ミクロの見える化

Oct 18, 2023

Scientific Reports volume 12、記事番号: 13375 (2022) この記事を引用

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2 引用

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メトリクスの詳細

光学顕微鏡技術は、マイクロエージェントを視覚化するための一般的な選択肢です。それらは比較的高い時空間解像度の画像を生成しますが、マイクロエージェントと周囲を区別するためのエンコードされた情報は明らかにしません。この研究では、スペクトル分解によって移動性マイクロエージェントと動的環境を色分けして識別するための多色蛍光顕微鏡法を紹介します。我々は、標的薬物送達実証の概念実証として、HeLa 細胞で形成された癌スフェロイドへの単一およびクラスターのマイクロエージェントの付着を視覚化することにより、多色顕微鏡のパフォーマンスを報告します。マイクロ流体チップは、単一のスフェロイドを固定し、マルチカラー顕微鏡検査に安定した環境を提供し、3D 腫瘍モデルを作成するために開発されています。多色顕微鏡法が血管化環境におけるマイクロエージェントを視覚化できることを確認するために、内皮細胞で形成されたインビトロ血管系ネットワークおよび卵外ニワトリ漿尿膜を実験モデルとして使用した。私たちのモデルの完全な視覚化は、ラウンドロビン方式での蛍光色素分子の連続励起と、3 つの異なるスペクトル帯域からの同期した個々の画像取得によって実現されます。我々は、十分に分離されたスペクトル特性を持つ蛍光色素を利用して、多色顕微鏡法が微量因子、有機体（がん球状体や血管系）、および周囲の媒体をスペクトル的に分解し、最大 15 フレームまで 1280 \(\times\) 1024 ピクセルで画像取得できることを実験的に示しています。毎秒。我々の結果は、リアルタイム多色顕微鏡法が、微小物質の追跡、有機体の形態、および周囲の媒体の明確な区別に関して、色分けされた視覚化により理解の向上をもたらすことを示している。

マイクロロボット工学の分野は、マイクロ/ナノ製造技術の進歩のおかげで、医療におけるさまざまな応用に新たな道を切り開きました1、2、3。最も顕著な応用例の 1 つは、標的薬物送達です。これは、治療の成功率を高め、薬の副作用を軽減し、患者の回復時間を短縮する革新的な技術です 4,5。マイクロロボットシステムのエンドエフェクターであるマイクロエージェントは、ナノ粒子薬物送達のためのキャリアとして利用され、外部刺激（磁場や音波など）によって目的の組織に向けて誘導されます6。サイズの制限によりセンサーの統合が依然として課題であるため、マイクロエージェントが標的組織に到達するためにイメージング技術が利用されています7、8。取得された画像は、ターゲットの特定、マイクロエージェントの操作、および所望の位置への薬物の放出のためのフィードバックソースとしてのみ考慮することができます。したがって、明確な視覚化は配信プロセスにおいて重要な役割を果たします。

磁気共鳴画像法 (MRI)、コンピューター断層撮影法 (CT)、蛍光透視法、超音波、および光音響イメージングは、インビトロおよびインビボ条件でマイクロエージェントを視覚化するために使用されます。 MRI は、高いコントラスト対ノイズ比でマイクロエージェントの作動と視覚化を同時に行うために使用されます9、10、11。さらに、MRI 画像には、マイクロエージェントを正確に操作するための高いコントラスト対ノイズ比を備えた解剖学的詳細が含まれています。ただし、MRI は画像取得速度が低いため、リアルタイムの視覚化を必要とするマイクロエージェントアプリケーションには適していません 12。 MRI と同様に、CT はマイクロエージェントの高解像度画像を提供しますが、作動システムと感知システムを統合するための作業スペースが限られています 13。蛍光透視法は、より広い作業スペースを確保し、より多くの画像取得速度を達成するための CT の代替イメージング方法です 14,15。 CT と X 線透視検査はいずれも、電離放射線被曝により臨床医と患者の両方に有害な影響を及ぼします 16。画像診断法の中で、超音波ベースの技術は健康に対する既知の副作用がなく、マイクロエージェントのリアルタイム視覚化に使用されます17、18、19、20、21。超音波イメージングは、小型の手持ち式プローブを使用して画像が取得されるため、作動システムを配置するための広い作業スペースを提供します22、23、24。ただし、超音波画像には本質的にノイズが多く、微小物質の検出を妨げるアーティファクトが含まれています。光音響イメージングは、マイクロエージェントのコントラスト強調により超音波イメージングの限界を克服します。光の吸収により金属材料を含むマイクロエージェントが加熱され、その後の熱膨張により音波が発生します25。生成された音響波により、マイクロエージェントは超音波画像よりも高い信号対雑音比を達成し、周囲から分解されることがわかります26、27、28。

実験環境は透明な材料で作られているため、光学顕微鏡技術は、ラボオンチップアプリケーションの予備テストとマイクロエージェントに使用されます6、7。明視野およびシングルバンド蛍光顕微鏡技術は、微量因子を視覚化するために広く使用されています。サンプルの完全な視覚化は明視野顕微鏡法で得られますが、マイクロエージェントと物理的環境の間の高さの違いにより、取得された画像がぼやけてしまいます 29。シングルバンド蛍光顕微鏡では、高解像度での微量因子の視覚化のみが提供され、周囲に関する情報は提供されません 30,31。我々の以前の研究では、マイクロエージェントを視覚化するための光学顕微鏡技術の限界を克服するために、多色蛍光顕微鏡が導入されました29。広視野マルチカラー顕微鏡は、さまざまなスペクトル帯域から焦点を合わせた画像を収集し、収差を補正するツールとして開発されました。完全なサンプルはスペクトル的に分解され、マイクロエージェントと周囲の遮蔽のない視覚化が得られました。

この研究では、マイクロエージェントと周囲のリアルタイム多色イメージングの欠如に対処します。以前の研究で使用されたイメージング技術と私たちのアプローチの主な違いは、サンプル全体を色分けすることで、マイクロエージェントの機能と動態のメカニズムをよりよく理解できるようになることです。色は人間の知覚と認知の増幅に不可欠な情報媒体であるため、取得された多色画像によりマイクロエージェントと周囲の明確な視覚化が可能になります32。多色顕微鏡の可能性は、3D 腫瘍および血管化環境における薬物担体の代替物としての移動マイクロエージェントを視覚化することによって実証されます。この研究（マイクロロボット工学の分野における）の主な貢献は、（1）マイクロ薬剤、有機体（癌球状体および血管）、およびマイクロ流体チャネルのスペクトル分離によるリアルタイム多色蛍光顕微鏡法の実証です。 (2) マイクロエージェントによる送達タスクおよび限定された環境からの多色画像取得のために、単一の 3D 癌スフェロイドを固定位置に固定するマイクロ流体チップを開発します。 (3) マイクロ流体システム上に形成されたインビトロ灌流可能な血管ネットワーク内のマイクロエージェントのリアルタイムの色分けされた視覚化。さらに、さまざまな形状とサイズのマイクロエージェントを使用して複数のイメージング実験が行われ、私たちの貢献が示されています。

イメージング実験では、子宮頸部 HeLa 細胞を使用して形成された癌スフェロイドを、培養液で満たされた開発されたマイクロ流体チップに配置することによって腫瘍モデルが作成されます。インビトロベースのマイクロ流体血管ネットワークと卵外ベースのニワトリ漿尿膜は、血管化環境内のマイクロエージェントを視覚化するためのモデルとして使用されます。マルチカラー画像は、マイクロエージェントがモデル内で磁気的に移動する実験を通じて取得されます。リアルタイムのマルチカラー画像取得は、明確な色分けと最小限の時間間隔での蛍光色素の励起に基づいて構成されています。まず、スペクトルクロストークにより、単一のスペクトルバンドからマイクロエージェントと周囲を識別し、指定した色で視覚化することができなくなります。クロストークを克服するために、放出された蛍光光子は、個別の画像形成のために比較的よく分離された 3 つのスペクトルバンドから収集されます。第二に、蛍光色素分子の寿命は限られており、放出される蛍光光子の強度は光退色によりイメージング中に減少します。蛍光色素への光損傷を軽減して多色イメージングの寿命を延ばすために、逐次励起戦略が使用されます。

多色蛍光顕微鏡法における同時励起 33,34 および逐次 35,36 励起戦略の利点は、細胞構造を使用して広く研究されています。蛍光団を同時に励起することで、遅延なくスペクトル帯域から画像を取得できます。ただし、取得された画像には重大なクロストークが含まれており、特定の微細構造やコンパートメントの明確な検出が不可能になります。蛍光色素分子の連続励起とイメージングセンサーの同期トリガ（スペクトル多重化）により、クロストークが克服されます 37,38。逐次戦略の欠点は、スペクトル分解された画像が等しい遅延で取得されるため、多色形成速度が制限されることです39。移動および静止マイクロエージェントを含むモデルは、ラウンドロビン方式での蛍光色素分子の連続励起と励起シーケンスへの同期画像取得により、クロストークなしで完全に解像されます。モデルのリアルタイム視覚化は、比較的高速なスペクトル多重化によって得られます。

エレクトロスピニングを使用した蛍光および磁性マイクロエージェント製造の概要。 (a) エレクトロスピニングのセットアップとポリマー溶液の内容の概略図。 (b1) および (b2) それぞれエレクトロスピニングを使用してコレクタ上に堆積された直線およびビーズ状の繊維メッシュの走査型電子顕微鏡画像。（ｃ１）超音波処理装置を使用して連続繊維を切断することによって微量薬剤を得るポリマー粉砕プロセス。 (c2) 作製したマイクロエージェントの蛍光画像。 (c3) 共焦点顕微鏡を使用して視覚化されたマイクロエージェントの 3D 表面プロファイル。 (d1) ジメチルホルムアミド (DMF) 中のクマリン-6 の紫外可視スペクトル分析。 (d2) および (d3) さまざまな励起波長と発光波長での DMF 中のクマリン 6 のスペクトル分析。 (e1) 21 mT の磁場でのマイクロエージェントの動きを可視化するための蛍光顕微鏡。（e2）蛍光画像に重ねられたベクトルフィールドは、Lucas-Kanadeオプティカルフローを使用して分析されたマイクロエージェントの動きを示しています。スケールバー 100 \(\upmu\)m。

当社のマイクロエージェントは、エレクトロスピニングを使用して合成された連続ビーズ状および直線状の繊維を粉砕することによって製造されます（図1）。合成された繊維は、キャリアポリマーとしてのポリスチレンと、磁性材料としての酸化鉄ナノ粒子（\(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\)）で構成されています（図1b）。クマリン 6 はポリスチレンマトリックスに固定されており水に不溶であるため、繊維の染色にはクマリン 6 が選択されます。さらに、クマリン 6 は比較的高い光退色耐性を持っています。粉砕プロセスでは、超音波を使用して繊維を断片に砕きます。これにより、サイズが4〜131 \(\upmu\)mの範囲の磁性および蛍光マイクロエージェントを取得することができます（図1c1、c2）。シングルバンド蛍光顕微鏡検査を実行して、Milli-Q 水中で製造されたマイクロエージェントの動きと静電相互作用を視覚化します。図 2a は、直線繊維を使用して製造された 2 つのマイクロエージェントの引っ張り動作を示しています。図 2b は、ビーズ状のファイバーを使用して製造されたマイクロエージェントの動的動きを示しています。イメージング実験中に、直線繊維を使用して製造されたマイクロエージェントには \(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\) が完全に充填され、堅くなっていることが観察されました。一方、ビーズ繊維合成用に調製されたポリマー溶液では、 \(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\) の分布がランダムであるため、柔軟なマイクロエージェントの作製が可能になります。図 2c1–c3、d1、d2 は、振動磁場を使用した柔軟なマイクロエージェントの斜めおよび垂直方向の動きをそれぞれ示しています。マイクロエージェント間の静電相互作用は、3 つの実験を使用して視覚化されます。最初の実験は、回転フィールド内でのマイクロエージェントの動作を視覚化するために行われます。ビーズ状ファイバーとストレートファイバーの両方を使用して製造されたマイクロエージェントが、双極子間相互作用により凝集し、時間の経過とともにクラスターを形成することが観察されました。図2eは、8 Hzで16 mTの回転磁場によるマイクロエージェントクラスター形成の代表的なケースを示しています。 2 番目の実験は、静電気力を利用して 2 つのマイクロエージェントの付着を視覚化するために考案されました。図 2f1 は、アタッチメント (自己組織化) を強調表示して取得したタイムラプス画像を示しています。取り付けられたマイクロエージェントの動きは、Lucas-Kanade オプティカルフローを使用してベクトル場として表され、図 2f240 に示されています。私たちの結果は、付着したマイクロエージェントが一緒に移動し、静電気力が凝集を防ぐことを示しています。 3 番目の実験では、磁場が印加されていないときのマイクロエージェントの挙動が観察されます。取得された画像は、直線繊維を使用して製造されたマイクロエージェントが沈み、開いたリザーバーとマイクロ流体チャネルの両方に線状の自己組織化パターンを作成することを明らかにします（図2g1、g2）。自己組織化パターンは、ビーズ状の繊維を使用して製造されたマイクロエージェントで実験を繰り返した場合には観察されません。マイクロエージェント内の磁性材料の濃度が低下すると、自己組織化動作が無効になります。作製したマイクロエージェントは、薬物運搬体の代用物として使用され、CellTracker Red CMTPX で染色された HeLa 細胞スフェロイドに付着されます。

クマリン 6 で標識された磁性マイクロエージェントを視覚化するためのシングルバンド蛍光顕微鏡。(a) タイムラプス画像は、磁力による引力によるマイクロエージェントの前進運動を示しています。 (b) スナップショットシーケンスは、マイクロエージェントの振動運動を示しています。 (c1) と (d1) 重ねられた蛍光画像は、それぞれマイクロエージェントの斜め方向と垂直方向の動きを示しています。 (c2)、(c3)、および (d2) マイクロエージェントの振動運動パターン。 (e) 回転磁場によるマイクロエージェントの凝集。 (f1) 静電相互作用によるマイクロエージェントの付着。 (f2) ベクトル場は、Lucas-Kanade オプティカルフローを使用して解析された、取り付けられたマイクロエージェントの動きを表現します。 (g1) および (g2) それぞれリザーバーおよびマイクロ流体チャネル内のマイクロエージェントの自己組織化。スケールバー 100 \(\upmu\)m。

培養培地中にインドシアニングリーンを含むオープンリザーバーでの 3 つの実験により、HeLa 細胞スフェロイドへの単一および複数のマイクロエージェントの付着を視覚化します。すべての実験において、マルチカラー画像は 15 fps で形成され、マイクロエージェントは 36 mT の磁場強度で回転楕円体に向かって誘導されます。最初の 2 つの実験では、回転楕円体に穴を開けて、鋭い先端を持つマイクロエージェントを取り付けます (図 3a1、b1)。 3 番目の実験では、3 つのマイクロエージェントが連続して回転楕円体に付着されます。最初の 2 つのマイクロエージェントは静電相互作用によって回転楕円体の表面に付着しますが、3 番目のマイクロエージェントは穴を開けることによって付着します (図 3c1)。アタッチメントは、ダイナミックイメージングを使用して長期的な変化をスクリーニングすることによって検証されます。励起光は、照射領域と非照射領域の間に熱勾配を生成し、その結果、流れが生じます。アタッチメント検証の受動的な方法として、フロー内のマイクロエージェントの移動性を視覚化します。付着したマイクロエージェントと付着していないマイクロエージェントの両方に対する 92 分間の流れの影響を図 3a2 に示します。付着したマイクロエージェントの速度は約 0 \(\upmu\)m/s と測定されますが、付着していないマイクロエージェントは流れによって移動します。また、流れによって移動した非付着マイクロエージェントが、静電気力を利用して付着マイクロエージェントと凝集することも観察されます（図3a3）。凝集したマイクロエージェントの変位は、0 \(\upmu\)m で 92 分間測定されます。私たちの実験では、回転楕円体に付着するとマイクロエージェントの慣性が増加し、流れの中でマイクロエージェントが固定化されることが検証されました。すべての実験において、90 分以上流れの中でマイクロエージェントが動かないことを視覚化することで付着が検証されます (図 3a2–c2)。検証のために取得した動的画像からも、発生した熱によるリザーバー内の媒体の蒸発により、付着したマイクロエージェントが回転楕円体とともに移動することが明らかになりました（図3a3、b2、c2）。媒体が完全に蒸発した後、単一および複数のマイクロエージェントが付着した回転楕円体の変位は、それぞれ 20 \(\upmu\)m および 68 \(\upmu\)m と測定されます。蒸発が付着に影響を与えていないことを確認するために、14 mTの磁場で2分間、マイクロエージェントを回転楕円体への挿入部分の周りで回転させます（図3b3）。マイクロエージェントの遠位端の最大速度は、1.4 体長/秒 (180 \(\upmu\)m/s) と測定されます。スフェロイドからのマイクロエージェントの剥離は観察されません。我々の結果は、多色顕微鏡法が、スフェロイドへの微小薬剤の付着を視覚化および検証するために色分けされた画像をリアルタイムで生成することを示している。

HeLa 細胞スフェロイドへの単一および複数の磁性マイクロエージェントの付着をタイムラプス多色蛍光顕微鏡で観察します。 (a1–c1) 36 mT の磁場による HeLa 細胞スフェロイドへのマイクロエージェントの付着。 (a2、a3) 付着および非付着マイクロエージェントに対する受動的流動の影響。 (b2,c2) スフェロイドに付着したマイクロエージェントの変化の視覚化。 (b3) 2 時間経過後のスフェロイドへのマイクロエージェントの挿入部を中心とした回転運動による付着チェック。スケールバー 100 \(\upmu\)m。付属のビデオ (パート 1) を参照してください。

リアルタイム多色蛍光顕微鏡検査は、ラウンドロビン方式で蛍光色素を連続的に励起し、500 ～ 540 nm、592.5 ～ 667.5 nm、および 817.5 ～ 875.5 nm のスペクトル帯域で個別の画像を同期的に取得することによって実行されます。クマリン 6 で標識されたマイクロエージェントの個々の画像は、500 ～ 540 nm のスペクトルバンドから取得されます。スフェロイドはCMTPXとインドシアニングリーンで染色され、それぞれ592.5〜667.5 nmと817.5〜875.5 nmのスペクトルバンドで視覚化されます（図5a4）。したがって、スフェロイドとマイクロエージェントの同時の動きは、多色顕微鏡で使用されるすべてのスペクトルバンドから視覚化できます。当社のマイクロエージェントは、外部磁場によって HeLa 細胞スフェロイドを動員することができます。図4aは、60 mTの磁場を有する培養培地中のインドシアニングリーンを含むリザーバー内で付着した複数のマイクロエージェントによって推進される回転楕円体を示しています。図4bは、推進中のマイクロエージェントの付着の不均衡による回転楕円体の時計回りの回転を示しています。マイクロエージェントでスフェロイドを動員して、リアルタイムマルチカラー顕微鏡のパフォーマンスを報告します。オープンリザーバーは、マイクロエージェントの付着によりスフェロイドの並進運動および回転運動が可能になるため、実験のテストベッドとして使用されます。マルチカラー画像は 15 fps で形成され、個々の画像取得速度は 45 fps です。図4c1、d1は、それぞれ120 mTの磁場を持つマイクロエージェントによって推進される2つまたは複数の回転楕円体の前進運動を示しています。図 4e1 は、磁場の方向を変更することでマイクロエージェントの推進力で回転楕円体を操作する代表的なケースを示しています。視覚追跡によって得られた経路情報は、図4c2、d2、e241に、最大218 \(\upmu\)m/s (\(\おおよそ\) 1.3体長/秒)の回転楕円体の並進運動を示しています。回転運動性を視覚化するために、最大磁場36 mTの単一マイクロエージェントアタッチメントによって回転楕円体を時計回りに移動させます（図5a1、a4）。マイクロエージェントを含む回転楕円体の運動情報は、Lucas-Kanade オプティカルフローを使用してベクトル場として表現され、図 5a2 に示されています。取り付けられたマイクロエージェントのベクトルフィールドとパスは、回転楕円体が最大角速度 1.2 rad/s でその軸の周りを回転していることを示しています (図 5a3)。回転運動性と並進運動性は、1Hz、16mTの回転磁場中でマイクロエージェントクラスターが付着した2つの回転楕円体を作動させることによって一緒に視覚化されます（図5b1）。図 5b2 は、マイクロエージェントクラスターによる 2 つの回転楕円体の回転の運動場を示しています。回転楕円体の並進運動を図 5b3 にプロットします。私たちの実験では、多色顕微鏡法により、時変磁場の中での複数の回転楕円体とマイクロエージェントの同時運動を最大 504 \(\upmu\)m/s (\(\about\) 3.4 body-回転楕円体の長さ/秒)、15 fps で。また、有機物体としてのスフェロイドが、貯留環境内の単一、複数、およびマイクロエージェントのクラスターによって作動できることも検証します。マイクロエージェントを付着させるために単一のスフェロイドを固定化し、多色顕微鏡検査のための密閉環境を提供するために、マイクロ流体チップが開発されています。

培養培地とインドシアニングリーンで満たされたリザーバー内での磁性マイクロエージェントによる HeLa 細胞スフェロイドの翻訳。 (a1) マイクロエージェント接続により単一の回転楕円体を推進する。 (a2) マイクロエージェントを回転楕円体に接続するための微速度撮影二色顕微鏡。 (b1) マイクロエージェントの推進によって引き起こされる回転楕円体の回転。 (b2) 勾配画像による回転楕円体の回転のデモンストレーション。 (c1,d1) それぞれマイクロエージェントによる 2 つおよび複数のスフェロイドの同時翻訳。 (e1) 磁場の方向を変えることによってマイクロエージェントで推進される回転楕円体を操縦する。 (c2–e2) それぞれ (c1–e1) の回転楕円体の経路と速度の情報。スケールバー 100 \(\upmu\)m。付属のビデオ (パート 1) を参照してください。

培養培地とインドシアニングリーンで満たされたリザーバー内での、マイクロエージェントが付着した HeLa 細胞スフェロイドの回転と平行移動。 (a1、b1) それぞれ単一およびクラスターのマイクロエージェントによる回転楕円体の作動。 (a2、b2) タイムラプス多色画像に重ねられたベクトルフィールドは、Lucas-Kanade オプティカルフローを使用して解析された回転楕円体の回転運動を示しています。 (a3,b3) 回転楕円体の運動プロファイルと速度情報。 (a4) 時間ゼロにおける多色画像のスペクトル画像分解。スケールバー 100 \(\upmu\)m。付属のビデオ (パート 1) を参照してください。

3D 簡易腫瘍モデルを作成するために、直径 100 ～ 250 \(\upmu\)m の単一 HeLa 細胞スフェロイドを固定化できるマイクロ流体チップが開発されました 42。チップには、80 \(\upmu\)m の間隔を持つ U 字型のピラーアレイを使用して構築されたチャンバーが含まれており、これにより回転楕円体の脱出がブロックされ、マイクロエージェントの侵入が可能になります（図6a1）。注入中、ピラーが回転楕円体を捕捉します (図 6a2)。次に、ピラーアレイの内側と外側の間に圧力差を生じさせて、気泡をチップ内に移動させ、回転楕円体を固定します（図6a3）。したがって、開放リザーバー内でのランダムな配置とは異なり、回転楕円体は多色実験用に特定の場所に固定されます。チップには細胞培養培地中に 250 \(\upmu\)g/ml のインドシアニングリーンが充填されており、蛍光顕微鏡で可視化されます。圧力差によりスフェロイドを動かすことなく、培地や微量薬剤を注入します。図6bは、2本の柱の間から固定された回転楕円体の下を通過するマイクロエージェントの微速度撮影マルチカラー画像を示しています。図 6c1 は、36 mT の磁場で固定化回転楕円体に穴を開けることによる単一のマイクロエージェントの付着を示しています。動的イメージングを 15 fps で 395 分間実行し、チップが長期多色顕微鏡検査のためにマイクロエージェントが付着した回転楕円体を維持していることを検証します。取得した動的画像により、インドシアニングリーンの光退色耐性がクマリン 6 や CMTPX よりも低いことが明らかになりました。チップの蛍光イメージングは、分170でのインドシアニングリーンの光退色により不可能であり、回転楕円体とマイクロエージェントのピクセル強度の低下はそれぞれ21.2％と1.6％です（図6c2、c3）。チップの蛍光イメージングを回復するために、励起光を 1 時間オフにします。オフタイム中に脱色されていないインドシアニングリーン分子がイメージング領域の外側から内側に拡散することで、再び多色顕微鏡検査が可能になります（図6c4）。励起光によって生成される熱により媒体が完全に蒸発するため、リザーバー内では蛍光の回収を実行できません（図 3a3、b2、c2）。マルチカラー画像取得の観点から、開いたマイクロ流体プラットフォームと閉じたマイクロ流体プラットフォームの違いを示すために、リザーバーは密閉されていません。私たちの研究で行われた実験は、リザーバー（オープンプラットフォームとして）とマイクロ流体チップ（クローズドプラットフォームとして）をリアルタイムマルチカラー顕微鏡に使用できることを実証しています。ただし、リザーバ内の媒体が蒸発すると、一定時間後に多色画像の取得ができなくなります。開放リザーバーは、蒸発を防ぐために気密透明チャンバーで密閉されていない限り、動的多色イメージングを使用して長期変化を視覚化するのに安定した環境ではありません。一方、チップは内部に加熱媒体を保持することで、(1) 長期間の顕微鏡観察を可能にし、(2) 蛍光回復により多色イメージング時間を延長します。蛍光の回復が付着に影響を及ぼさないことを確認するために、264分と267分の間に14mTの磁場でマイクロエージェントをランダムに移動させます(図6c5)。マイクロエージェントの遠位端の最大速度は 67 \(\upmu\)m/s (1.3 体長/s) と測定され、剥離は観察されません。図 6c6 は、分 395 での回転楕円体内部のマイクロエージェントの一部を示すことで付着を検証します。 5 Hz、16 mT の回転場で複数のマイクロエージェントが固定化回転楕円体に付着します (図 6d)。双極子間相互作用の結果、付着したマイクロエージェントが時間の経過とともにクラスターを形成することが観察されます（図6e）。図4b1に示すように、マイクロエージェントクラスターは回転楕円体を作動させる能力がありますが、回転楕円体の変位は137分間で0 \(\upmu\)mで測定されます。私たちの実験では、チップが回転楕円体を動かすことなく複数のマイクロエージェントを付着できるようにすることで、マルチカラー顕微鏡用の静的な環境を作り出すことが示されました。我々は、我々の腫瘍モデルが、スフェロイドへの単一および複数のマイクロエージェント付着の多色画像取得のための制御可能で安定したテストベッドを提供することを実験的に検証する。多色顕微鏡法が血管化環境内のマイクロエージェントを視覚化できることを検証するために、マイクロ流体システム上の血管ネットワークが実験のテストベッドとして使用されます。

マイクロ流体環境内の磁性マイクロエージェントを視覚化するための多色蛍光顕微鏡。 (a1) 単一の HeLa 細胞スフェロイドを固定化するために設計されたチップのレイアウト。 (a2) 捕捉されたスフェロイドに付着したマイクロエージェント。 (a3) 気泡を利用してスフェロイドを固定する。 (b) 重ね合わせた画像は、固定化された回転楕円体の下を移動するマイクロエージェントを示しています。 (c1) 固定化されたスフェロイドへのマイクロエージェントの付着。 (c2–c4) インドシアニングリーンの光退色後の蛍光の回復。（ｃ５）マイクロエージェントを磁気的に移動させて付着チェックを行う。 (c6) 矢印は、回転楕円体の内部のマイクロエージェントの部分を示します。 (d) 顕微鏡検査と磁気作動に使用されるセットアップのワークスペース。 (e) スフェロイドに付着したマイクロエージェントクラスターの形成。スケールバー 100 \(\upmu\)m。付属のビデオ (パート 2) を参照してください。

in vitro で灌流可能な血管ネットワークは、マイクロ流体システムにおける RFP-HUVEC と骨髄由来間葉系幹細胞の共培養によって構築されます。マルチカラー顕微鏡では、細胞培養培地中の 250 \(\upmu\)g/ml インドシアニングリーンとマイクロエージェントがシステムに注入されます。図 7a1 は、操作された血管ネットワークとマイクロエージェントを特徴とするマイクロ流体システムの静的多色画像を示しています。図 7a2 は、マルチカラー画像上に定義された ROI の拡大図を示しており、受動的な流れと 70 mT の磁場による磁気吸引による血管網内のマイクロエージェントの動きを強調しています。マイクロエージェント (1) は磁場に沿って自由に移動しますが、マイクロエージェント (2) と (3) は 33 秒後に内腔壁に衝突します。私たちの実験は、マイクロエージェントが管腔開口部を介して血管網に灌流し、同時に追跡できることを示しています（図7a3）。図 7b は、代表的な多色画像形成を示しており、マイクロエージェント、血管網、およびマイクロ流体システムが 3 つの異なるスペクトル帯域でスペクトル的に分解されていることを検証しています。血管網の構造形態は、培地中のインドシアニングリーンの拡散により、二重スペクトルバンド（592.5〜667.5 nmおよび817.5〜875.5 nm）から視覚化されます（図7b2、b3）。これにより、血管構造の完全な視覚化が可能になり、ヒドロゲル空間の輪郭が明確に描写されます (図 7b4、b5)。血管ネットワーク内のマイクロエージェントの移動性は、非細胞培養条件下での 3 セットのマルチカラー実験で視覚化されます。すべての実験では、RFP の光損傷を最小限に抑えるために、マルチカラー画像が 3 fps で取得されます。 RFP-HUVEC は蛍光シグナルを再構築するために活発に機能する代謝を持っているため、インキュベーション条件により高い画像取得率が達成可能です。最初の実験は、受動的フローによって移動するマイクロエージェントを視覚化するために行われます (図 7c)。マイクロエージェントの平均速度は、3.3 体長/秒 (25 \(\upmu\)m/s) として計算されます。 2 番目の実験は、42 mT の磁場で受動的な流れに対して磁気的に引き寄せられるマイクロエージェントを視覚化するように設計されています。図7d、eは、平均速度1.4体長/秒（17 \(\upmu\)m/s）および2.5体長/秒（12\）のマイクロエージェントの動きの重ね合わせタイムラプス画像を示しています。 (\upmu\)m/s) とそれぞれ異なります。 3 番目の実験では、静電力を利用した 3 つのマイクロエージェントの集合が視覚化されます (図 7f1)。凝集したマイクロエージェントは、平均速度0.04体長/秒（4 \(\upmu\)m/s）の受動的流れによって移動します（図7f2、f3）。取得した多色画像から、186 秒間は脱凝集が起こらないことがわかります (図 7f1、f2)。私たちのイメージング実験は、多色顕微鏡法が (1) 血管構造内のマイクロエージェントの定量分析に時空間分解能を提供すること、(2) 最小長 5 \(\upmu\)m のマイクロエージェントの画像取得が可能であることを実証しています。 (3) マイクロエージェントと人工血管形態の両方をリアルタイムで明確に色分けすることが可能になります。次に、自然の血管の内側と外側のマイクロエージェントを視覚化することによるマルチカラー顕微鏡のパフォーマンスを報告します。

灌流可能な血管網内の磁性マイクロエージェントを視覚化するための多色蛍光顕微鏡。（a1）培地とインドシアニングリーンで満たされたマイクロ流体システム上のRFP-HUVECで形成された血管構造内のクマリン6で標識されたマイクロエージェントの多色画像。 (a2) 受動的な流れと 70 mT の磁場による磁気吸引によるマイクロエージェントの移動。 (a3) マイクロエージェントの経路と速度。 (b) 取得したスペクトルの異なる画像を重ね合わせて多色画像を形成する。（c1、d1–e1）それぞれ受動的な流れと42 mTの磁場による磁気吸引による管腔内のマイクロエージェントの移動。 (c2–e2) マイクロエージェントと内腔の蛍光画像を結合したもの。 (f1、f2) それぞれ受動的な流れによる血管系内のマイクロエージェントの凝集と移動。 (f3) 集合したマイクロエージェントの速度と経路。スケールバー 100 \(\upmu\)m。付属のビデオ (パート 3) を参照してください。

階層的なマルチスケール血管を含む卵外漿尿膜（CAM）血管系を使用して、ネイティブ環境のマイクロエージェントを視覚化します（図8a1）。図 8a2、a3 は、それぞれ参照として明視野と赤血球の自己蛍光による多色顕微鏡を使用して視覚化された血管系の構造形態を示しています。マルチカラー画像は、血管構造、赤血球、CAM という 3 つの主要な細胞特徴のスペクトル分離によって形成されます (図 8a4)。 DPBS を使用して CAM を灌流して、血管構造内の浮遊赤血球を完全に除去します。この脱細胞化された血管構造により、マイクロエージェントおよび複数の蛍光色素溶液の自由な移動が可能になります。染色のために、血管系を、250 \(\upmu\)g/ml インドシアニングリーンの培地、100 \(\upmu\)g/ml ローダミン B 水溶液、およびマイクロエージェントを含むペトリ皿に一晩置きます。期間。イメージング実験の前に、CAM 上でのマイクロエージェントの凝集を防ぐために、染色サンプルを含むディッシュを 15 分間手動で振盪して DPBS で洗浄します。直径 15 mm の円形部品がサンプルから切り出され、マルチカラー顕微鏡検査のために PDMS リザーバーに移されます。 DPBS洗浄後の脱細胞化分岐血管とマイクロエージェントの代表的な静的多色画像を図8b1に示します。マルチカラー画像平面上に定義された ROI (1) ～ (3) は、それぞれ漿尿膜、血管壁、血管内部のマイクロエージェントを強調表示します。マイクロエージェントと容器の詳細を明らかにするために、ROI (1) ～ (3) の拡大図をそれぞれ図 8b1 ～ b3 に示します。 ROI（2）および（3）のスペクトル画像分解により、マイクロエージェントと血管が異なるスペクトルバンドから画像化されていること、およびCAMと血管壁の間にコントラストの差があることが確認されます（図8b2、b3）。血管壁に存在する不均一な細孔によりローダミンBとインドシアニングリーンが拡散できるため、コントラストの差は90％減少します（図8c、d）。リアルタイムのマルチカラー画像は、マイクロエージェントが 42 mT の磁場で引き寄せられ、66 ms の露光時間で 5 fps で取得されます。容器の外側と内側を移動するマイクロエージェントの平均速度は、1 体長/秒、長さ/秒 (8 \(\upmu\)m/s) および 0.5 体長/秒、長さ/秒 (2 \(\upmu\)m/s)、それぞれ(図8c、d)。容器内のマイクロエージェントは壁に到達するまで引っ張られます。血管壁に到達した後のマイクロエージェントの変位は、5分間で0 \(\upmu\)mと測定されますが、外側のマイクロエージェントは磁場に沿って移動します（図8d）。私たちの実験は、多色顕微鏡法が自然の血管内のマイクロエージェントのリアルタイム視覚化を提供することを実証しています。

卵外ニワトリ漿尿膜内の磁性マイクロエージェントを視覚化するための多色蛍光顕微鏡。 (a1) 赤血球の自家蛍光特性を利用した血管網可視化用サンプル。 (a2、a3) それぞれネットワークの明視野画像と多色画像。 (a4) (a3) の ROI のスペクトル分解。 (b1) クマリン 6 で標識されたマイクロエージェントと、ローダミン B およびインドシアニングリーンを含む容器の多色画像。 (b1) の ROI (1) ～ (3) は、それぞれ膜上、容器表面上、容器内部のマイクロエージェントを示しています。 (b2、b3) それぞれ ROI (2) と (3) の拡大図とスペクトル分解。 (c、d) それぞれ容器の外側と内側のマイクロエージェントの磁気的な動き。スケールバー 100 \(\upmu\)m。付属のビデオ (パート 4) を参照してください。

この研究では、標的薬物送達の想定される応用のために、3D 腫瘍オンチップおよび血管構造モデル内のポリマーマイクロエージェントを視覚化するための多色蛍光顕微鏡法を実証します。文献で使用されているイメージング技術と比較すると、マイクロエージェントと周囲は 3 つの異なるスペクトル帯域でスペクトル的に分解され、モデルの色分けされた視覚化が取得されます。私たちは、多色顕微鏡により、さまざまなアスペクト比でのマイクロエージェント、有機物体、周囲の媒体のスペクトルの異なる画像取得が最大 15 fps で可能となり、各スペクトルから最大 504 \(\upmu\)m/s の連続動作検出が可能であることを実験的に検証しています。バンド。色分けの結果、各マイクロコンポーネントの識別と区別についての理解が深まります。私たちの測定結果は、多色顕微鏡法がマイクロエージェントの機能を分析および検証するために空間コンパートメントをリアルタイムで描写することを示しています。私たちは、リアルタイム多色顕微鏡法が必要な明確な視覚化を可能にすることで、マイクロエージェントの実践への移行を加速すると期待しています。

マイクロエージェント製造用のエレクトロスピニングセットアップは、高電圧電源（60C24-P250-I5、Advanced Energy、米国）とシリンジポンプ（NE-4000、New Era Pump Systems、米国）を使用して構築されます（図1a）。。データ収集ユニット (34972A、34901A、34907A、Keysight、米国) は、高電圧電源への制御信号の転送とフィードバックデータの収集の両方に使用されます。セットアップは気密エンクロージャ内に配置され、同じ空気対流条件を提供することで再現性のある製造が保証されます。エレクトロスピニング用のポリマー溶液は、キャリアポリマーとしてのポリスチレンペレット (430102-1KG、Sigma-Aldrich、米国)、溶媒としての無水 N,N-ジメチルホルムアミド (DMF) (227056-1L、Sigma-Aldrich、米国)、クマリン 6 ( 442631-1G、Sigma-Aldrich、米国）疎水性蛍光体として、および酸化鉄ナノ粒子（\(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\)）（637106-25G、Sigma-Aldrich、米国））磁性材料として44、45。連続ビーズ繊維および直線繊維の製造には、30.02% (19.8% ポリスチレン、10.0% \(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\)、0.2% クマリン 6) および 45.25% (30.1%) を含む溶液が使用されます。 %ポリスチレン、15.0% \(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\)、0.2% クマリン 6) 重量対体積比の DMF をそれぞれ調製します。 \(\hbox {Fe}_{3}\hbox {O}_4\) と DMF を最初に 30 分間超音波処理して粒子を解砕します。続いて、ポリスチレンペレットおよびクマリン６を混合物に添加し、ローラーミキサー（ＬＬＧ－ｕｎｉＲｏｌｌｅｒ６、ＬＬＧ－Ｌａｂｗａｒｅ、ドイツ）を使用して１２時間混合して、均質な溶液を達成する。エレクトロスピニングプロセスでは、ポリマー溶液をプラスチック注射器に入れ、テフロンチューブを介して 18 ゲージの先端が鈍い針 (TS18SS-15、Adhesive Dispensing Ltd.、英国) に接続します。加速電圧、溶液供給速度、およびチップからコレクターまでの距離は、それぞれ 14 kV、2.5 mL/h、および 16 cm に設定されます。 0.04 mL のポリマー溶液を一度にエレクトロスピニングし、繊維メッシュを 24 \(^{\circ }\)C、湿度 22% で接地したアルミニウム箔上に堆積させます。エレクトロスピニングされた繊維上の溶媒残留物は、室温で 12 時間乾燥させることによって除去されます。図 1b1、b2 は、走査型電子顕微鏡 (JSM-7200F、日本電子、日本) で画像化された繊維メッシュの形態を示しています。堆積した繊維メッシュをメスを使用して 2 ～ 3 mm の小片に切断し、次に Milli-Q 水に 1% (体積/体積) Tween 80 (P4780-100ML、Sigma-Aldrich、USA) を含むガラスバイアルに浸漬します。蛍光および磁気マイクロエージェントは、超音波処理装置 (2510、Branson、USA) を使用して 2 時間ファイバーを切断することによって得られます (図 1c1)。超音波処理を使用したポリマー粉砕プロセスにより、連続繊維がランダムに短くなり、マイクロエージェントが得られます。エレクトロスピニングのセットアップは、ランダムな配向でコレクター上にファイバーを堆積するようにも設計されています。この製造技術は、ランダムなサイズ分布を持つマイクロエージェントを使用した多色画像取得の検証を可能にするために選択されています。所望のサイズのマイクロエージェントを得るために、合成繊維をドラムコレクタで整列させ、レーザーを使用して切断することができる46。さらに、エレクトロスプレープロセスにより、サイズ分布が狭いビーズ状のマイクロエージェントを確実に製造できます。このセットアップは、何も変更せずにエレクトロスプレーに使用できます47。図 1c2 は、作製したマイクロエージェントの蛍光画像を示しています。共焦点顕微鏡（S Neox、Sensofar、スペイン）を使用して特徴付けられたマイクロエージェントの表面プロファイルを図 1c3 に示します。蛍光顕微鏡法に最適な励起および発光波長範囲を決定するために、分光蛍光光度計 (FP-8300、Jasco、日本) を使用してマイクロエージェントのスペクトルを特徴付けます。

スペクトル分析用の溶液は、2.11 mgのクマリン6を5 mlのDMFに溶解することによって調製されます。測定のために、石英キュベット (CV10Q700F、Thorlabs、USA) 内で 10 \(\upmu\)l の溶液を 690 \(\upmu\)l の DMF で希釈します。 200 ～ 900 nm の波長範囲の紫外可視励起および発光スペクトルは、2D スペクトル解析を使用して測定されます (図 1d1)。 DMF 中のクマリン 6 のピーク励起波長と発光波長は、それぞれ 461 nm と 505 nm と測定されます。 3D スペクトル解析は、さまざまな励起波長での発光スペクトルを測定するために実行されます。溶液は350 nmから500 nmの間で1 nm刻みで励起され、放出された蛍光光子は450 nmから600 nmの波長範囲で収集されます（図1d2、d3）。私たちの測定では、励起と発光がそれぞれ436〜477 nmと497〜518 nmのスペクトルバンドで実行されたときに最大強度の蛍光光子が収集されることが示されています。スペクトル分析によると、作製されたマイクロエージェントを視覚化するために、クマリン 6 を励起し、放出された蛍光光子を収集するために、450 ～ 490 nm および 500 ～ 540 nm のバンドがそれぞれ選択されます。図 1e1 は、マイクロエージェントの磁気的な動きを観察するシングルバンド蛍光顕微鏡の例を示しています。直径 200 \(\upmu\)m の HeLa 細胞スフェロイドを含む腫瘍環境内のマイクロエージェントを視覚化するために、多色顕微鏡検査が実行されます。

HeLa 細胞は、10% のウシ胎児血清 (F7524-500ML、Sigma-Aldrich、米国)、および 1% (体積/体積) を添加したダルベッコ改変イーグル培地 (11-965-092、Fisher Scientific Ltd. Canada) で培養されます。）ペニシリン-ストレプトマイシン（15-140-122、Thermo Fisher Scientific Inc.、米国）29。 2D の細胞は 80% コンフルエンスで培養および継代され、培地交換は 48 時間ごとに行われます。 3D 癌スフェロイドを形成するには、細胞をトリプシン処理し、\(2\times {10}^6\) cell/ml の密度に再懸濁し、3% (重量/体積) アガロース (16500500、超高純度) に播種します。アガロース、Invitrogen、米国）マイクロウェルアレイでは、スフェロイドあたり平均 267 個の細胞が得られます。培地の半分の交換を毎日行います。 3 日目にスフェロイドを収集し、\(10\,\upmu \hbox {M}\) CellTracker Red CMTPX (C34552、Thermo Fisher Scientific Inc.、米国) で無血清培地中で 45 分間インキュベートして染色し、洗浄します。細胞培養培地で2回。 2D 培養と 3D 培養はどちらも、37\(^\circ\)C、5% 二酸化炭素を含む加湿雰囲気中で行われます。長期保存の場合、CMTPX で染色した 3D スフェロイドを 4% ホルムアルデヒド (F8775-25ML、Sigma-Aldrich、米国) で室温で 15 分間固定し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) で 2 回洗浄します。イメージング実験の場合、開発されたマイクロ流体チップを使用してスフェロイドが固定化および維持されます（図6a）。

標準的なソフトリソグラフィー法を使用して、SU-8 フォトレジスト 48 を使用して高さ 187 \(\upmu\)m のチップのネガモールドを作製します。塩処理は、モールド表面の親水性を向上させ、ポリジメチルシロキサン（PDMS）層を除去しやすくするために行われます。脱気した 10:1 PDMS と硬化剤 (Sylgard 184 シリコンエラストマーキット、Dow Corning、米国) の混合物を型の上に注ぎ、70 \(^\circ\)C のオーブンで 12 時間硬化させます。硬化した PDMS 層を除去した後、入口ポートと出口ポートに穴を開けます。チップの製造は、プラズマ酸化を使用して顕微鏡ガラス上に PDMS 層を接着することで完了します。チップをホットプレート上で 70 \(^\circ\)C で 4 時間ベーキングすると、接合強度が向上します。まず単一細胞スフェロイドをチップに移し、気泡注入によって固定します。マイクロエージェントは培地中で 250 \(\upmu\)g/ml インドシアニングリーン (I2633-25MG、Sigma-Aldrich、USA) と混合され、その後ピペッティングによってチップに注入されます。したがって、多色画像取得用の 3D 腫瘍モデルが作成されます (図 6a3)。多色顕微鏡法が血管化モデルのマイクロエージェントのスペクトル分解画像を提供することを示すために、灌流可能な血管ネットワークがマイクロ流体チャネル上に形成される。

赤色蛍光タンパク質-ヒト臍帯静脈内皮細胞 (RFP-HUVEC) (cAP-0001、Angio-Proteomie、米国) は、内皮細胞増殖培地-2 (EGM-2 培地) (Endothelial Cell Growth Medium 2 Kit, C-22111、Promo Cell、米国）1％（体積/体積）（v/v）ペニシリン-ストレプトマイシンを含む。並行して、間葉系幹細胞 (PT-2501、ロンザ、米国) を、10% (v/v) ウシ胎児血清 (F7524v) を添加した最小必須培地イーグルアルファ改変 (22571020、サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国) 中で 2D 培養します。、Sigma-Aldrich、米国）、2 mM l-グルタミン（35050061、Thermo Fisher Scientific、米国）、0.2 mM アスコルビン酸（A8960-5G、Sigma Aldrich、米国）、1%（v/v）ペニシリン-ストレプトマイシン（15 -140-122、Thermo Fisher Scientific、米国）および 1 ng/ml 線維芽細胞成長因子塩基性（PHG0261、Thermo Fisher Scientific、米国）。どちらの細胞タイプも、5% 二酸化炭素を含む加湿雰囲気中、37 \(^{\circ }\)C で培養され、継代 4 と継代 6 の間で使用されます。細胞は 80% コンフルエントになるまで培養され、その後剥離され、混合されます。最終濃度 3 mg/ml (Fibrinogen、0215112201、MP Biomedicals、USA) および 3 Uトロンビン（0215416301、MP Biomedicals、米国）。細胞とマトリックスの混合物をマイクロ流体システムのゲルローディングポートのヒドロゲルチャンバーに注入し、37 \(^{\circ }\)C のインキュベーター内で 15 分間重合させます。以前は、プラズマ酸化結合後のマイクロ流体チップをポリ-d-リジン臭化水素酸塩（P1024-10MG、Sigma-Aldrich、米国）と4時間インキュベートすることにより、マイクロ流体の表面積が機能化され、PDMSおよびガラスとの強力なヒドロゲル相互作用が促進されます。滅菌 Milli-Q 水による洗浄ステップ。ヒドロゲル重合後、ゲルローディングポートは標準的な PCR プレートシーリングホイルのストライプでブロックされ、流体漏れを防ぎ、ヒドロゲルチャネルの隣のフローチャネルが EGM-2 媒体で満たされます。インビトロ血管新生のための機械的刺激を生み出すための５Ｐａの圧力降下は、２つのシリンジポンプ（ＡＬ－１６００、ＮｅｗＥｒａＰｕｍｐＳｙｓｔｅｍｓ、米国）を垂直方向の反対側に接続することによって確立される。インビトロ血管新生作成のためのマイクロ流体システムの概要を補足図1に示します。入口ポートはEGM-2媒体を注入するために使用され、出口ポートは最初の注入後に流体ポートがPDMSでブロックされている間にEGM-2媒体を引き出すために使用されます。充填。 COMSOL Multiphysics (バージョン 5.5、COMSOL AB、スウェーデン) を使用して実行されたフロー研究により、EGM-2 培地に所定の流量を適用することによって。圧力損失は実験前に 7 日間維持されます。マルチカラー顕微鏡では、細胞培養培地中の 250 \(\upmu\)g/ml インドシアニングリーンとマイクロエージェントがマイクロ流体システムに注入されます。図 7a1 は、操作された血管ネットワーク内のマイクロエージェントを示しています。天然の血管内の微量因子を視覚化するために、卵外ニワトリ漿尿膜をテストベッドとして使用します。

白色レグホン雛の胚は、培養プロセス全体を通じて 38 \(^\circ\)C、湿度 65% で培養されます。 10 日目に、卵の内容物を 60 mm の細胞培養ペトリ皿に割り入れます 49。卵アルブミンと卵黄の内容物は、粘性液体ハンドリングピペットを使用して除去されます。氷冷した DPBS (14190250、Thermo Fisher Scientific、米国) 溶液を使用して血管構造を 3 回洗浄し、その後 4% パラホルムアルデヒド (1004965000、Sigma-Aldrich、米国) 中で 4 \(^\circ\)C で一晩固定します。 -期間保管。続いて、DPBS中の0.3% Triton X-100 (T8787-250ML、Sigma-Aldrich、USA)と30分間インキュベートし、氷冷PBS溶液を使用して3回洗浄する。マルチカラー顕微鏡では、血管構造を最初に脱細胞化し（赤血球を除去）、続いてローダミン B（K94900-25、Labshop、オランダ）とインドシアニングリーンで染色します。

リアルタイムの広視野マルチカラー顕微鏡検査は、ラウンドロビン方式で 3 つの異なるスペクトルバンドから蛍光団を励起することによって実行されます 29。放出された蛍光光は同期して収集され、1280 \(\times\) 1024 ピクセルの 8 ビットグレースケールの個別画像が取得されます。 10 倍および 5 倍の長作動距離対物レンズ (Plan Apo、ミツトヨ、日本) を使用して、それぞれ励起光をサンプルに焦点を合わせ、放出された蛍光光子を収集します。クマリン 6 とインドシアニングリーンは、それぞれ 450 ～ 490 nm と 750 ～ 800 nm のスペクトルバンドで励起されます。放出された光は、クマリン 6 の場合は 500 ～ 540 nm、インドシアニングリーンの場合は 817.5 ～ 875.5 nm でそれぞれ収集されます。 CMTPX、RFP-HUVEC、およびローダミン B は 554.5 ～ 589.5 nm 帯域で励起され、放出された光は 592.5 ～ 667.5 nm の波長範囲で収集されます。 500〜540 nm、592.5〜667.5 nm、および817.5〜875.5 nmのスペクトルバンドから取得された個々の画像の強度値は、それぞれ黒-緑、黒-赤、黒-青のカラーマップを使用して表されます（図5a4、7b）。、8a4）。多色画像は、１周で取得した色変換された個別画像を重ね合わせることで形成される。カットオフ周波数が110 Hzの4つの鉄心電磁コイルの直交アレイが顕微鏡の作業空間に配置され、回転場を使用してマイクロエージェントを移動させます（図6d）。熱放散のため、コイルアレイはテーパーカラーを使用してアルミニウムホルダーに取り付けられています。コイルは、熱伝達の強化と電気的絶縁のために銅テープで覆われています。 DC 電源 (EA-PS 5040-20A、EA Elektro-Automatik、ドイツ) を備えた切り替え可能なアンプは、コイルに電力を供給するために使用されます50。信号発生器 (4050B、BK Precision、USA) を使用して、回転磁界周波数の基準信号を生成します。信号は、マイクロコントローラーを使用した立ち下がりエッジ検出により、デマルチプレクサーインターフェイス (74HC4052、Texas Instruments、米国) を使用して、対応するコイルドライバーに分配されます。コイルアレイによって生成される最大磁場は、テスラメータ (3MH3A、Senis AG、スイス) を使用して 30 mT と測定されます。磁気吸引力は、2 つのネオジム鉄ボロン永久磁石 (S-45-30-N、Supermagnete、ドイツ) を使用して生成されます。磁石によって生成される最大磁場と勾配は、それぞれ 120 mT と 5 T/m と測定されます。

オランダの動物管理ガイドラインによると、孵化が予想されない限り、ニワトリの胚実験に対する IACUC の承認は必要ありません。さらに、発生EDD14以降のニワトリ胚を用いた実験のみIACUCの承認が必要です。この研究で使用された胚はすべて、胚発生の初期段階（EDD10）にありました。この研究で使用された鶏の受精卵は、オランダの承認された養鶏鶏卵農場から購入されました。 RFP-HUVEC の培養研究はオランダ省によって承認され、実験は大学の方針と標準プロトコルに従って ML-1 実験室環境下で実施されました。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。

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著者らは、マイクロ流体チップの初期設計アイデアを紹介してくれた Pelin Kubra Isgor に感謝したいと思います。また、Efe Bulut氏、Wouter Abbas氏、Edwin Morsink氏、Nick Helthuis氏、Erik G. de Vries氏、Michiel Richter氏、Vasileios Trikalitis氏、Juan Sevilla氏の技術支援と実りある議論に感謝いたします。この研究は、欧州連合のHorizon 2020研究革新プログラム、助成金638428プロジェクト「ROBOTAR: 磁性剤の標的送達のためのロボット支援フレキシブルニードルステアリング」の下で、欧州研究評議会によって支援されました。

外科ロボット研究所、生物機械工学部、トゥウェンテ大学、7522 NB、エンスヘーデ、オランダ

マート・カヤ、イスラムSMカリル、サルタク・ミスラ

外科ロボット研究所、生体医工学部およびフローニンゲン大学医療センター、フローニンゲン大学、9713 AV、フローニンゲン、オランダ

マート・カヤ、ジェンヤ・チャン、サルタック・ミスラ

血管新生研究室、生物機械工学部、トゥウェンテ大学、7522 NB、エンスヘーデ、オランダ

ファビアン・スタイン、プラサンナ・パドマナバン、ジェルーン・ロウケマ

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MK は多色蛍光顕微鏡を開発し、エレクトロスピニング装置を設計し、マイクロエージェントを製造しました。 MK と ZZ は、エレクトロスピニングのセットアップで機械コンポーネントを設計しました。 MK と FS はマイクロ流体チップを修正して作製しました。 FS は HeLa 細胞スフェロイドを形成し、マイクロ流体システム上で in vitro 血管ネットワークを操作しました。 PP はニワトリ胚をインキュベートし、卵外漿尿膜サンプルを調製しました。 MK、FS、PP は実験を実施し、原稿を作成しました。 ISMK、JR、SM は科学的なフィードバックを提供しました。著者全員が原稿をレビューしました。

マート・カヤへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

補足３．

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転載と許可

Kaya、M.、Stein、F.、Padmanaban、P. 他リアルタイム多色蛍光顕微鏡によるマイクロエージェントとその周囲の視覚化。 Sci Rep 12、13375 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-17297-7

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受信日: 2022 年 4 月 22 日

受理日: 2022 年 7 月 22 日

公開日: 2022 年 8 月 4 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17297-7

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