌プラスミドで保存されています41、42、43、44、45、46。 隣接して次に移入される約 17 knt の維持領域には、ParABS 様プラスミド分配システム (SopABC) と栄養複製の起点が含まれています 47、48、49、50。 F プラスミドの最後に転移されたセグメントは、リラキソソーム、T4SS、自己転移に対する排除システムなど、プラスミド DNA のプロセシングと転移に必要なすべてのタンパク質因子をコードする約 33.3 knt の大きな tra 領域です4。 さらに、F 様プラスミドは、維持領域と tra 領域の間に一般的に統合されるさまざまな代謝機能に関与するカーゴ遺伝子を運ぶことがよくあります 7,9。 T 鎖の 5' 末端と 3' 末端の両方が受容細胞 (トランスコンジュガントと呼ばれます) に取り込まれると、ssDNA プラスミドは TraI26、27、51、52 ​​によって環状化されます。 ssDNAプラスミドも相補鎖合成反応によりdsDNAに変換されます。 この DNA 合成反応がプラスミドがレシピエント細胞に入るときに起こるのか、それともプラスミドの再環状化後に開始されるのかは不明のままです。 それにもかかわらず、ss から dsDNA への変換の完了はプラスミドの複製と分配に必要であり、したがって新しい宿主細胞系統におけるプラスミドの安定性にとって重要です。

上述の機構モデルは十分に文書化されています。 しかし、接合のリアルタイムのダイナミクスと細胞内組織化は、生きた細菌ではほとんど説明されていないままです。 特に、ssDNA プラスミドの侵入、ss から dsDNA への変換、プラスミド遺伝子発現など、レシピエント細胞における反応の細胞内局在とタイミングについてはほとんどわかっていません。 最後に述べたものに関して、初期の研究では、いくつかの主要な遺伝子（F プラスミドの ssbF および psiB、および ColIb-P9 プラスミドの ssbColIb-P9、psiB および ardA）が、アクセプター細胞へのプラスミドの侵入後に急速に発現されることが報告されています 36,37。 38、42、53、54。 masai らによる in vitro 研究 55 では、F プラスミドのリーディング領域に位置する非コード Frpo 配列の一本鎖形態が、標準的な -10 および -35 ボックスを再構成するステムループ構造に折りたたまれることが示されました。 このプロモーター配列は、in vitro アッセイで RNA 合成を開始する大腸菌 RNA ポリメラーゼを動員できます 55。 Frpo と相同な配列は、ColIb-P956,57 の先頭領域にも見つかりました。 これらの観察は、Frpo 様配列が、プラスミドがまだ ssDNA の形にあるときに主要な遺伝子の初期転写を開始する ssDNA プロモーターとして機能する可能性があるという提案につながりました。 この調節機構が生体内結合中に起こるかどうかはまだ証明されていない。

この研究では、生細胞顕微鏡イメージングを使用して、大腸菌 K12 株間の天然 F プラスミドの完全な転移配列を視覚化します。 私たちは、染色体にコードされた一本鎖結合タンパク質 Ssb (Ssb-Ypet) の蛍光融合による ssDNA 転移のモニタリングや、mCherry-ParB/parS システムによる ssDNA の可視化など、特別に開発された遺伝子レポーターを使用して結合の重要なステップを検査します。 dsDNA への変換とその後のプラスミド複製、および新しい宿主細胞におけるプラスミドにコードされた産生を定量化し、時間を測定するための翻訳蛍光融合。 このアプローチは、生きた細菌における結合反応のコレオグラフィーを明らかにし、プラスミドプロセシングと遺伝子発現の間の相互作用についての新たな洞察を提供します。

我々は、栄養成長および結合中に、ドナー細胞およびレシピエント細胞における染色体にコードされた一本鎖結合タンパク質Ssb（Ssb-Ypet）の蛍光内因性融合の動的局在をモニタリングしました（図1a、bおよび図S1）。 栄養成長中、Ssb-Ypetはドナー細胞とレシピエント細胞の内部領域内の細胞中央部と4分の1の位置に個別の焦点を形成します（図1cおよび図S2a、b）。 これらの Ssb 焦点は、以下 Ssb 複製焦点と呼ばれ、ヌクレオイド DNA 上の複製フォークに続く ssDNA と関連付けられています60,61。 結合中、Ssb の細胞内局在は劇的に変化します。 以前に報告されたように 58,59 、現在接合接合体と呼ばれているレシピエント細胞への ssDNA プラスミドの侵入は、Ssb 分子の動員と、Ssb 接合焦点と呼ばれる明るい膜近位焦点の形成を引き起こします（図 1b および図 1b）。 S1)。 ここでは、ドナー細胞におけるSsb接合焦点の形成も観察し、転移中の接合細孔の両側にssDNAプラスミドが存在することを明らかにしました（図1bおよび図S1）。 病巣局在解析により、プラスミドの出入りが接合対細胞内の特定の膜位置で起こっていることが明らかになりました。 ssb接合焦点はドナー細胞の周囲、優先的に4分の1の位置に分布しており（図1cおよび図S2a、b）、活性な接合細孔を通るssDNAプラスミドの出口の好ましい位置を反映しています。 対照的に、ssDNAプラスミドの侵入は主に接合接合細胞の極性領域内で起こります（図1cおよび図S2a、b）。 私たちのデータにより、結合が特定の細胞周期段階で起こるかどうかを検討することもできます。 細胞年齢の代用として細胞長を分析すると、プラスミド導入に関与するドナー細胞とレシピエント細胞が栄養増殖時と同様の長さ分布を示すことが明らかになります（図1d）。 これは、誕生から細胞分裂までの細胞周期のどの段階でも、ドナーはプラスミドを与えることができ、レシピエントはプラスミドを取得できることを示しています。

a 栄養成長中の ssb-ypet 融合遺伝子を保有するドナーとレシピエントの代表的な顕微鏡画像。 レシピエントはまた、拡散 mCh-ParB 蛍光タンパク質も産生します。 スケールバーは1μm。 b ドナー（D）と接合接合細胞（T）に変換されるレシピエント（R）の間のプラスミド転移の微速度撮影顕微鏡画像。 スケールバーは1μm。 追加のイベントを図 S1 に示します。 c栄養成長（野菜）および抱合（結合）中のドナー、レシピエント、および接合完了体におけるSsb-Ypetの2D局在化ヒートマップ。 少なくとも 3 つの生物学的複製からの (n) 個の個々の細胞の細胞長による正規化。 密度スケールバーは左側にあります。 d ドナー、レシピエントおよび接合接合体の細胞長分布ヒストグラム (少なくとも 3 回の独立した実験から分析された n 個の細胞)。 e 接合完了細胞と比較したドナーにおけるSsb接合焦点の出現タイミング。 平均値と標準偏差を含むヒストグラムは、Ssb 焦点が接合体に現れる前（-1 分）、同時（0 分）、または後（+1 分、+2 分）にドナーに現れる転移事象の割合を表します。 3 つの独立した実験から分析された個々の転移イベントの数 (n) が示されています。 f 同時出現時のSsb-Ypet共役焦点の蛍光強度のジッタープロット。 3 つの独立した実験から分析された病巣の数 (n) が、対応する平均値と SEM で示されます。 マン・ホイットニー両側統計検定からの P 値の有意性は **** (P ≤ 0.0001) で示されます。 g ドナー細胞および接合完了細胞におけるSsb-Ypet接合焦点の寿命のジッタープロット。 マン・ホイットニー両側統計検定からの P 値の有意性は **** (P = 0.0001) で示されます。 少なくとも 5 回の独立した実験から分析された細胞の数 (n) が示されています。 h ドナー、レシピエントおよび接合接合細胞における遊離 mCherry および Ssb-Ypet の蛍光歪度のバイオリンプロット。 中央値、四分位 1、および四分位 3 はボックスの境界で示され、平均は黒い点で示され、最小値と最大値はひげの境界で示されます。 最大値と最小値の上下の黒い点は外れ値に対応します。 無料の mCherry データは、1 つの代表的な実験に対応します。 他のプロットは、少なくとも 3 つの生物学的複製からのパネル (c) と同じデータセットに対応します。 分析された細胞の数 (n) が表示されます。 i接合中の接合完了細胞におけるSsb-Ypet複製および接合焦点強度のジッタープロット。 時間0分は、レシピエントにおけるSsb-Ypet結合焦点の出現に対応する。 3 つの独立した実験から分析された細胞の数 (n) が、対応する平均値と SEM で示されます。 ドナー (LY1007)、レシピエント (LY358)、接合接合体 (LY1007 から Fwt 取得後の LY358)。 遊離の mCherry は、MS388 wt バックグラウンド (LY1737) の染色体から生成されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

タイムラプスイメージング（1分/フレーム）によって視覚化された個々のプラスミド導入イベントの77.8±7％（n = 131）で、Ssb接合焦点が同じフレーム上のドナー細胞と接合接合細胞に現れます（図1e）。 これらの場合、Ssb接合焦点は平均して、ドナー細胞よりも接合完了体の方が明るく、接合細孔の両側のssDNAプラスミドの相対量を反映しています（図1f）。 残りの22.2％の転移事象では、Ssb接合焦点が最初に接合完了体に現れ、次に1〜2分後にドナーに現れます（図1e）。 レシピエントに比べてドナーにおける ssDNA の蓄積が遅いことは、接合接合体における Ssb-Ypet 接合焦点の平均寿命が 2.5 ± 1.1 分 (n = 197) であるのに対し、2.9 ± 1.1 分 (n = 294) であるという定量化によって裏付けられます。 ）ドナー細胞内（図1g）。 これらのデータは、接合焦点の出現が接合対細胞において非同期であることを示し、ssDNA 転移の特定の順序を示唆しています。 ドナー細胞内の TraI のヘリカーゼ活性によって生成される T 鎖の最初のセグメントは、Ssb 分子を動員できるほど長く留まらず、すぐにレシピエントに転送されます。 この短い転移段階の後でのみ、ssDNA はドナー側にも蓄積し、そこでは非転移プラスミド鎖または T 鎖のいずれかまたは両方に対応する可能性があります。 これは、TraI ヘリカーゼ活性による ssDNA 形成の速度が、RCR による ssDNA の除去および T4SS を介した移動の速度よりも速いことを意味します (考察を参照)。

大量の ssDNA プラスミドの内部移行は、ドナーおよび接合接合細胞の周囲で Ssb 分子の細胞内プールの大量の動員を引き起こします。 Ssb-Ypet細胞内分布のこの変化は歪度分析によって明らかになり、閾値ベースの焦点検出を必要とせずに細胞内の蛍光分布の非対称性の偏りのない測定が得られます（図1h）。 遊離 mCherry (mCh) を生成する野生型細胞は、細胞の細胞質内の均一なピクセル蛍光分布に対応する低い歪度を示します。 栄養成長中、Ssb-Ypet 蛍光は部分的に細胞質内に拡散し、部分的に複製焦点内に局所的に集中するため、歪度は約 1.2 になります。 比較すると、Ssb-Ypet は、プラスミド導入中にドナーおよび接合体において約 4.1 という強い歪度を示し、これは焦点内にクラスター化された Ssb 分子の割合の増加を反映しています。 したがって、我々は、Ssb 分子のどの部分が接合焦点内に含まれているのか、またその形成が接合接合細胞の複製焦点内での Ssb の枯渇と関連しているのかどうかを疑問に思いました。 この問題に対処するために、プラスミド導入中に Ssb-Ypet 病巣の自動検出と輝度定量化を実行しました（図 1i）。 プラスミド侵入開始から 1 分後、Ssb-Ypet 複製焦点はまだ存在していますが、初期の強度の半分を示し、一方、接合焦点は 35 倍明るくなっていることが観察されます。 総Ssb-Ypet細胞内蛍光は転移中に変化しないため（図S2c）、これらの変動は、Ssb-Ypetのデノボ合成ではなく、Ssb-Ypet分子が入ってくるssDNAプラスミド上に移動したことに起因する可能性があります。 この動態は、入ってくる ssDNA プラスミドが転移中にアクセプター細胞内のほとんどの Ssb-Ypet 分子を動員することを反映しています。

Ssb は大腸菌細胞あたり約 1320 ± 420 個の単量体で存在し、四量体の二量体は in vivo で約 170 nt をカバーすると推定されています61。 その結果、細胞あたりの Ssb コピーは、ssDNA F プラスミドの 108,000 ヌクレオチドに加え、複製フォークに関連する ssDNA の数百ヌクレオチド (22 °C で約 650 nt) を収容するのに十分ではありません。 実際、相補鎖合成反応が T 鎖転移と同時に起こるのか、それとも完了後に起こるのかが不明であるため、F プラスミドがレシピエントに ssDNA の形で完全に存在するかどうかは不明です。 それでも、入ってくるssDNA上へのSsb分子の大量動員が観察されているため、Ssbの利用可能性が低下し、宿主染色体DNA複製の一時的な障害を引き起こす可能性がある。 この問題に in vivo で対処する 1 つの方法は、β2 クランプ レプリソーム コンポーネント (mCh-DnaN) の蛍光融合をモニタリングすることです。これは非複製細胞の細胞質に拡散し、DNA 複製の進行中に個別のレプリソーム関連焦点を形成します 60。 61、63。 顕微鏡イメージングと歪度分析では、Ssb結合病巣の形成前、形成中、形成後にDnaN局在パターンに変化はありませんでした（図S2d）。 これは、入ってくる ssDNA プラスミドへの Ssb のリクルートが複製フォークの崩壊をもたらさないことを示しています。 この一時的で短いプロセス中に DNA 複製速度が影響を受けるかどうかについては、まだ可能性が残っています。

新しく取得した ssDNA プラスミドの相補鎖合成反応による dsDNA への変換とその後のプラスミド複製事象を、parS/ParB DNA 標識システムを使用して分析しました 58,59。 parS 結合部位は F プラスミドに挿入されますが、mCherry で蛍光標識された ParB 結合タンパク質 (mCh-ParB) は受容細胞内のプラスミドのみから生成されます。 顕微鏡下では、ssからdsDNAへの変換は、接合接合細胞におけるSsb-Ypet接合焦点の消失とmCh-ParB焦点の形成によって報告されます（図2a）。 まず、タイムラプスイメージング（1分/フレーム）を実行して、ssDNA侵入後のssからdsDNAへの変換の成功率とタイミングを視覚化しました（図2b）。 分析の結果、分析された 83.3 ± 2.3% (n = 311) の個々の接合接合細胞において、Ssb-Ypet 接合焦点の出現に続いて mCh-ParB 焦点が形成されることが示され、内在化された ssDNA プラスミドの大部分が正常に変換されたことが示されています。 dsDNA プラスミドに変換します (図 2c)。 特に、新しく取得したssDNAプラスミドがすでにdsDNAに変換されている接合接合細胞の40±3.2％（n = 286）が、その後追加のssDNAを受け取ることが観察されます（図2dおよび図S3a）。 我々は、これらの複数のssDNA取得イベントの92±3.1％が同じドナーに由来することを定量化し、そのうち79±5.3％は同じ膜位置で起こっているように見え、それらが同じ結合孔を介して起こっていることを示唆しています（図S3a）。 確立された交配ペア内での複数の転移の証拠は、単一のドナーが T 鎖の複数のコピーを連続的に与えることができること、および ss から dsDNA への変換がすでに達成されている接合接合体が de novo プラスミドに対して即座に不応性になるわけではないことを示しています。取得。 したがって、接合接合細胞による接合に対する免疫を確立するには、プラスミドにコードされた排除タンパク質TraSおよびTraTの産生が必要であると予想される。

a ドナー (D) 細胞とレシピエント (R) 細胞の両方における Ssb-Ypet 接合焦点の形成と、それに続く mCh- ParB は接合接合 (T) 細胞に焦点を当てています。 スケールバーは1μm。 b 接合接合細胞におけるmCh-ParBフォーカス形成によって明らかになった、ssからdsDNAへの変換に関するSsb-Ypetフォーカスの出現（青線）およびmCh-ParBフォーカスの最初の重複（赤線）の単一細胞タイムラプス定量化（ 0分）。 Ssb-Ypet 焦点の出現は 1 分/フレームのタイムラプスを使用して分析されましたが、mCh-ParB の最初と 2 番目の重複は 5 分/フレームのタイムラプスを使用して分析されました。 7 つの独立した実験から分析された共役イベントの示された数 (n) から計算された平均値と SD が示されています。 c Ssb-Ypet接合焦点からmCh-ParB焦点への変換によって反映される、成功したssからdsDNA変換のヒストグラム。 平均値と SD は、6 つの生物学的複製 (黒い点) からの (n) 個の個々の転移イベントから計算されます。 d Ssb-Ypet接合焦点の連続的な出現によって明らかになった、複数のssDNAプラスミドを獲得するmCh-ParB焦点を有する接合接合体のパーセンテージを示すヒストグラム。 平均値と SD は、6 つの生物学的複製 (黒い点) からの (n) 個の接合接合細胞から計算されます。 e 接合完了体におけるSsb-YpetとmCh-ParB病巣の出現の間の時間差を示す散布図。 7 つの生物学的複製からの (n) 個の個々のイベント (青い丸) から計算された平均値と SD が示されています。 f mCh-ParB 焦点の出現と、2 つの焦点 (最初の複製) および 3 つまたは 4 つの焦点 (2 番目の複製) における視覚的複製の間のタイムラグを示す散布図。 少なくとも 6 つの生物学的複製からの (n 個の) 個々の重複イベント (赤丸) から計算された平均値と SD が示されています。 g 栄養増殖中の F 保有ドナー株および F プラスミド取得後の接合接合体の細胞あたりの F 病巣数の単一細胞タイムラプス定量化。 ドナーについては、細胞誕生 (t = 0 分) に関する細胞あたりの F 病巣の数 (SopB-sfGFP 病巣の数) が示されています (灰色の曲線)。 接合接合体については、mCh-ParB 病巣の出現 (t = 0 分) に対する細胞あたりの F 病巣の数 (mCh-ParB 病巣の数) を示します (黒い曲線)。 4 つの生物学的複製からの (n) 個の個々の細胞から計算された平均値と SD が、曲線の直線フィッティング ライン (緑と赤) とともに示されます。 Fを保有するドナー株（LY834）、接合接合体（Fwt取得後のLY358）。 h 出現時（上）および重複直前（下）の mCh-ParB 病巣の 2D 局在化ヒートマップ。 ヒートマップは、7 つの生物学的複製からの (n) 個の個々の接合接合細胞の細胞長によって正規化されています。 a〜f、h Fwtドナー（LY1007）、レシピエント（LY358）、および接合接合体（Fwt取得後のLY358）。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

成功したss-to-dsDNAイベントのみを考慮して、Ssb-Ypet結合焦点の出現とmCh-ParB焦点の形成の間の平均4±1.6分（n = 475）の時間差を計算します（図2e）。 この期間は、ssDNA プラスミドの内部移行、相補鎖合成複製の開始、および dsDNA 形式の parS 部位での ParB 分子の補充を含む反応カスケードの完了に必要な時間を反映しています。 私たちのシステムでは各ステップの寄与を評価することはできませんが、結果は、完全な一連の反応が比較的短く一貫した期間内に達成されることを示しています。

次に、最初にタイムラプスイメージング（5分/フレーム）を実行して、接合接合細胞におけるプラスミド複製のタイミング（つまり、プラスミドコピーの複製と視覚的分離）を調べました（図2b）。 ssDNA から dsDNA への変換と最初のプラスミド複製イベント (1 つから 2 つの mCh-ParB 病巣) までの期間は平均 10.4 ± 4.7 分 (n = 158)、同様に 10.1 ± 5.1 分 (n = 124) であると推定されます。最初と 2 番目の重複イベントの間 (2 から 3 または 4 つの mCh-ParB 病巣) (図 2f)。 次に、接合接合体におけるプラスミド重複の割合を、栄養増殖する F 保有ドナー株におけるプラスミド重複の割合と比較することにしました。 これを行うために、接合接合体におけるssからdsDNAへの変換（mCh焦点の出現）から細胞分裂まで、およびF保有ドナー細胞における細胞の誕生から細胞分裂まで、細胞あたりのプラスミド焦点の数をプロットしました（図2g）。 結果は、接合接合細胞では、栄養増殖する F 保有細胞よりも細胞あたりの F 数が大幅に速く増加する (適合曲線の傾きが 75% 増加) ものの、以前と同様の最終数である細胞あたり約 4 ± 1 コピーに達していないことが示されています。分割（図2g）。 F コピー数は、染色体の複製と同様に、細胞周期の進行によって制御されることが知られており、起点あたりの質量が一定に達すると開始が起こります 64。 したがって、我々の観察は、単一のプラスミドコピーが任意の細胞周期段階にあるレシピエント細胞に到着すると、細胞塊当たりの特定のプラスミドコピー数が回復するまでプラスミド複製開始は抑制されないという解釈と一致する。 この加速されたプラスミド複製により、接合接合細胞の分裂前に F コピー数が急速に増加するため、プラスミド コピーの娘細胞への分離が促進されます。

局在解析により、ss から dsDNA への変換と最初の複製イベントが異なる細胞内位置で発生することが明らかになりました。 最初の mCh-ParB 焦点は、ssDNA の侵入位置に相当する接合接合細胞の極領域に優先的に現れます (図 2h と図 1c、および図 S3b と図 S2a を比較)。 顕著な違いは、mCh-ParB病巣が周囲より少なく見えることであり、これはそれらがSsb-Ypet結合病巣ほど細胞膜に近くないことを示しています（図2hと図1c、および図S3cと図S2bを比較）。 その後、mCh-ParB焦点が複製前に中央細胞の位置に移動することが観察されます（図2hおよび図S3b、c）。 これらのデータは、プラスミドのプロセシングに関与する 2 つの DNA 合成反応 (つまり、ss から dsDNA への変換とプラスミドの複製) が、新しい宿主細胞では時間と空間において分離されていることを示しています。 相補鎖合成機構の動員と ss から dsDNA への複製反応は ssDNA プラスミドの侵入極性位置付近で起こり、プラスミドの複製は細胞中央領域で起こります。 まとめると、これらの分析は、プラスミドのプロセシング段階（ssDNAの侵入、ssからdsDNAへの変換、およびプラスミドの複製）が新しい宿主細胞内の特定の細胞内位置で起こり、正確な年代順に従うことを明らかにしています。

我々は、F プラスミドの異なる機能領域に位置するいくつかの遺伝子の 3' 末端にスーパーフォルダー gfp (sfgfp) 翻訳融合体を構築し、接合接合細胞におけるプラスミドにコードされたタンパク質の産生タイミングを調べました。プラスミド遺伝子発現の変化（図3aおよび図S4a）。 ygfA、ygeA、psiB、yfjB、yfjA、ssbF 遺伝子は先頭領域に位置し、転移起点 oriT の後に順番に転移します。 sopB 遺伝子は SopABC 分割システムの一部であり、維持領域に位置します。 traM、traC、traS、および traT 遺伝子は、プラスミド導入に関与する因子をコードする tra 領域に位置しています。 TraM は、oriT65 に動員されるリラキソソーム複合体のアクセサリー タンパク質です。 TraC は、T4SS66 の細胞質面にドッキングされた二量体の六量体として組織化されたトラフィック ATPase です。 TraS および TraT は、自己伝達から保護する F プラスミド排除 (免疫) システムに対応します 67,68,69。

a 108 kb F プラスミドの遺伝子地図。リーディング (緑)、Tra (赤)、およびメンテナンス (青) 領域、および研究対象の遺伝子 (三角形) の位置を示します。 星印は、PlacIQ1sfgfp 挿入の遺伝的位置を表します。 b mCh-ParBフォーカスの出現（0分）を反映したssからdsDNAへの変換のタイミングに関する、接合接合細胞における各プラスミドにコードされたタンパク質融合体の生成タイミングの概要図。 この図は、図S5のsfGFPシグナルの増加倍数からのデータを表しています。 オレンジ/緑、青、赤の色は、それぞれリーディング領域、維持領域、転移領域からのタンパク質の生成に対応します。 repE-sopA (repE)、tnpA-ybaA (tnpA)、および traM-traJ (traM) の遺伝子間領域に挿入された PlacIQ1 プロモーターからの細胞質 sfGFP 産生のタイミングを灰色で示します。 分析された少なくとも 3 つの生物学的複製からの個々の接合接合細胞の数 (n) が示されています。 c 図S5の最大SNR値での、栄養増殖中のドナー（左）および接合接合細胞（右）内の各sfGFP融合体およびレポーターの細胞内緑色蛍光（SNR）を示すジッタープロット。 各ドットは個々のセルのデータを表します。 平均値と SD は、少なくとも 3 つの独立した生物学的複製からの接合接合細胞の指定された (n=) 数から計算されます。 F 誘導体のドナー (表 S1 を参照)、レシピエント (LY358)。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

まず、ドナー細胞とレシピエント細胞を混合した1、2、4、6時間後に接合集団の顕微鏡スナップショット画像を取得する経時実験を実行しました。 各時点で、接合接合体の頻度 (T/R + T) を、拡散 mCh-ParB 蛍光 (R) を示すレシピエント細胞、または mCh-ParB 病巣を有する接合接合体細胞 (T) の割合から単一細胞レベルで直接測定しました。 ）、細胞内の緑色蛍光シグナル対ノイズ比（SNR）が自動的に測定されました（図S4b-d）。 このスナップショット分析は、sfGFP 融合体を保持するすべての F プラスミド誘導体がその転移能力を保持し、6 時間の交配後に 57 ～ 95% の間の接合接合体の頻度をもたらしたことを示しています。 また、融合体を保持するプラスミドの取得の後には、接合接合細胞における sfGFP シグナルの増加が系統的に続き、タイミングとレベルは非常に多様です（図 S4b-d）。

マイクロ流体チャンバー内で行われる結合の微速度撮影イメージングを使用すると、個々の接合接合細胞における ss から dsDNA への変換 (mCh-ParB 焦点の出現) に関する sfGFP 融合の産生レベルとタイミングのより優れた解像度が得られました (動画) S1、S2)。 接合接合細胞の検出と細胞内sfGFP SNR細胞の定量化を経時的に実行しました（図S5a〜d）。 接合接合細胞が分裂すると、得られた娘細胞の蛍光定量を継続して、sfGFP 産生を長期間監視しました。 この生データから、10分間隔あたりのSNRの増加倍数を計算しました。1倍以上の増加倍数は、接合接合体で融合が生成していることを示しています（図S5a〜d）。 これらのデータは最終的に、ss から dsDNA への変換イベントと比較した、接合接合細胞における各融合体の生成時間ウィンドウを示す包括的な図に変換されました (図 3b)。 この分析により、異なるプラスミド領域に属する融合体は、プラスミド処理ステップに関して特定の生成タイミングを示すことが明らかになりました。

注目すべきことに、mCh-ParB焦点が出現する前であっても、主要なYgeA、PsiB、YfjB、YfjA、およびSsbF融合タンパク質の同期産生が検出されます（図3bおよび図S5a）。 さらに、これらの融合の生成は、ss から dsDNA への変換イベント後、約 5 分でピークに達し、25 ～ 35 分で停止するため、一時的なものにすぎません。 この予期せぬ観察は、プラスミドがまだ ssDNA 形式にあるときに主要な融合が生成され始め、プラスミドが dsDNA 形式に変換された後は急速に停止することを示しています。 興味深い例外は YgfA-sfGFP で、その産生は mCh-ParB 焦点の出現後の 10 ～ 20 分間隔でのみ検出されます。 ygfA 遺伝子は oriT に最も近いため、レシピエントに導入される最初の遺伝子です (図 3a および図 S4a)。 しかし、ygfA 遺伝子の配向は他の試験済みの主要遺伝子とは逆であり、T 鎖が ygfA 転写の鋳型鎖に対応しないことを意味します。 したがって、我々の観察と一致して、ygfA の発現は、ss から dsDNA への変換によって相補的な鋳型鎖を合成した後にのみ起こります。

ssからdsDNAへの変換の後に、SopBとTraMから始まり、次にTraC、そして最終的にはTraSとTraTの融合という、維持タンパク質とTraタンパク質の生成が続きます（図3bおよび図S5b、c）。 対応する遺伝子は dsDNA プロモーター (sopB の場合は PsopAB、traM の場合は PM、traC および traST の場合は PY) によって制御されることが知られているため、これらの融合体の生成には dsDNA 形式のプラスミドの存在が必要であると予想されます。 しかし、観察された生産タイミングの違いは何で説明できるでしょうか? 私たちは、タイミングの不一致が F プラスミドの遺伝子地図上の融合の位置を単純に説明できるかどうかを検討しました。 この可能性は、構成的蛍光レポーター PlacIQ1sfGFP (PlacIQ1 構成的プロモーターの制御下にある sfgfp 遺伝子) を repE-sopA、tnpA-ybaA、および traM-traJ 遺伝子間領域に挿入すると、sfGFP 産生タイミングが同様になるという観察によって除外されました。 mCh-ParB焦点の出現後の0〜10分の間隔（図3bおよび図S5d）。 その代わりに、我々は、maintenance 遺伝子と tra 遺伝子の異なる産生タイミングが、対応する遺伝子のプロモーターの活性と制御を反映していると提案します。 sopAB オペロンは PsopAB プロモーターの制御下にあり、SopA 結合によって抑制されます。 したがって、PsopAB プロモーターは、SopA を欠く接合接合細胞において完全に抑制されておらず活性であると予想され、したがって細胞分裂におけるプラスミドの安定性と継承に必要な SopAB 分配複合体の迅速な産生が可能になります。 traM 遺伝子は PM プロモーターによって制御されており、TraY タンパク質との結合によって完全に活性化される前でも、弱いながらも恒常的に活性化されています 70。 対照的に、traC、traS、traT 遺伝子の発現を制御する PY プロモーターは、独自のプロモーター PJ の制御下で traJ 遺伝子によってコードされ、PY4 の上流に位置する TraJ タンパク質によって活性化される必要があります。 この活性化カスケードの要件は、おそらく、TraC、TraS、および TraT の生成の遅れを説明します。 TraC と TraS/TraT 融合体生成間のさらなる遅延は、これらの遺伝子の PY プロモーターに対する相対距離 (traC では 5.9 kb、traST では 20.4 kb) を反映している可能性があります。 F プラスミドは、FinOP 受胎能阻害システムの finO 遺伝子に IS3 挿入配列の天然に存在する挿入を持ち、これにより tra 遺伝子の上方制御と構成的発現がもたらされることを強調することが重要です 71。 したがって、FinOP 制御システムが依然として活性である他の IncF プラスミドは、ここで報告されているものとは異なるタイミングと Tra タンパク質の産生レベルを示すことが予想されます。

注目すべきことに、接合接合細胞内のTraタンパク質の細胞内レベルは、ssからdsDNAへの変換後60〜90分でプラトーに達し、観察全体を通して安定したままです（図3bおよび図S5c）。 これには、その時点で接合接合細胞が転移機構と排除システムを生成し、おそらく熟練したプラスミドドナーに変換されていることが含まれます。 この解釈を裏付けるように、TraM、TraC、TraS、TraTおよびSopBは、栄養増殖中のFを保有するドナー細胞において同様のレベルで検出される（図3cおよび図S4c、d、S5b、c）。 これは、YgeA、PsiB、YfjB、YfjA、および SsbF の主要タンパク質には当てはまりません。これらの細胞内レベルは、接合接合体における ss から dsDNA への変換後 25 ～ 35 分で減少し始めますが、栄養生長するドナー細胞では検出されません。図３ｃおよび図Ｓ４ｂ、Ｓ５ａ）。 これらの結果は、主要なタンパク質はレシピエント細胞への ssDNA プラスミドの侵入時に迅速かつ一時的にのみ生成され、栄養複製中にプラスミドが dsDNA 形態で維持されている場合には生成されないという解釈と一致します。

以前の研究 37、38、54、56 と合わせて、接合接合細胞における主要遺伝子の初期および一過性の発現は、内部移行した ssDNA プラスミドからの主要遺伝子の転写を開始する一本鎖プロモーターとして機能する特定の配列の存在を裏付けています。 バイオインフォマティクス分析を使用して、ssbF、yfjA、yfjB、psiA、および psiB 遺伝子の上流領域を特定しました。これを Frpo2 と名付けました。これは、以前に報告された ygeA および ygeB 上流に位置し、以前に特徴付けられていた Frpo 領域 (Frpo1 と改名されました) と 92% の同一性を共有します。 in vitro 55 (図 4a)。 mFold (http://www.unafold.org) を使用した DNA フォールディング予測は、Frpo2 の一本鎖形態が、Frpo1 と同様に標準的な -10 および -35 ボックスも保持する非常に安定なステム ループ構造に折りたたまれることができることを示しています。領域（図S6a）55。 我々は、生細胞顕微鏡を使用して、接合接合細胞における下流遺伝子の発現に対するFrpo1またはFrpo2の欠失の影響に取り組みました。 F ΔFrpo1 ygeA-sfgfp、F ΔFrpo2 ssbF-sfgfp、または F ΔFrpo2 yjfA-sfgfp を投与された接合接合体細胞の顕微鏡分析では、接合接合体細胞における ss から dsDNA への変換の前後で sfGFP 蛍光の有意な増加倍数が確認されませんでした。 (図4b)。

a遺伝子（研究されたsfGFP融合体は緑色、他の遺伝子は白色）およびFrpo1およびFrpo2プロモーター（赤色）の位置を示すリーディング領域の遺伝子地図（上）。 下の図は、Frpo1およびFrpo2配列のssDNA形態によって形成されたステムループ構造を示しています（図S6に詳細を示します）。 b F ΔFrpo1 ygeA-sfgfp、F ΔFrpo2 ssb-sfgfp、およびF ΔFrpo2 yfjA-sfgfpの取得後の接合接合体における細胞内sfGFP増加倍数のヒストグラム。 平均値と SD は、少なくとも 3 つの独立した実験から分析された、示された (n) 個の接合接合細胞から計算されます。 図S5aのFwtプラスミドで得られたレベルは、基準として緑色で報告されています。 F ΔFrpo1 ygeA-sfgfp (LY1368)、F ΔFrpo2 ssb-sfgfp (LY1365)、F ΔFrpo2 yfjA-sfgfp (LY1364) のドナーとレシピエント (LY318)。 c Fwt、欠失変異体F ΔFrpo1、F ΔygeA、F ΔFrpo1 ΔygeA、F ΔFrpo1 ΔygeAB、FΔFrpo2、およびFΔssbFのヒストグラム。プレーティングアッセイによって推定された接合接合体の頻度（T / R + T）。 平均値と SD は 3 つの独立した実験から計算されます (個々の黒い点として示されています)。 P 値の有意性 ns および ****P ≤ 0.0001 は、ダネットの多重比較検定を使用した一元配置分散分析から得られました。 Fwt (LY875)、F ΔFrpo1 (LY824)、F ΔygeA (LY160)、F ΔFrpo1 ΔygeA (LY1424)、F ΔFrpo1 ΔygeAB (LY1425)、F ΔFrpo2 (LY823)、F ΔssbF (LY755)、レシピエント (MS428) のドナー。 d FΔssbFプラスミドを受け取る接合接合細胞（0分）におけるmCh-ParB焦点形成に関するSsb-Ypet焦点の出現（青線）およびmCh-ParB焦点の最初の重複（赤線）の単一細胞タイムラプス定量化。 5 つの独立した生物学的複製から分析された結合イベントの数 (n) が示されています。 Fwtプラスミドを使用して図2bで得られた結果は、比較のために灰色で報告されています。 e F ΔssbF プラスミドの取得後の接合接合細胞における Ssb-Ypet 焦点の出現と mCh-ParB 焦点の出現の間の時間差を示す散布図。 5 つの生物学的複製からの (n) 個の ss から dsDNA への変換イベント (青い丸) から計算された平均値と SD が示されています。 P値の有意性ns（>0.05非有意）は、Fwtプラスミドで得られた結果に対するマン・ホイットニーの両側統計検定から得られました（図2e）。 f F ΔssbF プラスミドの取得後の接合接合細胞における mCh-ParB 焦点の出現と 2 つの焦点 (最初の複製) および 3 つまたは 4 つの焦点 (2 番目の複製) におけるその視覚的複製の間のタイムラグを示す散布図。 8つの生物学的複製からの(n)個の個々の重複イベント(赤丸)から計算された平均およびSDが示されています。 P 値の有意性 **P = 0.0023 および ***P = 0.0007 は、Fwt プラスミドで得られた結果に対するマン・ホイットニー両側統計検定から得られました（図 2f）。 ドナー F ΔssbF (LY1068)、レシピエント (LY358)。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

次に、プレーティングアッセイによって推定された、3時間の交配後の接合効率に対するFrpo1およびFrpo2の欠失の影響に取り組みました（図4c）。 F ΔFrpo1 は、Fwt の 92.6 ± 6.6% と比較して、25.2 ± 2.9% という有意に減少した接合接合体の頻度を示します。 同等の結果が、F ΔFrpo1 ΔygeAB (32.7 ± 7.1) および F ΔFrpo1 ΔygeA (14.5 ± 0.4) について得られました。 驚くべきことに、ygeA を 1 つ欠失させると結合効率がさらに低下し (3.9 ± 1.9%)、我々が何度も試みたにもかかわらず、ygeB のみを欠失させることは決して構築できませんでした。 対照的に、Frpo2 または ssbF の欠失は結合効率に大きな影響を与えません。 これらの結果は、インビボでの結合中にレシピエント細胞にプラスミドが侵入した際の下流遺伝子の初期発現には、Frpo1 および Frpo2 が必要であることを示しています。 しかし、Frpo1 の制御下にある遺伝子は、Frpo2 の制御下にある遺伝子よりも結合においてより重要な役割を果たしているようです。

プラスミド侵入時の主要な遺伝子の急速かつ一過性の発現は、新しい宿主細胞におけるプラスミド確立の初期段階において主要なタンパク質が重要な役割を担っていることを強く示唆している。 さまざまな腸内細菌プラスミドに保存されているリーディング領域は、大腸菌染色体上にコードされている一本鎖結合タンパク質 Ssb の相同体をコードしています41、43、54、72、73、74。 染色体にコードされた ssb 遺伝子は保存されており、すべての細菌生物において必須であるため、プラスミドから生じる ssb ホモログの存在意義について疑問が生じています。 初期の研究では、F プラスミドによってコードされる SsbF が染色体 ssb 遺伝子の条件変異を部分的に補完できることが示されています 73,75。 一貫して、pTrc99a-ssbF-mchプラスミドから生成されたSsbF-mChと染色体にコードされたSsb-Ypet（図S7a）の同時視覚化を実行し、共局在分析によって確認された同様の細胞内位置（図S7b）を観察しました（図S7c）。 。 これは、プラスミド SsbF と宿主 Ssb の両方が、栄養増殖する細胞の複製フォークに続く ssDNA にリクルートされることを示しています。 同様に、SsbF-sfGFPも、主に最初と2回目のプラスミド複製イベント中に、F ssbF-sfgfp プラスミドを獲得した接合接合細胞に病巣を形成します（図S7d、e）。 それにもかかわらず、結合中のSsbFの役割はまだ不明であり、FプラスミドからのSsbFの欠失は結合効率に大きな影響を与えません（図4c）。

結合中の SsbF の役割についてさらに洞察を得るために、F ΔssbF プラスミドの ssDNA 侵入、ss から dsDNA への変換、および複製の動態を再検討しました。 微速度顕微鏡画像分析により、SsbF欠失がSsb-Ypet接合焦点の動態（図4d）またはssからdsDNAへの変換のタイミング（図4eと図2eを比較）に影響を及ぼさないことが明らかになりました。 しかし、SsbF欠失は、接合接合細胞におけるプラスミド複製のタイミングを劇的に遅延させる(図4fと図2fを比較)。 mCh-ParB の出現と最初の複製の間のタイムラグは約 58% 増加し (Fwt の 10.4 ± 4.7 から F ΔssbF の 16.4 ± 9.5 へ)、最初と 2 番目のプラスミド複製イベントの間の時間は約 29% 増加します。 % (Fwt の 10.1 ± 4.7 から F ΔssbF の 13 ± 8)。 これは、SsbF が、おそらく DNA 複製に利用できる一本鎖結合タンパク質の細胞プールを増加させることにより、新しい接合接合細胞におけるプラスミド複製の最初のラウンドを促進する役割があることを示しています。 SsbF が存在しないとプラスミド複製が遅延しますが、少なくとも大腸菌 MG1655 株間で結合が最適な条件で行われる場合には結合の最終効率には影響しないため、この機能は不要であると思われます。

結合に関する我々の現在の知識は主に、DNA転移に関与する分子反応と因子について十分に文書化された理解を提供する実験的な遺伝的、生化学的、構造的研究から得られている一方、ゲノム研究と計算的研究により結合プラスミドの多様性と疫学におけるそれらの重要性が明らかになっている。抗生物質耐性の蔓延。 光学顕微鏡の応用により、細胞スケールでの結合の組織化に関する洞察が得られるようになったのはつい最近のことです58,59,76,77,78,79,80,81,82。 この研究では、生細胞顕微鏡法と特別に開発された蛍光レポーターを組み合わせることにより、結合の細胞動態に関する独自のビューを提供すると同時に、各重要なステップのタイミングと局在化についての洞察を提供します。

我々は、プラスミド導入中にドナー側とレシピエント側の両方に ssDNA プラスミドが存在することを報告します。 注目すべきことに、ssDNA プラスミドはランダムに配置されているのではなく、接合対細胞内の特定の細胞内位置に割り当てられています。 ssDNA F プラスミドの出口点は、ドナー細胞の側に、優先的に 4 分の 1 の位置に位置します。 このパターンは、F プラスミドの T4SS 機構の細胞内位置を反映している可能性がありますが、我々の知る限りでは、まだ解明されていません。 pTi および R388 プラスミドの場合のように、F プラスミド T4SS 機構が細胞の周囲全体に均一に位置している場合、この可能性は弱まるでしょう 79,81。 あるいは、活性な結合細孔の側方局在は、同様に 4 分の 1 の位置に位置し、細胞極から除外されている F プラスミド分子へのアクセスの促進を反映している可能性があります 83,84。 対照的に、ssDNA は主にレシピエント細胞の極領域に入ります。 これは、レシピエントの表面の極がドナーの線毛の好ましい位置であることを示唆している可能性があります。 嵌合ペアの取り付けまたは安定化。 後者の可能性は、F結合中の接合ペアの安定化にドナー細胞の表面に露出したプラスミドタンパク質TraNとレシピエント細胞の宿主外膜タンパク質OmpAの間の相互作用が関与しているという事実によって強化される82,85。 OmpA は大腸菌細胞の極領域に豊富に存在し、移動性が低いことが示されており 86、おそらくこの位置での接合ペアと接合細孔の安定化に有利に働いていると考えられます。

ssDNA が最初にレシピエント細胞に出現し、その後結合中にドナー細胞に蓄積するという予想外の発見も、TraI の活性と、T4SS または非細胞の RCR を介した T 鎖の転移とのその調整についての洞察を提供します。転送されたストランド。 DNA転移の開始前に、プラスミドのoriTに結合したリラキソソームはTraDカップリングタンパク質によってT4SSにドッキングされ、開始前複合体を形成します（図5a（i））。 受容細胞との接触は、開始前複合体を活性化するシグナルを誘導するために提案されている。 我々は、ドナー内にssDNAが存在しない一方で、T鎖の一部がすでにレシピエント細胞に移入されている短い期間の存在を明らかにしました（図5a(ii)。この段階では、ドナーにはssDNAが存在しません。これは、TraI によって生成されたすべての ssDNA が、T4SS を介した T 鎖の転移と RCR による非転移 ssDNA 鎖の相補の両方によって除去されたことを意味します。この一時的なステップの後、ssDNA もドナーに蓄積します。これは、ssDNAが、転移およびRCR合成によって除去されるよりも速く、ドナーにおけるTraIヘリカーゼ活性によって生成されることを示唆している(図5a(iii))。

a(i) 結合の開始前に、プラスミドの転移起点に結合した開始前複合体が IV 型分泌系 (T4SS) にドッキングされます。 (ii) 接合ペアの確立により、開始前複合体を活性化するシグナルが伝達されます。 TraI のヘリカーゼ活性による dsDNA プラスミドの巻き戻しにより、T 鎖の最初のセグメントが生成され、これは直ちにレシピエント細胞に転移され、そこで Ssb 分子が動員されますが、転移されなかった鎖はローリングサークル複製によって補完されます ( RCR）をドナーセルに注入します。 (iii) TraI のヘリカーゼ活性は、T 鎖が T4SS を介して転移するか、非転移鎖が RCR によって補完されるよりも高い速度で ssDNA を生成し、その結果、ドナー内に Ssb 分子でコーティングされた ssDNA プラスミドが蓄積します。細胞。 b ssDNA プラスミドがレシピエント細胞に侵入すると、Frpo1 および Frpo2 のリーディング配列がステムループ構造を形成し、下流のリーディング遺伝子の転写を開始するプロモーターとして機能し、リーディングタンパク質が迅速に生成されます。 その後の ss から dsDNA への変換により、Frpo1 と Frpo2 が不活性化され、従来の dsDNA プロモーターの制御下で他のプラスミド遺伝子の発現が許可されます。 維持タンパク質、転移タンパク質、およびその他のプラスミドにコードされたタンパク質の産生は、最終的に接合接合細胞による新しい機能の発達をもたらします。

接合接合体における Ssb-Ypet 焦点の寿命 2.9 ± 1.1 分が、108,000 nt ssDNA F プラスミドの内部移行を完了するのに必要な時間を反映していると仮定すると、転移速度は 620 ± 164 nt s-1 と計算されました。 これは、4.6 Mb の大腸菌染色体全体を転移するのに必要な 100 分から推定される過去の 770 nt s-1 速度と合理的に一致しています 87。 さらに、RCR 中の DNA ポリメラーゼ III ホロ酵素による DNA 合成速度は 650 ～ 750 nuc s-1 88 と推定されました。比較すると、TraI ヘリカーゼ活性の速度は 1120 ± 160 bp s-189 と測定されました。 これらの推定値は、ドナーにおける ssDNA の蓄積が、T 鎖プラスミド転移または RCR の速度よりも速い TraI ヘリカーゼ活性の速度を説明しているという見解を裏付けています。 したがって、以前に示唆されたものの実証されたことのない提案とは対照的に、リラクサーゼのヘリカーゼ活性は、T4SS を介した DNA 転座の活性と厳密には結びついていない可能性があります。

図5bに要約されているように、生細胞顕微鏡検査により、全体的な年代学的な結合ステップが明らかになります。 ssDNA プラスミドの挿入と dsDNA への変換は平均約 4 分で完了するため、接合接合細胞におけるプラスミドの処理は比較的迅速なプロセスです。 最も重要なことは、ss から dsDNA への変換イベントは、プラスミド遺伝子発現のプログラムを決定する極めて重要なイベントであるということです。 主要な遺伝子は、最初にレシピエント細胞に入り、F プラスミドから ssDNA 形式で最初に発現されます。 以前の提案 55、56、57 と一致して、我々は、主要な遺伝子の初期発現が、プラスミドがまだ ssDNA 形態にあるときに一本鎖プロモーターとして機能する配列に依存することを示します。 Frpo1について前述したように、今回同定された相同性の高いFrpo2配列は、-35および-10のコンセンサスボックスを再構成する安定なステムループ構造に折り畳まれ、転写開始をもたらすと考えられる。

ss から dsDNA への変換では、Frpo1 および Frpo2 プロモーターを不活化することで主要なタンパク質の生成がオフになるため、主要な遺伝子の発現も一時的になります。一方、維持遺伝子、転移遺伝子、およびその他のプラスミド遺伝子の発現は、従来の dsDNA プロモーターの制御下でライセンスされ、多くの場合、独自のプロモーターの影響を受けます。規制の特殊性。 接合接合体内の維持および転移タンパク質レベルは、タンパク質に応じて約 30 ～ 90 分で栄養増殖する F 含有細胞と同等の定常状態に達します。 興味深いことに、我々の以前の研究では、F プラスミドの遺伝子間領域 ybdB-ybfA に挿入された Tn10 トランスポゾンによってコードされるテトラサイクリン耐性因子も、ss から dsDNA への変換直後に産生され、約 90 分以内に耐性細胞のレベルに達することが示されました 58。 これらの発見は、この時間スケールが、プラスミドの維持、接合能力、自己転移に対する免疫、およびプラスミドによって潜在的に保持される追加の耐性を含む、プラスミドにコードされた機能を獲得するために接合接合細胞に必要な期間に相当することを一貫して示している。

プラスミドプロセシングによるプラスミド遺伝子発現の制御は、接合接合細胞内でのプラスミドタンパク質の連続的かつタイムリーな産生を確実にし、特に、ssDNA プラスミドの導入後の狭い時間枠内で主要因子の産生を制限するための優れた方法です。 ただし、de novo タンパク質合成は、接合接合体細胞にプラスミドにコードされたタンパク質を提供する唯一の方法ではない可能性があります。 Al Mamun らによる最近の研究。 らは、F 様プラスミド pED208 (IncFV) の転移が、TraI、ParA、ParB1、Ssb ホモログ SsbED208、ParB2、PsiB および PsiA90 を含むいくつかのプラスミドにコードされるタンパク質の転移と同時に起こることを報告しています。 タンパク質の転座は、高感度Creリコンビナーゼアッセイを使用して、低頻度で検出されました(交配の1〜5時間の間にドナー細胞あたり10-5組換え体)。 タンパク質の転座は、天然の F プラスミドの転移中にも起こる可能性がありますが、我々の観察だけでは説明できません。 実際、我々の顕微鏡分析では、YgeA、PsiB、YfjB、YfjA、およびSsbFの主要融合体がドナー細胞では顕微鏡の検出閾値を下回っているが、すべての接合接合細胞では有意な細胞内レベルで定量化されていることが示されています。 これは、接合接合細胞で観察される主要なタンパク質の量がドナー細胞に由来するものだけではなく、Frpo1 および Frpo2 配列に依存する新たなタンパク質合成の結果であることを意味します。 したがって、タンパク質の直接転座と新規合成は、接合接合細胞への ssDNA プラスミドの侵入直後に主要な因子と関連機能の存在を確実にする付随機構であると考えられます。 これは、結合における主要領域の重要な役割をさらに示唆しています。 いくつかの要素がこの見解をサポートしています。 先頭領域は、さまざまな接合プラスミドで保存されています41、42、43、44、45、46。 さらに、リラクサーゼを系統発生マーカーとして使用して MOBF プラスミドとして分類される幅広い不適合性グループ (IncF、IncN、IncP9、および IncW) に属するプラスミドの主要領域が、CRISPR-Cas システムの優先的な標的であることが報告されています。活用8,91,92。 最近、このリーディング領域が、pESBL (IncI) プラスミド 93 の普及のための重要な進化的標的であることが示されました。 F プラスミドに関しては、Frpo1 と Frpo2 はヌクレオチド レベルで 92% の類似性を共有し、わずか約 5 kb しか離れていないことを強調できます。 これは、栄養プラスミド複製中に dsDNA 形式である場合、Frpo1 および Frpo2 配列が相同組換えの潜在的な基質となり、介在セグメントの欠失が生じることを意味します。 しかし、介在するセグメントは、R1 プラスミド 94 の hok/sok 毒素-抗毒素システムの機能的相同体である flmAB 遺伝子を保持しており、これにより先頭領域の安定性が保護されると考えられます。

この一連の証拠にもかかわらず、ほとんどの主要なタンパク質の分子機能がまだ不明であるため、主要な領域の重要性を合理的に説明することは現在困難です。 我々のデータは、Frpo1 の下流の遺伝子 (ygeA et ygeB) が結合において重要な機能を持っていることを示しています。 対照的に、Frpo2、ssbF、または psiB44 の欠失はプレーティングアッセイによって対処される全体的な結合効率に重大な影響を及ぼさないため、Frpo2 下流に位置する遺伝子 (ssbF、yfjA、yfjB、psiB、psiA、および flmC) は不要であると思われます。 しかし、SsbF と PsiB は、接合接合細胞における接合誘発 SOS 誘導を抑制することが示されており 43,54,90、これはプラスミド導入そのものよりもむしろ接合接合体の生理機能と増殖にとって重要である可能性が高い。 結合研究の潜在的な制限の 1 つは、伝達効率アッセイが通常、最適な培地および温度条件で同一または密接に関連した細菌株間で実行されることです。 これは、厳密には必須ではないが、接合を促進または最適化する、または接合接合細胞の増殖を助ける可能性がある遺伝子の役割を損なう可能性があります。 したがって、主要な要因の重要性は、系統発生的に離れた細菌間、または進化のスケールで、それほど好ましくない条件で最もよく明らかになる可能性があります。 一方、リアルタイム顕微鏡検査は、生細胞における結合の順序に対するこれらの遺伝子の潜在的な微妙な影響を明らかにするのに役立つ可能性があります。

細菌株を表S1に、プラスミドを表S2に、オリゴヌクレオチドを表S3に示します。 蛍光タグと遺伝子の融合および F プラスミド上の遺伝子欠失には、λRed 組換えが使用されました 95,96。 修飾された F プラスミドをコンジュゲーションによってバックグラウンド株 K12 MG1655 に移しました。 F プラスミド上の複数の遺伝子改変が必要な場合、プラスミド pCP2095 からの Flp リコンビナーゼの発現によって誘導される部位特異的組換えを使用して、kan および cat 遺伝子を除去しました。 プラスミドのクローニングは、Gibson Assembly によって行われ、Sanger シークエンシング (Eurofins Genomics biotech) によって検証されました。 株およびプラスミドは、サンガー配列決定法 (Eurofins Genomics) によって検証されました。 細胞は、イメージング前にグルコース (0.2%) およびカザミノ酸 (0.4%) を補充した M9 培地 (M9-CASA) で 37 °C で増殖させ、結合効率アッセイでは Luria-Bertani (LB) ブロスで増殖させました。 必要に応じて、サプリメントは次の濃度で使用されました。 アンピシリン (Ap) 100 μg/ml、クロラムフェニコール (Cm) 20 μg/ml、カナマイシン (Kn) 50 μg/ml、ストレプトマイシン (St) 20 μg/ml、およびテトラサイクリン (Tc) 10 μg/ml。

レシピエントおよびドナー細胞のLB中での一晩培養物をA600が0.05になるまで希釈し、A600が0.7〜0.9に達するまで増殖させた。 25μlのドナー培養物と75μlのレシピエント培養物をエッペンドルフチューブ中で混合し、37℃で90分間インキュベートした。 約 1 ml の LB をゆっくりと加え、チューブを再度 37 °C で 90 分間インキュベートしました。 コンジュゲーション混合物をボルテックスし、段階希釈し、適切な抗生物質を補充した LB 寒天 X-gal 40 μg/ml IPTG 20 μM 上にプレーティングして、レシピエントまたはドナー集団を選択しました。 次に、レシピエント（R）コロニーを、テトラサイクリン10μg/mlを含むLB寒天上に播種して画線培養し、接合完了体（T）を選択し、接合接合体の頻度を（T / R + T）から計算しました。図4cに示します。

M9-CASA での一晩培養物を A600 が 0.05 になるまで希釈し、A600 = 0.8 に達するまで増殖させました。 結合サンプルは、25μlのドナーと75μlのレシピエントをエッペンドルフチューブ中で混合することによって得た。 微速度撮影実験の場合、50 μl の純粋培養または結合混合物を B04A マイクロ流体チャンバー (ONIX、CellASIC®)97 にロードしました。 栄養供給は 1 psi に維持され、イメージング プロセス全体を通じて温度は 37 °C に維持されました。 細胞は、90 ～ 120 分間、1 分または 5 分ごとに画像化されました。 スナップショットイメージングの場合、クローン培養または結合混合物の 10 μl サンプルをスライド 98 上の M9-CASA 1% アガロースパッド上にスポットし、直接イメージングしました。

従来の広視野蛍光顕微鏡イメージングは​​、x100/1.45 オイル Plan Apo ラムダ位相対物レンズ、ORCA-Fusion デジタル CMOS カメラ (浜松) を備え、画像取得に NIS ソフトウェアを使用した Eclipse Ti2-E 顕微鏡 (Nikon) で実行されました。 。 取得は、488 および 560 nm の励起波長で Fluo LED Spectra X 光源の 50% 出力を使用して実行されました。 露光設定は、Ypet、sfGFP、および mCherry の場合は 100 ミリ秒、位相コントラストの場合は 50 ミリ秒でした。

定量的画像分析は、MicrobeJ plugin99 を備えた Fiji ソフトウェアを使用して行われました。 スナップショット分析では、細胞の輪郭検出は MicrobeJ を使用して自動的に実行され、手動編集インターフェイスを使用して検証されました。 タイムラプス実験の場合、細胞の検出は手動編集インターフェイスを使用して半自動で行われ、モニタリングする細胞を選択し、細胞の輪郭を自動的に検出できます。 接合集団内では、MicrobeJ の「タイプ」オプションを使用して、ドナー (mCh-ParB シグナルなし)、レシピエント (拡散 mCh-ParB シグナル)、または接合接合体 (mCh-ParB 病巣) のカテゴリーが割り当てられました。 レシピエント細胞は、ドナーで検出された細胞の自己蛍光バックグラウンドレベルを超える赤色蛍光の存在に基づいて検出されました。 これらのレシピエント細胞のうち、接合接合体は、MicrobeJ による ParB 蛍光焦点の自動検出 (Maxima 検出) を実行することによって同定されました。 このアプローチは、ドナーおよびレシピエント細胞内の Ssb-Ypet または sfGFP 融合の有無とは無関係に使用されました。 さまざまな細胞タイプ内で、平均蛍光強度 (au)、歪度、シグナル/ノイズ比 (SNR)、または細胞長 (μm) パラメーターが MicrobeJ を使用して自動的に抽出され、プロットされました。 SNR は比 (平均細胞内シグナル/平均ノイズシグナル) に対応します。ここで、平均細胞内シグナルは細胞面積あたりの蛍光シグナルであり、ノイズは細胞の外側で測定されたシグナル (周囲の媒体によって発せられる蛍光により) です。 細胞あたりの蛍光の総量は細胞のサイズ/年齢に依存し、バックグラウンドの原因となるのとは対照的に、SNR 定量的推定は、経時的な細胞内蛍光の不偏定量化により適しています。 MicrobeJ Maxima 検出機能を使用して Ssb-Ypet、SsbF-mCh、mCh-ParB 病巣を検出し、病巣の局在と蛍光強度を自動的に抽出してプロットしました。 タイムラプスデータを表すプロットは、対応する図の凡例に示されているように、接合接合細胞が接合性 Ssb-Ypet 焦点 (ssDNA 取得) または mCh-ParB 焦点 (ss から dsDNA への変換) を示す最初のフレームに位置合わせされました。 重要なことは、集団内での結合は非同期であるため、タイムラプス動画では DNA 転移の全シーケンス、つまり Ssb-Ypet フォーカスの出現/消失、mCh-ParB フォーカスの形成、最初と 2 回目の mCh-ParB 重複イベントが必ずしも捉えられるわけではありません。 注目すべきことに、1分/フレームのタイムラプスの使用は、mCh-ParB形成と比較したSsb-Ypetの出現/消失を分析するのに適していました（図2b〜e）が、mCh-ParBの漂白を引き起こしたため、mCh-ParBの分析が妨げられました長期にわたる重複イベント。 次に、5 分/フレームのタイムラプスを使用して、mCh-ParB 焦点形成と比較した mCh-ParB の最初と 2 番目の重複イベントを分析しました (図 2b、f)。 また、さまざまな伝達パラメータの特性評価は、特定の分析を使用して実行されました。 たとえば、タイムラグは、考慮された2つのイベント間のフレーム数を数えることによって計算されました（図2e、4eのSsb-Ypetの出現と消失;図2f、4fのmCh-ParB焦点の形成と最初または2番目の重複）。 対照的に、図1、2、および3は、 図２ｂ、４ｂは、各タイムラプスフレームにおけるＳｓｂ−ＹｐｅｔまたはｍＣｈ−ＰａｒＢ病巣の有無に注釈を付けることによって生成された。

P 値の有意性は、GraphPad Prism ソフトウェアで特定の統計検定を実行することによって分析されました。 定量的顕微鏡分析からの単一細胞データは、MicrobeJ インターフェイスから抽出され、GraphPad に転送されました。 単一細胞定量データの P 値の有意性は、対応のないノンパラメトリックなマン・ホイットニー両側統計検定を使用して実行されました。これにより、正規分布を仮定せずに独立したデータ グループ間の差異を比較できます。 プレーティングアッセイによって得られた接合接合体の頻度に対する P 値の有意性は、ダネットの多重比較検定を備えた一元配置分散分析 (ANOVA) を使用して評価されました。これにより、3 つ以上の独立した実験グループの平均間に観察された差の統計的有意性を決定できます。対照群の平均値（Fwtに相当）と比較します。 必要に応じて、P 値と有意性が図パネルおよび対応する凡例内に示されます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究の結論を理解し、評価するためのすべてのデータは、本文と補足情報で入手できます。 ソース データは、このペーパーのソース データ ファイルで提供されます。 生の顕微鏡データは Figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21206444) で入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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著者らは、株を提供してくれた National BioResource Project と Coli Genetic Stock Center、MicrobeJ の貴重な協力に対して A. Ducret、有益な議論に対して N. Fraikin に感謝します。 この研究は医学研究財団（CL および AC への助成金番号FRM-EQU202103012587）によって資金提供されました。 フランス国立研究庁、認可番号 ANR-18-CE35-0008 (CL、YY、および KG)。 また、CVCL への資金提供を通じてリヨン大学もシュルンベルジェ教育研究財団 (FSER 2019) を認めています。

分子微生物学および構造生化学 (MMSB)、リヨン第一大学、CNRS、Inserm、UMR5086、69007、リヨン、フランス

アガット・クチュリエ、クロエ・ヴィロール、ケリー・ゴールドラスト、アニック・バーン＝デデュー、オードリー・ロイター、ソフィー・ノリボス、サラ・ビゴー、クリスチャン・レスターリン

パリ・サクレー大学、CEA、CNRS、細胞統合生物学研究所 (I2BC)、91198、ギフ・シュル・イヴェット、フランス

Yoshiharu Yamaichi

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CL と SB は研究の実施を発案、設計、監督しました。 AC、CV、KG、AB-D.、AR、SN、SB が実験を実行し、データを分析しました。 CL と SB が論文を書き、CL が図を作成しました。 CLとYYが資金を提供した。

サラ・ビゴーまたはクリスチャン・レスターリンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Couturier, A.、Virolle, C.、Goldlust, K. 他接合プラスミド導入の細胞内動態のリアルタイム視覚化。 Nat Commun 14、294 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-35978-3

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受信日: 2022 年 10 月 5 日

受理日: 2023 年 1 月 11 日

公開日: 2023 年 1 月 18 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-35978-3

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